عزل وثقافة البلاعم القلبية المقيمة من العقدة الجيبية الأذينية والأذينية البطينية

Summary

يوفر البروتوكول المقدم هنا نهجا خطوة بخطوة لعزل الضامة القلبية المقيمة من العقدة الجيبية الأذينية (SAN) ومنطقة العقدة الأذينية البطينية (AVN) لقلوب الفئران.

Abstract

وقد ثبت أن البلاعم القلبية المقيمة تسهل التوصيل الكهربائي في القلب. يبدأ إيقاع القلب الفسيولوجي بنبضات كهربائية متولدة في العقدة الجيبية الأذينية (SAN) ثم يتم إجراؤها على البطينين عبر العقدة الأذينية البطينية (AVN). لمزيد من الدراسة لدور البلاعم المقيمة في نظام التوصيل القلبي ، من الضروري عزل البلاعم المقيمة بشكل صحيح عن SAN و AVN ، لكنه لا يزال يمثل تحديا. هنا ، نقدم بروتوكولا للتشريح المجهري الموثوق به ل SAN و AVN في قلوب الفئران متبوعا بعزل وثقافة الضامة المقيمة.

يتم تحديد وتشريح كل من SAN الذي يقع عند تقاطع محطة crista مع الوريد الأجوف العلوي ، و AVN الذي يقع في قمة مثلث Koch ، وتشريحه بشكل دقيق. يتم تأكيد الموقع الصحيح من خلال التحليل النسيجي للأنسجة التي أجريت مع صبغة ماسون ثلاثية الألوان ومضاد HCN4.

ثم يتم هضم الأنسجة المجهرية إنزيميا للحصول على معلقات خلية واحدة تليها الحضانة مع لوحة محددة من الأجسام المضادة الموجهة ضد علامات سطح محددة من نوع الخلية. يسمح ذلك بتحديد أو عد أو عزل مجموعات الخلايا المختلفة عن طريق فرز الخلايا المنشطة بالفلورسنت. للتمييز بين الضامة القلبية المقيمة والخلايا المناعية الأخرى في عضلة القلب ، وخاصة الضامة المشتقة من الخلايا الوحيدة ، هناك حاجة إلى استراتيجية بوابة دقيقة. أولا ، يتم الكشف عن خلايا السلالة اللمفاوية واستبعادها من مزيد من التحليل. بعد ذلك ، يتم تحديد الخلايا النخاعية مع تحديد البلاعم المقيمة من خلال التعبير العالي لكل من CD45 و CD11b ، والتعبير المنخفض عن Ly6C. مع فرز الخلايا ، يمكن بعد ذلك زراعة البلاعم القلبية المعزولة في المختبر على مدار عدة أيام لمزيد من التحقيق. لذلك ، نصف بروتوكولا لعزل البلاعم القلبية الموجودة داخل نظام التوصيل القلبي. نناقش المزالق في التشريح الدقيق وهضم SAN و AVN ، ونقدم استراتيجية بوابات لتحديد الضامة القلبية وعدها وفرزها بشكل موثوق عن طريق فرز الخلايا المنشط بالفلورة.

Introduction

تبدأ العقدة الجيبية الأذينية (SAN) من الناحية الفسيولوجية النبضة الكهربائية ، وبالتالي فهي جهاز تنظيم ضربات القلب الأساسي. تقوم العقدة الأذينية البطينية (AVN) بتوصيل النبضة الكهربائية من الأذينين إلى البطينين وتعمل أيضا كجهاز تنظيم ضربات القلب الفرعي¹. بشكل عام ، يعد توليد وتوصيل النبضات الكهربائية عملية معقدة يمكن تعديلها بواسطة عوامل مختلفة² ، بما في ذلك البلاعم المقيمة في مناطق SAN / AVN. توضح دراسة حديثة أجراها Hulsmans et al. مجموعة محددة من الضامة القلبية المقيمة التي يتم تخصيبها في AVN وتعمل كلاعبين رئيسيين في الحفاظ على ضربات قلب ثابتة³. ووجدوا أن البلاعم مقترنة كهربائيا بخلايا عضلة القلب ويمكن أن تغير الخصائص الكهربائية لخلايا عضلة القلب المقترنة. لاحظ المؤلفون أيضا أن مثل هذه الخلايا الموصلة التي تتداخل مع الضامة موجودة أيضا في مكونات أخرى من نظام التوصيل القلبي ، مثل SAN.

حاليا ، من غير المعروف تماما ما إذا كان النمط الظاهري للبلاعم القلبية المقيمة يختلف بين مناطق القلب. ومع ذلك ، فقد ثبت أن البيئة المكروية للأنسجة يمكن أن تؤثر على النسخ والتجديد التكاثري للبلاعم الأنسجية⁴. علاوة على ذلك ، نظرا لأنه ثبت أن النمط الظاهري للخلية العضلية القلبية مختلف بين المناطق ، فقد تكون التأثيرات الوظيفية للبلاعم على خلايا عضلة القلب خاصة بالمنطقة ، حتى لو كان النمط الظاهري للبلاعم نفسه هو نفسه. لذلك ، هناك حاجة إلى مزيد من الدراسات على مناطق قلبية محددة.

أظهرت الدراسات الحديثة أنه في حالة مستقرة ، يتم إنشاء البلاعم المقيمة في الأنسجة قبل الولادة ، وتنشأ بشكل مستقل عن تكون الدم النهائي ، وتستمر حتى مرحلة البلوغ⁵. ومع ذلك ، بعد استنفاد البلاعم أو أثناء التهاب القلب ، تساهم حيدات Ly6c^hi في تجديد عدد البلاعم القلبية⁶. أظهرت الدراسات التي تضمنت تتبع النسب الجيني ، و parabiosis ، ورسم خرائط المصير ، وتتبع الخلايا تعايش مجموعة متنوعة من مجموعات البلاعم المقيمة في الأنسجة في الأعضاء والأنسجة ، وكذلك السلوك الخلوي المختلف للمجموعات الفرعية من البلاعم التي يحتمل أن تكون مرتبطة بتطورها⁷،^8،9.

استفاد توصيف البلاعم القلبية المقيمة من استخدام فرز الخلايا المنشطة المغناطيسية (MACS) وفرز الخلايا المنشطة بالفلورسنت. هذه الطرق مفيدة بشكل خاص لعزل مجموعات خلايا معينة من كسور الأنسجة المتعددة عن طريق تسميتها بعلامات سطح الخلية. هذا لا يؤدي فقط إلى نقاء أعلى لنوع الخلايا المناعية المعزولة ، ولكنه يسمح أيضا بتحليل النمط الظاهري. هنا ، نقدم بروتوكولا يتضمن خلايا مغلفة بالخرز المغناطيسي متبوعا بفرز الخلايا المنشطة بالفلورسنت لإثراء الضامة القلبية المقيمة المعزولة على وجه التحديد من منطقة SAN و AVN.

لاستكشاف خصائص البلاعم القلبية المقيمة في نظام التوصيل ووظيفتها في التوصيل القلبي وعدم انتظام ضربات القلب ، يعد التوطين الدقيق وتشريح SAN و AVN أمرا بالغ الأهمية. للتشريح المجهري ل SAN و AVN ، يتم استخدام المعالم التشريحية لتحديد المنطقة¹⁰. باختصار ، يقع SAN عند تقاطع الوريد الأجوف العلوي والأذين الأيمن. يقع AVN داخل مثلث كوخ ، الذي يحده من الأمام نشرة الحاجز للصمام ثلاثي الشرف ، وخلفيا وتر تودارو¹¹. كما نقدم إجراء تشريح دقيق ل SAN و AVN في الفئران وهو ما تؤكده الأنسجة وتلطيخ التألق المناعي.

يمكن استخدام البلاعم المقيمة المعزولة لإجراء مزيد من التجارب مثل تسلسل الحمض النووي الريبي أو يمكن استعادتها وزراعتها لأكثر من أسبوعين مما يسمح بإجراء تجارب مختلفة في المختبر. لذلك ، يصف بروتوكولنا إجراء قيما للغاية لأخصائي الإيقاع المناعي. يوضح الجدول 1 تكوين جميع الحلول اللازمة ، ويبين الشكل 1 معالم التشريح المجهري ل SAN و AVN. الشكل 2 هو توضيح تخطيطي لتوطين SAN و AVN. يوضح الشكل 3 التلوين النسيجي ل SAN و AVN (تلطيخ ماسون ثلاثي الألوان والتألق المناعي). يوضح الشكل 4 استراتيجية بوابة خطوة بخطوة لعزل البلاعم القلبية المقيمة عن طريق فرز الخلايا المنشط بالفلورة.

Protocol

تم إجراء رعاية الحيوان وجميع الإجراءات التجريبية وفقا للمبادئ التوجيهية للجنة رعاية الحيوان والأخلاقيات بجامعة ميونيخ وتمت الموافقة على جميع الإجراءات المتخذة على الفئران من قبل حكومة بافاريا ، ميونيخ ، ألمانيا. تم الحصول على الفئران C57BL6 / J تجاريا.

1. الاستعدادات

1. قم بإعداد مخزن فرز الخلايا (الجدول 1) وتخزينه في 4 درجات مئوية.
   ملاحظة: أثناء الإجراء التجريبي بأكمله ، يجب أن يكون المخزن المؤقت لفرز الخلايا دائما على الجليد.
2. تحضير مخزن الهضم المؤقت (الجدول 1) قبل وقت قصير من عملية الهضم حيث لا يمكن اكتشاف نشاط كولاجيناز إلا لبضع ساعات في درجة حرارة الغرفة.
3. الرجوع إلى البروتوكول المنشور مسبقا لإعداد طبق التشريح¹⁰. باختصار ، أضف 30 مل من هلام الأغاروز (3٪ -4٪) إلى طبق بتري بقطر 100 مم واتركه يبرد في درجة حرارة الغرفة.

2. التضحية بالحيوانات واستئصال القلب

1. تخدير الفأر باستخدام إيزوفلوران عن طريق وضعه في غرفة حضانة متصلة بمبخر إيزوفلوران وغسله بنسبة 5٪ إيزوفلوران / 95٪ أكسجين.
2. بعد حقن الفنتانيل للتسكين ، افتح القفص الصدري وقم بتخلل القلب عن طريق حقن 5-10 مل من الثلج البارد 1x PBS مباشرة في البطين الأيسر (LV). استخراج قلب الفئران ووضعه على طبق التشريح. تم وصف التفاصيل التجريبية بالتفصيل سابقا¹⁰.

3. تشريح دقيق ل SAN و AVN

1. بعد عزل القلب ، قم بإجراء عمليات التشريح المجهري التالية في طبق التشريح باستخدام 1x PBS المثلج تحت مجهر التشريح.
2. استخدم المعالم التشريحية القلبية ، مثل الشريان الأورطي ، الشريان الرئوي ، الجيب التاجي ، البطين الأيسر / الأيمن ، إلخ. لتحديد اليسار / اليمين (اليسار: LV ؛ اليمين: RV) والأمامي / الخلفي (الأمامي: الشريان الأورطي ؛ الخلفي: الجيب التاجي) للقلب. بعد تحديد الاتجاه ، أدر القلب مع الجزء الأمامي منه في أسفل الطبق (لفضح الأوردة الكبيرة الموجودة في الخلف).
3. تشريح مجهري لشبكة SAN
   ملاحظة: تم وصف التشريح الدقيق لشبكة SAN سابقا¹⁰. يتم وصف العملية باختصار أدناه.
   1. كشف المنطقة بين الأجوف عن طريق تثبيت الزوائد الأذينية اليمنى (RAA) والأنسجة المجاورة للوريد الأجوف العلوي (SVC) والوريد الأجوف السفلي (IVC) على طبق التشريح المجهري باستخدام دبابيس الحشرات.
   2. قطع القلب على طول الحاجز بين الأذينين بالتوازي مع crista terminalis (CT) لفصل المنطقة بين الأجوف والحصول على عينة SAN (الشكل 1A ، الشكل 2A). ضع العينة في أنبوب طرد مركزي دقيق فارغ سعة 1.5 مل على الثلج.
4. تشريح مجهري للانواع اللاوعائي
   1. بعد جمع عينة SAN ، تأكد من أن RAA وأجزاء من الأذين الأيمن (RA) قد تم قطعها بالفعل ولم يتبق سوى الحاجز بين الأذينين (IAS) والحاجز بين البطينين (IVS).
   2. قم بتثبيت الأجزاء المتبقية من القلب من خلال الأنسجة المجاورة ل IAS و IVS باستخدام دبابيس الحشرات لجعل الجانب الأذيني الأيمن من IAS متجها لأعلى.
   3. انظر إلى الأذين الأيمن على سطح الشغاف لمثلث كوخ. سيحده من الأمام الخط المفصلي لنشرة الحاجز للصمام ثلاثي الشرف (TV) ، وخلفيا وتر تودارو. لوحظ فتحة الجيب التاجي في القاعدة. (الشكل 1 ب ، الشكل 2 ب).
   4. قطع مثلث كوخ ، الذي يحتوي على AVN ، ووضعه مباشرة في أنبوب طرد مركزي دقيق فارغ سعة 1.5 مل على الجليد.

4. الهضم

1. تحضير مخزن الهضم المؤقت (الجدول 1) قبل وقت قصير من الاستخدام.
2. فرم أنسجة SAN و AVN جيدا باستخدام المشارط.
   ملاحظة: فرم الأنسجة جيدا سيزيد من كفاءة الهضم ويساعد في الحصول على تعليق خلوي جيد للفرز. نظرا لأن عينات SAN و AVN صغيرة جدا ، يوصى بفرم الأنسجة مباشرة داخل أنبوب الطرد المركزي الدقيق سعة 1.5 مل لتقليل فقد العينة.
3. أضف 500 ميكرولتر من محلول الهضم لكل عينة واغسل جميع الأنسجة المفرومة من جدار أنبوب الطرد المركزي الدقيق سعة 1.5 مل. يساعد السحب اللطيف على هضم العينة.
4. تجانس الأنبوب على آلة دوامة (الإعدادات: 37 درجة مئوية ، 750 دورة في الدقيقة لمدة 1 ساعة).
5. بعد الهضم ، انقل معلق الأنسجة إلى أنبوب طرد مركزي جديد سعة 15 مل عن طريق المرور عبر مصفاة خلية 40 ميكرومتر. شطف مصفاة الخلية مع 5 مل إضافية من عازلة فرز الخلايا لوقف عملية الهضم.
6. جهاز طرد مركزي لأنبوب 15 مل عند 350 × جم لمدة 7 دقائق عند 4 درجات مئوية. ثم قم بإزالة الطافت تماما باستخدام ماصة. أعد تعليق حبيبات الخلية باستخدام مخزن مؤقت لفرز الخلايا 90 ميكرولتر.
   ملاحظة: قبل الفصل المغناطيسي ، ماصة تعليق الخلية برفق عدة مرات أو تمر عبر مصفاة خلية 30 ميكرومتر لإزالة كتل الخلايا إذا لزم الأمر ، للحصول على تعليق خلية واحدة للحصول على الأداء الأمثل للإثراء المغناطيسي لمجموعات الخلايا المثيرة للاهتمام.

5. التخصيب المغناطيسي ل CD45 وتلطيخ العينة

ملاحظة: لعزل البلاعم القلبية بكفاءة فرز عالية ، تم إجراء استبعاد الخلايا غير المرغوب فيها بما في ذلك الخلايا الليمفاوية باستخدام ميكروبيدات CD45 وفقا لبروتوكول الشركة المصنعة. بناء على لوحة الفرز ، تم تحديد الضامة المقيمة القلبية على أنها CD45 عالية CD11b عالية CD64 عالية Ly6C منخفضة /^int F4 /^{80 عالية}.

1. أضف 10 ميكرولتر من ميكروبيدات CD45 لكل 10⁷ خلايا إجمالية إلى تعليق الخلية في أنبوب الطرد المركزي سعة 15 مل. اخلطي العينات جيدا واحتضنيها لمدة 15 دقيقة عند 4 درجات مئوية.
   ملاحظة: يجب إجراء عد الخلايا باستخدام مقياس الدم لفترة وجيزة للتأكد من أن كل أنبوب لا يحتوي على أكثر من 10⁷ خلايا إجمالا. عند العمل مع أرقام خلايا أعلى ، يجب زيادة حجم الخرز المغناطيسي.
2. تحضير خليط الأجسام المضادة عن طريق تخفيف الأجسام المضادة التالية في مخزن فرز الخلايا (تخفيف 1: 100 لكل جسم مضاد): CD45-PE ، CD11b-APC-Cy7 ، CD64-APC ، F4 / 80-PE-Cy7 ، Ly6C-FITC. ستتم إضافة DAPI لاحقا إلى تلطيخ التمييز الحي / الميت.
3. بعد 15 دقيقة من حضانة الخرزة المغناطيسية ، أضف 100 ميكرولتر من خليط الأجسام المضادة مباشرة إلى معلق الخلية في أنبوب 15 مل (ثم يكون التركيز النهائي لجميع الأجسام المضادة 1: 200) واحتضانها لمدة 20 دقيقة عند 4 درجات مئوية.
4. بعد 20 دقيقة من حضانة الأجسام المضادة ، اغسل معلق الخلية بإضافة 1-2 مل من المخزن المؤقت لفرز الخلايا لكل 10⁷ خلايا وأجهزة طرد مركزي عند 350 × جم لمدة 10 دقائق. قم بإزالة المادة الطافية تماما عن طريق سحب العينات.
5. أعد تعليق ما يصل إلى 10⁸ خلايا في 500 ميكرولتر من المخزن المؤقت لفرز الخلايا.
   ملاحظة: يجب تحديد الحد الأقصى لعدد الخلايا للفصل المغناطيسي وفقا لبروتوكول الشركة المصنعة.
6. تحضير مجموعة الفصل المغناطيسي.
   1. قم بتوصيل العمود المغناطيسي بفاصل مغناطيسي مناسب وضع أنبوب تجميع أسفل العمود المغناطيسي.
   2. قم بإعداد الأعمدة المغناطيسية عن طريق الشطف باستخدام المخزن المؤقت لفرز الخلايا: أضف 500 ميكرولتر من المخزن المؤقت لفرز الخلايا في الجزء العلوي من العمود واترك المخزن المؤقت يمر.
7. قم بتطبيق تعليق الخلية على الفور على العمود أثناء مرور المخزن المؤقت لفرز الخلايا.
   ملاحظة: تجنب تكوين فقاعات الهواء في العمود. وفقا لبروتوكول التصنيع ، على الرغم من أن وقت ملء العمود قد يتغير من ظروف التخزين ، إلا أنه ليس له أي تأثير على جودة الفصل.
8. اغسل العمود بمخزن مؤقت لفرز الخلايا 3 × 500 ميكرولتر. يحتوي التدفق في الخطوة 5.7 والخطوة 5.8 على خلايا غير مسماة ، والتي يمكن التخلص منها إذا لم تكن هناك حاجة إلى مزيد من التجربة.
   ملاحظة: إضافة المخزن المؤقت لفرز الخلايا مباشرة عندما يكون خزان العمود فارغا تقريبا.
9. قم بإزالة العمود من الفاصل المغناطيسي وضعه على أنبوب تجميع جديد.
10. أضف 1 مل من المخزن المؤقت لفرز الخلايا إلى العمود. اغسل العمود على الفور عن طريق تطبيق المكبس المرفق مع العمود بإحكام. يحتوي التدفق من خلال الخلايا المسماة مغناطيسيا.
11. أضف محلول DAPI إلى جميع معلقات الخلايا التي تم جمعها مغناطيسيا قبل وقت قصير من تشغيلها على فارز الخلايا. اضبط التركيز النهائي ل DAPI على 0.3-0.5 ميكروغرام / مل.
12. إجراء تحليل FACS.

6. عينات للتعويض

1. قم بإعداد 6 أنابيب طرد مركزي دقيقة بنية سعة 1.5 مل تحمل علامة "PE" و "APC-Cy7" و "APC" و "PE-Cy7" و "FITC" و "DAPI" على التوالي لحماية الأجسام المضادة من الضوء. قم بإعداد أنبوب طرد مركزي دقيق آخر سعة 1.5 مل يسمى "غير ملوث".
   ملاحظة: يمكن القيام بذلك في نفس الوقت الذي يتم فيه احتضان معلق الخلية بالميكروبيدات والأجسام المضادة. يمكن أن تكون العينة غير الملوثة هي نسيج عضلة القلب الذي تم جمعه عشوائيا من أنسجة القلب التي تم تجنيبها ومعالجتها أيضا وفقا للخطوة 4.
2. قم بتخفيف كل جسم مضاد مترافق مع مخزن فرز الخلايا إلى 1:50 في أنابيب الطرد المركزي الدقيقة البنية سعة 1.5 مل والتي تم تمييزها وفقا لذلك.
3. أضيفي قطرة واحدة من محلول الخرز التعويضي واحتضنيه لمدة 20 دقيقة عند 4 درجات مئوية.
4. أضف 2 مل من المخزن المؤقت لفرز الخلايا في كل أنبوب طرد مركزي بني سعة 1.5 مل وأجهزة طرد مركزي بسرعة 450 × جم لمدة 5 دقائق. تخلص تماما من المادة الطافية وأعد تعليق الحبيبات المحتوية على حبة مع مخزن مؤقت لفرز الخلايا 300 ميكرولتر وانقلها إلى أنابيب فرز الخلايا التي تم تمييزها أيضا وفقا لذلك.

7. تشغيل على فارز الخلايا واستراتيجية البوابة

1. قم بتطبيق العينة غير الملوثة وأنابيب التعويض أولا واضبط الفولتية لكل قناة لمحاذاة كل من الذروة الموجبة والسالبة إلى الموضع المناسب للمحور. احفظ إعدادات التعويض وقم بتطبيقها على العينات التالية.
2. قم بتطبيق العينات على فارز الخلايا. قم بتعيين استراتيجية البوابة كما هو موضح في الشكل 4. يتم تحديد الضامة المقيمة في القلب على أنها CD45 عالية CD11b عالية CD64 عالية Ly6C منخفضة /^int F4 /^{80 عالية}. يستخدم DAPI كعلامة صلاحية الخلية.
3. تحقق من مخططات قياس التدفق الخلوي للتأكد من أن عدد الخلايا محل الاهتمام يظهر بشكل صحيح على الرسوم البيانية. إذا لم يكن الأمر كذلك ، فاضبط جهد كل قناة على العرض المركزي لكل مخطط.
4. إذا كانت إعدادات الجهد مرضية ، فابدأ إجراء الفرز. اجمع عدد الخلايا المصنفة في وسط مزرعة يتكون من DMEM يحتوي على 10٪ مصل بقري جنيني ، مكمل ب 100 ميكروغرام / مل ستربتومايسين و 100 وحدة / مل بنسلين.

8. ثقافة البلاعم المقيمة

1. بعد جمع البلاعم التي تم فرزها ، انقل الخلايا على الفور إما إلى أطباق زراعة الأنسجة 35 مم أو 24 صفيحة بئر ، أو استخدمها مباشرة في التجارب اللاحقة.
2. لزراعة البلاعم المصنفة ، احتضان الخلايا عند 37 درجة مئوية ، حاضنة 5٪ CO₂ .
3. تغيير وسط الثقافة كل 48-72 ساعة. يمكن إزالة الخلايا الميتة العائمة بسهولة عن طريق التغيير المتوسط. استخدم البلاعم الحية المرفقة بقاع طبق الاستزراع للتجربة اللاحقة.

النتائج

وصفنا إجراء عمليا لعزل الضامة القلبية المقيمة على وجه التحديد من منطقة SAN و AVN. لتأكيد التشريح الصحيح ، يتم إجراء تلطيخ Masson's Trichrome وتلطيخ HCN4 المناعي (الشكل 3) ¹². باستخدام هذا البروتوكول ، يمكننا جمع ما يقرب من 60000 بلاعم من قلب واحد كامل. يوضح الشكل 4...

Discussion

في هذه المخطوطة ، نصف بروتوكولا لإثراء الضامة القلبية المقيمة على وجه التحديد من مناطق SAN و AVN بنقاوة عالية.

تنقسم البلاعم إلى مجموعات فرعية بناء على موقعها التشريحي والنمط الظاهري الوظيفي. يمكنهم أيضا التبديل من نمط ظاهري وظيفي إلى آخر استجابة لإشارات البيئة الدقيقة المتغ?...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Anesthesia
Isoflurane vaporizer system	Hugo Sachs Elektronik	34-0458, 34-1030, 73-4911, 34-0415, 73-4910	Includes an induction chamber, a gas evacuation unit and charcoal filters
Modified Bain circuit	Hugo Sachs Elektronik	73-4860	Includes an anesthesia mask for mice
Surgical Platform	Kent scientific	SURGI-M
In vivo instrumentation
Fine forceps	Fine Science Tools	11295-51
Iris scissors	Fine Science Tools	14084-08
Spring scissors	Fine Science Tools	91500-09
Tissue forceps	Fine Science Tools	11051-10
Tissue pins	Fine Science Tools	26007-01	Could use 27G needles as a substitute
General lab instruments
Orbital shaker	Sunlab	D-8040
Pipette,volume 10ul, 100ul, 1000ul	Eppendorf	Z683884-1EA
Magnetic stirrer	IKA	RH basic
Microscopes
Dissection stereo- zoom microscope	vwr	10836-004
Leica microscope	Leica microsystems	Leica DM6
Flow cytometry machine
Beckman Coulter	Beckman coulter	MoFlo Astrios
Software
FlowJo v10	FlowJo
General Lab Material
0.2 µm syringe filter	sartorius	17597
100 mm petri dish	Falcon	351029
27G needle	BD Microlance 3	300635
50 ml Polypropylene conical Tube	FALCON	352070
Cover slips	Thermo scientific	7632160
Eppendorf Tubes	Eppendorf	30121872
5ml Syringe	Braun	4606108V
Chemicals
0.5 M EDTA	Sigma	20-158
Acetic acid	Merck	100063	Component of TEA
Agarose	Biozym	850070
Bovine Serum Albumin	Sigma	A2153-100G
Collagenase I	Worthington Biochemical	LS004196
Collagenase XI	Sigma	C7657
DNase I	Sigma	D4527
Hyaluronidase	Sigma	H3506
HEPES buffer	Sigma	H4034
Bovine Serum Albumin	Sigma	A2153-100G
DPBS (1X) Dulbecco's Phosphate Buffered Saline	Gibco	14190-094
Fetal bovine serum	Sigma	F2442-500ml
Penicillin − Streptomycin	Sigma	P4083
DMEM	Gibco	41966029
Drugs
Fentanyl 0.5 mg/10 ml	Braun Melsungen
Isoflurane 1 ml/ml	Cp-pharma	31303
Oxygen 5L	Linde	2020175	Includes a pressure regulator
Antibodies
Anti-mouse Ly6C FITC (clone HK1.4)	BioLegend	Cat# 128006	diluted to 1:100
Anti-mouse F4/80 PE/Cy7(clone BM8)	BioLegend	Cat# 123114	diluted to 1:100
Anti-mouse CD64 APC (clone X54-5/7.1)	BioLegend	Cat# 139306	diluted to 1:100
Anti-mouse CD11b APC/Cy7(clone M1/70)	BioLegend	Cat# 101226	diluted to 1:100
Anti-mouse CD45 PE (clone 30-F11)	BioLegend	Cat# 103106	diluted to 1:100
Hoechst 33342, Trihydrochloride, Trihydrate (DAPI)	Invitrogen	H3570	diluted to 1:1000
Animals
Mouse, C57BL/6	Charles River Laboratories