نموذج السموم الداخلية الموجه نحو وحدة العناية المركزة القابلة للتكرار في الفئران

Summary

هنا ، نقدم نموذجا للسموم الداخلية الموجهة نحو وحدة العناية المركزة القابلة للتكرار في الفئران.

Abstract

ولا يزال الإنتان والصدمة الإنتانية السبب الرئيسي للوفاة في وحدات العناية المركزة. على الرغم من التحسينات الكبيرة في إدارة الإنتان ، لا تزال الوفيات تتراوح بين 20 و 30٪. هناك حاجة ماسة إلى نهج علاجية جديدة من أجل الحد من فشل الأعضاء المتعددة المرتبطة بالإنتان والوفاة. تسمح النماذج الحيوانية القوية بنهج علاج واحد أو عدة طرق بالإضافة إلى اختبار تأثيرها على المعلمات الفسيولوجية والجزيئية. في هذه المقالة ، يتم تقديم نموذج حيواني بسيط.

أولا ، يتم تحفيز التخدير العام في الحيوانات إما باستخدام التخدير المتطاير أو عن طريق التخدير داخل الصفاق. بعد وضع قسطرة في الوريد (الوريد الذيل) ، وفغر القصبة الهوائية ، وإدخال قسطرة داخل الشرايين (شريان الذيل) ، تبدأ التهوية الميكانيكية. يتم تسجيل القيم الأساسية لمتوسط ضغط الدم الشرياني وتشبع الأكسجين في الدم الشرياني ومعدل ضربات القلب.

إن حقن عديدات السكاريد الشحمية (1 ملليغرام / كيلوغرام من وزن الجسم) المذاب في محلول ملحي مخزن بالفوسفات يحفز استجابة التهابية قوية وقابلة للتكرار عبر المستقبل الشبيه بالرسوم 4. يتم إجراء تصحيحات السوائل وكذلك تطبيق النورادرينالين على أساس بروتوكولات راسخة.

النموذج الحيواني المقدم في هذه المقالة سهل التعلم وموجه بقوة نحو علاج الإنتان السريري في وحدة العناية المركزة مع التخدير والتهوية الميكانيكية والمراقبة المستمرة لضغط الدم وأخذ عينات الدم المتكررة. أيضا ، النموذج موثوق به ، مما يسمح ببيانات قابلة للتكرار مع عدد محدود من الحيوانات وفقا لمبادئ 3R (تقليل ، استبدال ، صقل) للبحوث الحيوانية. في حين أن التجارب على الحيوانات في أبحاث الإنتان لا يمكن استبدالها بسهولة ، فإن القياسات المتكررة تسمح بتقليل الحيوانات والحفاظ على تخدير الحيوانات الإنتانية يقلل من المعاناة.

Introduction

الإنتان وشكله الأكثر حدة ، الصدمة الإنتانية ، هي متلازمات على أرض العدوى ، مما يؤدي إلى تفاعل التهابي مفرط مع إطلاق السيتوكينات ، مما يؤدي إلى تغيرات فسيولوجية وكيميائية حيوية مع دفاع مناعي مكبوت ونتائج قاتلة ^1,2. هذا التفاعل الالتهابي غير المتوازن يؤدي إلى خلل وظيفي في الأعضاء وفشل الأعضاء في مختلف الأعضاء الحيوية مثل الرئة والكلى والكبد. مع 37٪ ³ ، يعد الإنتان أحد الأسباب الأكثر شيوعا لدخول المريض إلى وحدة العناية المركزة (ICU). يتراوح معدل وفيات الإنتان حاليا حوالي 20-30٪ ⁴. العلاج المبكر والفعال بالمضادات الحيوية له أهمية قصوى⁵. يجب تثبيت إنعاش السوائل وضاغط الأوعية في وقت مبكر ، بخلاف ذلك ، فإن العلاج داعم تماما⁶.

يعرف الإنتان بأنه عدوى مثبتة أو مشتبه بها بالبكتيريا أو الفطريات أو الفيروسات أو الطفيليات ، والتي يصاحبها خلل وظيفي في الأعضاء. يتم استيفاء معايير الصدمة الإنتانية عندما يكون هناك انهيار آخر للقلب والأوعية الدموية لا يستجيب لعلاج السوائل وحده ، ويكون مستوى اللاكتات أكثر من 2 ملليمول / لتر موجودا². قد يحدث فشل الأعضاء المرتبط بالإنتان في أي عضو ، ولكنه شائع جدا في نظام القلب والأوعية الدموية والدماغ والكلى والكبد والرئة. يحتاج معظم المرضى الذين يعانون من الإنتان إلى التنبيب داخل القصبة الهوائية لتأمين مجرى الهواء للمريض ، والحماية من الطموح ، وتطبيق التهوية الزفيرية النهائية الإيجابية مع جزء كبير من الأكسجين الملهم لمنع نقص الأكسجة أو التغلب عليه. من أجل تحمل أنبوب القصبة الهوائية والتهوية الميكانيكية ، يحتاج المرضى عادة إلى التخدير.

السموم الداخلية ، مثل عديدات السكاريد الشحمية (LPS) كمكون من غشاء البكتيريا سالبة الجرام تحفز تفاعلا التهابيا قويا عبر المستقبل الشبيه بالحصيلة (TLR) 4⁷. يضمن تنشيط مسار محدد تفاعلا التهابيا مستقرا. تعرف السيتوكينات مثل البروتين الجاذب الكيميائي المستحث بالسيتوكين 1 (CINC-1) ، والبروتين الجاذب الكيميائي أحادي الخلية 1 (MCP-1) ، والإنترلوكين 6 (IL-6) كعوامل تنبؤية للشدة والنتيجة في هذا النموذج⁸. تم استخدام تطبيق LPS عن طريق الوريد بنجاح لدراسة جوانب مختلفة من الإنتان في الفئران ^8,9.

لا يزال علاج الإنتان يمثل تحديا، خاصة بسبب عدم وجود نماذج حيوانية تنبؤية. إذا كان تسمم الدم الداخلي مع تنشيط الالتهاب الجهازي هو نموذج مناسب لتطوير العلاجات الدوائية أمر قابل للنقاش. ومع ذلك ، مع مسار TLR 4 المعروف الناجم عن LPS ، يمكن اكتساب معرفة مهمة.

Protocol

تمت الموافقة على جميع التجارب المقدمة في هذا البروتوكول من قبل السلطات البيطرية في كانتون زيورخ ، سويسرا (أرقام الموافقة 134/2014 و ZH088/19). وعلاوة على ذلك، كانت جميع الخطوات التي أجريت في هذه التجربة وفقا للمبادئ التوجيهية بشأن التجارب على الحيوانات التي وضعتها الأكاديمية السويسرية للعلوم الطبية (SAMS) والمبادئ التوجيهية لاتحاد الجمعيات الأوروبية لعلوم المختبرات (FELASA).

1. تحريض التخدير ومراقبة الحيوان

1. احتفظ بذكور فئران Wistar بوزن 250-300 جرام (جم) في أقفاص جيدة التهوية في ظل ظروف خالية من مسببات الأمراض. توفير دورة ضوئية / مظلمة لمدة 12-12 ساعة عند درجة حرارة محيطة تبلغ 22 ± 1 درجة مئوية ، وحرية الوصول إلى الطعام والماء.
2. حث التخدير العام إما عن طريق الحث المتطاير مع الأيزوفلوران (تركيز 3-5 ٪) في مربع تحريض التخدير لمدة 30 ثانية (الشكل 1A) أو بدلا من ذلك ، حث التخدير مع حقن طلقة واحدة من الكيتامين / الزيلازين (10/1 ملليغرام (ملغ) لكل 100 غرام من وزن الجسم).
3. انقل الحيوان إلى مكان عمل وضع الحيوان على حصيرة تسخين طوال التجربة بأكملها. حافظ على درجة حرارة الجسم بين 36.5 و 37 درجة مئوية.
4. استخدم مخروط الأنف لتوفير الأكسجين (600 مل / دقيقة). أضف الأيسوفلوران 2-3٪ إذا تم اختيار التخدير المتطاير لصيانة التخدير. تأكد من أن الحيوان يتنفس تلقائيا.
5. تأكد من مستوى التخدير من خلال عدم وجود منعكس قرصة إصبع القدم قبل تركيب فغر القصبة الهوائية والقسطرة الشريانية والوريدية.
6. تحقق من وجود كمية كافية من الأوكسجين عن طريق مراقبة تشبع الأكسجين المحيطي (تشبع الأكسجين الطبيعي 98 - 100٪).
7. استخدم مرهما (مرهم فيتامين أ) لحماية العينين.
8. قم بإعداد أدوات جراحية معقمة وقسطرة على طاولة جانبية كما هو موضح في الشكل 1B.
9. بالإضافة إلى ذلك ، قم بإعداد مراقبة تشبع الضغط والأكسجين كما هو موضح في الشكل 1C.

2. الوصول عن طريق الوريد

1. ضع عاصبة في ذيل الفئران القريب لتسهيل الوصول الوريدي (الشكل 2A).
2. تطهير الذيل 3 مرات مع الكحول.
3. حث قسطرة G26 عن طريق الوريد في أحد عروق الذيل الجانبية.
   ملاحظة: من تجربتنا ، من الأسهل وضع الوصول عن طريق الوريد في الجزء البعيد من ذيل الفئران ، لأن الوريد هنا يقع بالقرب من الجلد. بالإضافة إلى ذلك ، في حالة فشل القنية ، هناك مساحة كافية للتحرك عن قرب.
4. تجنب بدقة حقن الهواء.
5. فك العاصبة بعد وضع القسطرة الوريدية.
6. ثبت القسطرة الوريدية في مكانها بشريط لاصق (الشكل 2B).
7. قم بتوصيل مضخات المحاقن بالوصول عن طريق الوريد للتطبيق المستمر للسوائل والأدوية.
8. استخدم أجهزة التوقف ثلاثية الاتجاهات لسائل البلعة وتطبيق الأدوية وأخذ عينات الدم الوريدية.

3. فغر القصبة الهوائية

1. حلق منطقة الرقبة الأمامية للحيوان.
2. تطهير الجلد الحليق 3 مرات بمحلول اليود الفعال.
3. قم بإجراء شق طولي يبلغ طوله حوالي 2 سم باستخدام مشرط (مع شفرة رقم 10).
4. سحب الجلد مع 2-0 خيوط الحرير.
5. قم بإعداد الحنجرة والقصبة الهوائية بصراحة باستخدام مقص جراحي (الشكل 3A).
6. تأكد من فتح القصبة الهوائية بمقص جراحي دقيق في مشبك القصبة^{الهوائية} 3-5.
7. أدخل قنية قصبة هوائية معقمة في القصبة الهوائية. كن حذرا ، لا تدخل القنية بعمق شديد لتجنب التهوية من جانب واحد.
8. إصلاح القنية في مكانها باستخدام خياطة الحرير 2-0.
9. قم بتوصيل القنية بجهاز تهوية للضغط أو التهوية التي يتم التحكم في حجمها (الشكل 3B).

4. الوصول الشرياني

1. تطهير ذيل الفئران 3 مرات بمحلول البوفيدون اليود.
2. قطع الجلد باستخدام مشرط (مع شفرة رقم 10) حوالي 1 سم طوليا في الجانب البطني.
3. توخي الحذر ، لا تقطع بعمق لتجنب إصابة شريان الذيل.
4. استخدم المجهر الجراحي لكشف الشريان بعناية. قطع اللفافة المحيطة بالشريان باستخدام مقص جراحي مجهري.
5. قم بربط الجزء البعيد من الشريان باستخدام خياطة حريرية 6-0.
6. قم بإعداد خياطة حريرية قريبة 6-0 ولكن لا تشد الحرير (الشكل 4A).
7. أدخل قسطرة G-26 في الشريان بين خياطة الحرير البعيدة والقريبة.
8. بمجرد أن تكون القسطرة في الشريان ، قم بتشديد خياطة الحرير القريبة وثبت القسطرة في مكانها (الشكل 4B).
9. قم بتوصيل القسطرة بمحول ضغط لتوفير قياس مستمر للضغط الشرياني (متوسط الضغط الشرياني الطبيعي: 60 - 100 مم زئبق) (الشكل 4C).
10. بالإضافة إلى ذلك ، ضع سدادة ثلاثية الاتجاهات بين القسطرة المتصلة بمحول الضغط وقسطرة G-26 لأخذ عينات الدم الشرياني.

5. قياس خط الأساس ، تحريض الإنتان وقياسات المتابعة

1. بعد أن وصل الحيوان إلى حالة ثابتة ، حقن LPS.
2. جمع عينات الدم عند الوصول إلى حالة مستقرة (عادة بعد 15-30 دقيقة).
3. استبدل فقدان السوائل من عينات الدم بمحلول رينجر بنسبة 1:4.
4. للحث على الإنتان ، حقن LPS كبلعة أو كتطبيق LPS مستمر.
5. لتطبيق البلعة ، حقن 1 ملغ من LPS / كيلوغرام من وزن الجسم (كجم) المذاب في محلول ملحي مخزن بالفوسفات (PBS) بتركيز 1 ملغ / مل.
6. للتطبيق المستمر ، حقن 300 ميكروغرام من LPS / kg / hour طوال التجربة بأكملها باستخدام مضخة حقنة (محلول مخزون LPS: 1 mg / mL في PBS).
7. تجنب حقن الهواء في جميع الأوقات من أجل منع انسداد الهواء.
8. حدد بروتوكولات استبدال السوائل، وبروتوكولات تطبيق مضيق للأوعية، ومعايير الإجهاض (على سبيل المثال انخفاض ضغط الدم الذي يعرف بأنه متوسط ضغط الدم الشرياني أقل من 50 مم زئبق لأكثر من 30 دقيقة على الرغم من استبدال السوائل) قبل إعداد التجربة.
   ملاحظة: نقترح ضخ مستمر لمحلول رينجر بمعدل 10 مل / كجم / ساعة.
9. اطرح أي إدارة مستمرة للسوائل (على سبيل المثال ، لتطبيق LPS المستمر) من الكمية التي تم غرسها بحيث تكون النتائج قابلة للمقارنة مع نتائج المجموعات الضابطة.
   ملاحظة: في نهاية التجربة ، وقبل حصاد أي أعضاء مثل الكبد أو الكلى أو الطحال لمزيد من التحليلات مثل الفحص النسيجي أو الكيميائي الحيوي ، يمكن قتل الحيوانات عن طريق شق في الوريد الأجوف السفلي. الطريقة الموصى بها للقتل الرحيم هي إحضار الحيوانات إلى مستوى جراحي للتخدير قبل شق الوريد الأجوف السفلي وحقن المياه المالحة الباردة في القلب الأيسر ، خاصة إذا كان سيتم تقييم علامات الالتهاب في الأعضاء. ضمان الامتثال للمتطلبات القانونية والمبادئ التوجيهية المحلية. للتحقق من فشل الأعضاء المرتبطة بالإنتان ، يمكن تحليل علامة مؤيدة لموت الخلايا المبرمج مثل caspase-3 بالإضافة إلى α1-microglobuline للتحقق من الضرر الأنبوبي في الكلى. قد يوفر التحليل الخاص بالعضو للعلامات مثل CINC-1 و MCP-1 و IL-6 أيضا معلومات حول الاستجابة الالتهابية الخاصة بالعضو.

النتائج

يسمح النظام المقدم بتسمم الدم الداخلي مع الحيوانات المستقرة ديناميكيا كما ذكر سابقا⁹. في حين أن متوسط الضغط الشرياني لا يزال مستقرا في الحيوانات التي لديها ، وبدون تحفيز LPS ، فإن الحيوانات المعالجة LPS تطور خصائص الإنتان مثل فائض القاعدة السلبي والتفاعل الالتهابي القوي الذي يق...

Discussion

يسمح البروتوكول الموصوف هنا بنموذج إنتان قابل للتكرار للغاية ، ولكنه بسيط لتعلم الإنتان ، والذي يمكن تكييفه وفقا لسؤال البحث. يمكن جمع البيانات الأساسية في الجسم الحي التي تشير إلى وظائف الأعضاء مثل معدل ضربات القلب وضغط الدم وتشبع الأكسجين الشرياني المحيطي بشكل مستمر ، ويمكن إجراء أخذ ع...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
2-0 silk sutures	Ethicon, Sommerville, NJ	K833	Standard surgical
26 intravenous catheter	Becton Dickinson, Franklin Lakes, NJ	391349	Standard anesthesia equipment
6-0 LOOK black braided silk	Surgical Specalities Corporation, Wyomissing, PA	SP114	Standard surgical
Alaris Syringe Pump	Bencton Dickinson
Betadine	Mundipharma, Basel, Switzerland	7.68034E+12	GTIN-number
Curved fine tips microforceps	World precision instruments (WPI), Sarasota, FL	504513	Facilitates vascular preparation
Fine tips microforceps	World precision instruments (WPI), Sarasota, FL	501976	Tips need to be polished regularly
Infinity Delta XL Anesthesia monitoring	Draeger, Lübeck, Germany
Isoflurane, 250 mL bottles	Attane, Piramal, Mumbai, India	LDNI 22098	Standard vet. equipment
Ketamine (Ketalar)	Pfitzer, New York, NY
Lipopolysaccharide (LPS) from Escherichia coli, serotype 055:B5	Sigma, Buchs, Switzerland
Q-tips small	Carl Roth GmbH, Karlsruhe, Germany	EH11.1	Standard surgical
Ringerfundin	Bbraun, Melsungen, Germany
Tec-3 Isofluorane Vaporizer	Ohmeda, GE-Healthcare, Chicago, IL	not available anymore	Standard vet. equipment
Xylazine (Xylazin Streuli)	Streuli AG, Uznach, Switzerland