Ein reproduzierbares intensivstationsorientiertes Endotoxinmodell bei Ratten

Zusammenfassung

Hier stellen wir ein reproduzierbares intensivstationsorientiertes Endotoxinmodell an Ratten vor.

Zusammenfassung

Sepsis und septischer Schock sind nach wie vor die häufigste Todesursache auf Intensivstationen. Trotz signifikanter Verbesserungen im Sepsis-Management liegt die Mortalität immer noch zwischen 20 und 30%. Neuartige Behandlungsansätze, um Sepsis-bedingtes Multiorganversagen und -tod zu reduzieren, werden dringend benötigt. Robuste Tiermodelle ermöglichen einen oder mehrere Behandlungsansätze sowie die Prüfung ihrer Wirkung auf physiologische und molekulare Parameter. In diesem Artikel wird ein einfaches Tiermodell vorgestellt.

Erstens wird die Vollnarkose bei Tieren entweder unter Verwendung von flüchtiger oder durch intraperitoneale Anästhesie induziert. Nach dem Einsetzen eines intravenösen Katheters (Schwanzvene), der Tracheostomie und dem Einsetzen eines intraarteriellen Katheters (Schwanzarterie) wird mit der mechanischen Beatmung begonnen. Ausgangswerte des mittleren arteriellen Blutdrucks, der arteriellen Blutsauerstoffsättigung und der Herzfrequenz werden aufgezeichnet.

Die Injektion von Lipopolysacchariden (1 Milligramm/Kilogramm Körpergewicht), gelöst in phosphatgepufferter Kochsalzlösung, induziert eine starke und reproduzierbare Entzündungsreaktion über den toll-like Rezeptor 4. Flüssigkeitskorrekturen sowie die Anwendung von Noradrenalin werden auf der Grundlage etablierter Protokolle durchgeführt.

Das in diesem Artikel vorgestellte Tiermodell ist leicht erlernbar und stark auf die klinische Sepsisbehandlung auf einer Intensivstation mit Sedierung, mechanischer Beatmung, kontinuierlicher Blutdrucküberwachung und wiederholter Blutentnahme ausgerichtet. Außerdem ist das Modell zuverlässig und ermöglicht reproduzierbare Daten mit einer begrenzten Anzahl von Tieren gemäß den 3R-Prinzipien (Reduce, Replace, Refine) von Tierversuchen. Während Tierversuche in der Sepsisforschung nicht leicht ersetzt werden können, ermöglichen wiederholte Messungen eine Verringerung der Tiere und die Anästhesie von septischen Tieren verringert das Leiden.

Einleitung

Sepsis und ihre schwerere Form, der septische Schock, sind Syndrome auf der Grundlage einer Infektion, die zu einer überschießenden Entzündungsreaktion mit der Freisetzung von Zytokinen führen, was zu physiologischen und biochemischen Veränderungen mit einer unterdrückten Immunabwehr und tödlichen Ergebnissen führt ^1,2. Diese unausgewogene Entzündungsreaktion führt zu Organfunktionsstörungen und Organversagen in verschiedenen lebenswichtigen Organen wie Lunge, Niere und Leber. Mit 37%³ ist Sepsis einer der häufigsten Gründe für die Aufnahme eines Patienten auf eine Intensivstation (ICU). Die Mortalität der Sepsis liegt derzeit bei etwa 20-30%^4. Eine frühzeitige und wirksame Behandlung mit Antibiotika ist von größter Bedeutung⁵. Die Wiederbelebung von Flüssigkeit und Vasopressor muss frühzeitig installiert werden, ansonsten ist die Behandlung rein unterstützend⁶.

Sepsis ist definiert als eine nachgewiesene oder vermutete Infektion mit Bakterien, Pilzen, Viren oder Parasiten, die von Organfunktionsstörungen begleitet wird. Die septischen Schockkriterien sind erfüllt, wenn ein weiterer kardiovaskulärer Kollaps nicht allein auf die Flüssigkeitsbehandlung anspricht und ein Laktatspiegel von mehr als 2 Millimol / Liter vorliegt². Sepsis-bedingtes Organversagen kann in jedem Organ auftreten, ist aber im Herz-Kreislauf-System, im Gehirn, in der Niere, in der Leber und in der Lunge sehr häufig. Die meisten Patienten, die an Sepsis leiden, benötigen eine endotracheale Intubation, um die Atemwege des Patienten zu sichern, vor Aspiration zu schützen und eine positive exspiratorische Endbeatmung mit einem hohen Anteil an inspiriertem Sauerstoff anzuwenden, um Hypoxie zu verhindern oder zu überwinden. Um einen Trachealtubus und eine mechanische Beatmung zu vertragen, benötigen die Patienten in der Regel eine Sedierung.

Endotoxine, wie Lipopolysaccharide (LPS) als Bestandteil der Membran gramnegativer Bakterien induzieren über den Toll-like-Rezeptor (TLR) 4⁷ eine starke Entzündungsreaktion. Die Aktivierung eines definierten Signalweges sorgt für eine stabile Entzündungsreaktion. Zytokine wie das durch Zytokin induzierte neutrophile Chemoattraktanzprotein 1 (CINC-1), das Monozyten-Chemoattractant-Protein 1 (MCP-1) und Interleukin 6 (IL-6) sind in diesem Modell⁸ als prognostische Faktoren für Schweregrad und Ergebnis bekannt. Die intravenöse LPS-Anwendung wurde erfolgreich zur Untersuchung verschiedener Aspekte der Sepsis bei Ratten^{eingesetzt 8,9}.

Die Behandlung von Sepsis ist nach wie vor eine Herausforderung, insbesondere aufgrund des Mangels an prädiktiven Tiermodellen. Ob Endotoxämie mit Aktivierung einer systemischen Entzündung ein adäquates Modell für die Entwicklung pharmakologischer Therapien ist, ist fraglich. Mit dem bekannten LPS-induzierten TLR4-Signalweg können jedoch wichtige Erkenntnisse gewonnen werden.

Protokoll

Alle in diesem Protokoll vorgestellten Experimente wurden von den Veterinärbehörden des Kantons Zürich, Schweiz, genehmigt (Zulassungsnummern 134/2014 und ZH088/19). Darüber hinaus entsprachen alle Schritte in diesem Experiment den Richtlinien für Tierversuche der Schweizerischen Akademie der Mittleren Wissenschaften (SAMW) und den Richtlinien der Federation of European Laboratory Animal Science Associations (FELASA).

1. Anästhesieinduktion und Tierüberwachung

1. Halten Sie männliche Wistar-Ratten mit einem Gewicht von 250-300 Gramm (g) in belüfteten Käfigen unter pathogenfreien Bedingungen. Sorgen Sie für einen 12-12-stündigen Hell-Dunkel-Zyklus bei einer Umgebungstemperatur von 22 ± 1 ° C und freien Zugang zu Nahrung und Wasser.
2. Induzieren Sie eine Vollnarkose entweder durch flüchtige Induktion mit Isofluran (Konzentration von 3-5%) in einer Anästhesie-Induktionsbox für 30 Sekunden (Abbildung 1A) oder induzieren Sie alternativ eine Anästhesie mit einer Single-Shot-Injektion von Ketamin / Xylazin (10/1 Milligramm (mg) pro 100 g Körpergewicht).
3. Bringen Sie das Tier an einen Arbeitsplatz und legen Sie es während des gesamten Experiments auf eine Heizmatte. Halten Sie die Körpertemperatur zwischen 36,5 und 37 °C.
4. Verwenden Sie einen Nasenkonus, um Sauerstoff (600 ml / Minute) bereitzustellen. Fügen Sie Isofluran 2-3% hinzu, wenn eine flüchtige Anästhesie für die Aufrechterhaltung der Anästhesie gewählt wurde. Stellen Sie sicher, dass das Tier spontan atmet.
5. Bestätigen Sie den Grad der Anästhesie durch das Fehlen des Zehen-Quetsch-Reflexes vor der Installation von Tracheostomie und arteriellen und venösen Kathetern.
6. Nachweis einer ausreichenden Oxygenierung durch periphere Sauerstoffsättigungsüberwachung (normale Sauerstoffsättigung 98 - 100%).
7. Verwenden Sie eine Salbe (Vitamin-A-Salbe), um die Augen zu schützen.
8. Bereiten Sie sterile chirurgische Instrumente und Katheter auf einem Beistelltisch vor, wie in Abbildung 1B dargestellt.
9. Bereiten Sie zusätzlich die Druck- und Sauerstoffsättigungsüberwachung vor, wie in Abbildung 1C dargestellt.

2. Intravenöser Zugang

1. Tragen Sie ein Tourniquet auf den proximalen Schwanz der Ratte auf, um den venösen Zugang zu erleichtern (Abbildung 2A).
2. Desinfizieren Sie den Schwanz 3 Mal mit Alkohol.
3. Induzieren Sie einen intravenösen G26-Katheter in eine der beiden lateralen Heckvenen.
   HINWEIS: Aus unserer Erfahrung ist es einfacher, den intravenösen Zugang am distalen Teil des Schwanzes der Ratte zu platzieren, da sich die Vene hier näher an der Haut befindet. Darüber hinaus ist im Falle einer fehlgeschlagenen Kanülierung genügend Platz vorhanden, um sich in der Nähe zu bewegen.
4. Vermeiden Sie strikt die Lufteinspritzung.
5. Lösen Sie das Tourniquet nach dem Einsetzen des intravenösen Katheters.
6. Befestigen Sie den intravenösen Katheter mit Klebeband (Abbildung 2B).
7. Schließen Sie Spritzenpumpen an den intravenösen Zugang für kontinuierliche Flüssigkeits- und Arzneimittelanwendungen an.
8. Verwenden Sie 3-Wege-Absperrhähne für Bolusflüssigkeit, Arzneimittelanwendung und venöse Blutentnahme.

3. Tracheostomie

1. Rasieren Sie den vorderen Halsbereich des Tieres.
2. Desinfizieren Sie die rasierte Haut 3 Mal mit Providon-Jod-Lösung.
3. Führen Sie einen ca. 2 cm langen Längseinschnitt mit einem Skalpell (mit einer Klinge Nummer 10) durch.
4. Ziehen Sie die Haut mit 2-0 Seidennähten zurück.
5. Bereiten Sie den Kehlkopf und die Luftröhre stumpf mit einer chirurgischen Schere vor (Abbildung 3A).
6. Achten Sie darauf, die Luftröhre mit einer chirurgischen Mikroschere am 3-5^{Trachealverschluss} zu öffnen.
7. Führen Sie eine sterile Trachealkanüle in die Luftröhre ein. Seien Sie vorsichtig, setzen Sie die Kanüle nicht zu tief ein, um eine einseitige Belüftung zu vermeiden.
8. Befestigen Sie die Kanüle mit einer 2-0-Seidennaht.
9. Schließen Sie die Kanüle an ein Beatmungsgerät an, um eine druck- oder volumengesteuerte Beatmung zu ermöglichen (Abbildung 3B).

4. Arterialer Zugang

1. Desinfizieren Sie den Rattenschwanz 3 Mal mit Povidon-Jod-Lösung.
2. Schneiden Sie die Haut mit einem Skalpell (mit einer Klinge Nummer 10) ca. 1 cm Längs an der Bauchseite.
3. Seien Sie vorsichtig, schneiden Sie nicht zu tief ein, um eine Verletzung der Schwanzarterie zu vermeiden.
4. Verwenden Sie ein Operationsmikroskop, um die Arterie vorsichtig freizulegen. Schneiden Sie die Faszie, die die Arterie umgibt, mit einer chirurgischen Mikroschere ab.
5. Ligatieren Sie den distalen Teil der Arterie mit einer 6-0 Seidennaht.
6. Bereiten Sie eine proximale 6:0-Seidennaht vor, ziehen Sie die Seide jedoch nicht an (Abbildung 4A).
7. Führen Sie einen G-26-Katheter in die Arterie zwischen der distalen und proximalen Seidennaht ein.
8. Sobald sich der Katheter in der Arterie befindet, ziehen Sie die proximale Seidennaht fest und fixieren Sie den Katheter an Ort und Stelle (Abbildung 4B).
9. Schließen Sie den Katheter an einen Druckmessumformer an, um eine kontinuierliche arterielle Druckmessung (normaler mittlerer arterieller Druck: 60 - 100 mmHg) zu ermöglichen (Abbildung 4C).
10. Platzieren Sie außerdem einen 3-Wege-Absperrhahn zwischen dem Katheter, der mit dem Druckmessumformer verbunden ist, und dem G-26-Katheter für die arterielle Blutentnahme.

5. Baseline-Messung, Sepsis-Induktion und Folgemessungen

1. Nachdem das Tier einen stabilen Zustand erreicht hat, injizieren Sie das LPS.
2. Sammeln Sie Blutproben, wenn ein stabiler Zustand erreicht ist (normalerweise nach 15-30 Minuten).
3. Ersetzen Sie den Flüssigkeitsverlust aus Blutproben durch Ringers Lösung im Verhältnis 1:4.
4. Um eine Sepsis zu induzieren, injizieren Sie das LPS als Bolus oder als kontinuierliche LPS-Anwendung.
5. Für die Bolusanwendung 1 mg LPS/Kilogramm Körpergewicht (kg), gelöst in phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS), in einer Konzentration von 1 mg/ml injizieren.
6. Für eine kontinuierliche Anwendung injizieren Sie 300 μg LPS/kg/Stunde während des gesamten Experiments mit einer Spritzenpumpe (Stammlösung von LPS: 1 mg/ml in PBS).
7. Vermeiden Sie jederzeit eine Luftinjektion, um Luftembolien zu vermeiden.
8. Definieren Sie Flüssigkeitsersatzprotokolle, vasokonstriktorische Anwendungsprotokolle und Abtreibungskriterien (z. B. Hypotonie, definiert als mittlerer arterieller Blutdruck unter 50 mmHg für mehr als 30 Minuten trotz Flüssigkeitsersatz), bevor Sie das Experiment einrichten.
   HINWEIS: Wir empfehlen eine kontinuierliche Infusion von Ringer-Lösung mit einer Rate von 10 ml / kg / Stunde.
9. Subtrahieren Sie jede kontinuierliche Verabreichung von Flüssigkeiten (z. B. für die kontinuierliche LPS-Anwendung) von der infundierten Menge, so dass die Ergebnisse mit denen der Kontrollgruppen vergleichbar sind.
   HINWEIS: Am Ende des Experiments und vor der Entnahme von Organen wie Leber, Niere oder Milz für weitere Analysen wie histologische oder biochemische Untersuchungen können Tiere durch einen Schnitt der Vena cava inferior eingeschläfert werden. Die empfohlene Methode der Euthanasie besteht darin, die Tiere vor dem Einschnitt der Hohlvene inferior und der Injektion von eiskalter Kochsalzlösung in das linke Herz in eine chirurgische Anästhesieebene zu bringen, insbesondere wenn Entzündungsmarker in Organen beurteilt werden sollen. Stellen Sie sicher, dass Sie die gesetzlichen Anforderungen und lokalen Richtlinien einhalten. Um Sepsis-bedingtes Organversagen zu überprüfen, können Pro-Apoptose-Marker wie Caspase-3 sowie α1-Mikroglobulin analysiert werden, um tubuläre Schäden in den Nieren zu überprüfen. Die organspezifische Analyse von Markern wie CINC-1, MCP-1 und IL-6 kann auch Informationen über die organspezifische Entzündungsreaktion liefern.

Ergebnisse

Das vorgestellte System ermöglicht Endotoxämie bei hämodynamisch stabilen Tieren, wie bereits berichtet⁹. Während der mittlere arterielle Druck bei Tieren mit und ohne LPS-Stimulation stabil bleibt, entwickeln LPS-behandelte Tiere Merkmale einer Sepsis wie einen negativen Basenüberschuss und eine starke Entzündungsreaktion, gemessen an Plasmazytokinen (6 Stunden nach der Anwendung) wie CINC-1 (867 ng/ml), MCP-1 (5027 ng/ml) und IL-6 (867 ng/ml)⁸,

Diskussion

Das hier beschriebene Protokoll ermöglicht ein hochgradig reproduzierbares, aber dennoch einfach zu erlernendes Sepsis-Modell, das entsprechend der Forschungsfrage angepasst werden kann. Wesentliche In-vivo-Daten, die sich auf die Organfunktion wie Herzfrequenz, Blutdruck und periphere arterielle Sauerstoffsättigung beziehen, können kontinuierlich gesammelt werden, und die Blutentnahme kann während des gesamten Experiments wiederholt durchgeführt werden. Darüber hinaus können Modifikationen in Bezug auf Flüssigke...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
2-0 silk sutures	Ethicon, Sommerville, NJ	K833	Standard surgical
26 intravenous catheter	Becton Dickinson, Franklin Lakes, NJ	391349	Standard anesthesia equipment
6-0 LOOK black braided silk	Surgical Specalities Corporation, Wyomissing, PA	SP114	Standard surgical
Alaris Syringe Pump	Bencton Dickinson
Betadine	Mundipharma, Basel, Switzerland	7.68034E+12	GTIN-number
Curved fine tips microforceps	World precision instruments (WPI), Sarasota, FL	504513	Facilitates vascular preparation
Fine tips microforceps	World precision instruments (WPI), Sarasota, FL	501976	Tips need to be polished regularly
Infinity Delta XL Anesthesia monitoring	Draeger, Lübeck, Germany
Isoflurane, 250 mL bottles	Attane, Piramal, Mumbai, India	LDNI 22098	Standard vet. equipment
Ketamine (Ketalar)	Pfitzer, New York, NY
Lipopolysaccharide (LPS) from Escherichia coli, serotype 055:B5	Sigma, Buchs, Switzerland
Q-tips small	Carl Roth GmbH, Karlsruhe, Germany	EH11.1	Standard surgical
Ringerfundin	Bbraun, Melsungen, Germany
Tec-3 Isofluorane Vaporizer	Ohmeda, GE-Healthcare, Chicago, IL	not available anymore	Standard vet. equipment
Xylazine (Xylazin Streuli)	Streuli AG, Uznach, Switzerland