Isolamento e Cultura de Macrófagos Cardíacos Residentes do Nó Sinoatrial e Atrioventricular Murino

Resumo

O protocolo aqui apresentado fornece uma abordagem passo-a-passo para o isolamento de macrófagos residentes cardíacos da região do nó sinoatrial (SAN) e do nó atrioventricular (AVN) de corações de camundongos.

Resumo

Macrófagos cardíacos residentes demonstraram facilitar a condução elétrica no coração. O ritmo cardíaco fisiológico é iniciado por impulsos elétricos gerados no nó sinoatrial (SAN) e, em seguida, conduzidos aos ventrículos via nó atrioventricular (AVN). Para estudar melhor o papel dos macrófagos residentes no sistema de condução cardíaca, é necessário um isolamento adequado dos macrófagos residentes da SAN e da AVN, mas continua sendo um desafio. Aqui, fornecemos um protocolo para a microdissecção confiável da SAN e AVN em corações murinos seguida pelo isolamento e cultura de macrófagos residentes.

Tanto a SAN, que está localizada na junção da crista terminalis com a veia cava superior, quanto a AVN, que está localizada no ápice do triângulo de Koch, são identificadas e microdissecadas. A localização correta é confirmada pela análise histológica do tecido realizada com a coloração tricrômica de Masson e pelo anti-HCN4.

Os tecidos microdissecados são então digeridos enzimaticamente para obter suspensões unicelulares seguidas pela incubação com um painel específico de anticorpos direcionados contra marcadores de superfície específicos do tipo celular. Isso permite identificar, contar ou isolar diferentes populações de células por classificação de células ativadas fluorescentes. Para diferenciar macrófagos residentes cardíacos de outras células imunes no miocárdio, especialmente macrófagos derivados de monócitos recrutados, é necessária uma estratégia de gating delicada elaborada. Primeiro, as células da linhagem linfoide são detectadas e excluídas de análises posteriores. Em seguida, as células mieloides são identificadas com macrófagos residentes sendo determinados pela alta expressão de CD45 e CD11b e baixa expressão de Ly6C. Com a classificação celular, macrófagos cardíacos isolados podem então ser cultivados in vitro durante vários dias para uma investigação mais aprofundada. Descrevemos, portanto, um protocolo para isolar macrófagos residentes cardíacos localizados dentro do sistema de condução cardíaca. Discutimos armadilhas na microdissecação e digestão de SAN e AVN, e fornecemos uma estratégia de bloqueio para identificar, contar e classificar de forma confiável os macrófagos cardíacos por triagem celular ativada por fluorescência.

Introdução

O nó sinoatrial (SAN) inicia fisiologicamente o impulso elétrico e é, portanto, o principal marcapasso do coração. O nó atrioventricular (AVN) conduz o impulso elétrico dos átrios para os ventrículos e também atua como marcapasso subsidiário¹. Em geral, a geração e condução de impulsos elétricos é um processo complexo que pode ser modulado por vários fatores², incluindo macrófagos residentes em regiões SAN/AVN. Um estudo recente de Hulsmans et al. demonstra uma população específica de macrófagos residentes cardíacos que são enriquecidos na AVN e funcionam como atores-chave na manutenção de um batimento cardíaco constante³. Eles descobriram que os macrófagos são eletricamente acoplados aos cardiomiócitos e podem alterar as propriedades elétricas dos cardiomiócitos acoplados. Os autores também observam que essas células condutoras que se intercalam com macrófagos também estão presentes em outros componentes do sistema de condução cardíaca, como o SAN.

Atualmente, não se sabe ao máximo se o fenótipo dos macrófagos cardíacos residentes difere entre as regiões cardíacas. No entanto, tem sido demonstrado que o microambiente tecidual pode afetar a transcrição e a renovação proliferativa dos macrófagos teciduais⁴. Além disso, uma vez que o fenótipo dos cardiomiócitos demonstrou ser diferente entre as regiões, os efeitos funcionais dos macrófagos sobre os cardiomiócitos também podem ser específicos da região, mesmo que o próprio fenótipo dos macrófagos possa ser o mesmo. Portanto, mais estudos sobre regiões cardíacas específicas são necessários.

Estudos recentes têm demonstrado que, no estado estacionário, os macrófagos residentes no tecido são estabelecidos no pré-natal, surgindo independentemente da hematopoiese definitiva, e persistem até a idade adulta⁵. No entanto, após a depleção de macrófagos ou durante a inflamação cardíaca,^{os hi} monócitos Ly6c contribuem para reabastecer a população de macrófagos cardíacos⁶. Estudos envolvendo rastreamento genético de linhagem, parabiose, mapeamento de destino e rastreamento celular mostraram a coexistência de uma variedade de populações de macrófagos residentes em tecidos em órgãos e tecidos e, também, diferentes comportamentos celulares de subconjuntos de macrófagos que estão potencialmente associados à sua ontogenia ^7,8,9.

A caracterização de macrófagos cardíacos residentes tem se beneficiado do uso da classificação de células ativadas magnéticas (MACS) e da triagem de células ativadas fluorescentes. Esses métodos são particularmente úteis para isolar populações celulares específicas de múltiplas frações teciduais, rotulando-as com seus marcadores de superfície celular. Isso não só leva a uma maior pureza do tipo de célula imune isolada, mas também permite a análise fenotípica. Aqui, apresentamos um protocolo que inclui células revestidas de esferas magnéticas seguidas de triagem de células ativadas fluorescentes para o enriquecimento de macrófagos residentes cardíacos especificamente isolados da região SAN e AVN.

Para explorar as características dos macrófagos residentes cardíacos no sistema de condução e sua função para condução cardíaca e arritmogênese, a localização precisa e a dissecção da SAN e da AVN são críticas. Para a microdissecção de SAN e AVN, são utilizados marcos anatômicos para a identificação da região¹⁰. Em resumo, a SAN está localizada na junção da veia cava superior e do átrio direito. A AVN está localizada dentro do triângulo de Koch, que é anteriormente delimitado pelo folheto septal da valva tricúspide e, posteriormente, pelo tendão de Todaro¹¹. Também fornecemos um procedimento preciso de microdissecção de SAN e AVN em camundongos, que é confirmado por histologia e coloração por imunofluorescência.

Macrófagos residentes isolados poderiam ser usados para experimentos adicionais, como sequenciamento de RNA, ou poderiam ser recuperados e cultivados por mais de duas semanas, permitindo vários experimentos in vitro. Portanto, nosso protocolo descreve um procedimento altamente valioso para o imunorritmologista. A Tabela 1 mostra a composição de todas as soluções necessárias, a Figura 1 mostra os pontos de referência de microdissecção para SAN e AVN. A Figura 2 é uma ilustração esquemática da localização de SAN e AVN. A Figura 3 mostra a coloração histológica de SAN e AVN (coloração tricrômica e imunofluorescência de Masson). A Figura 4 mostra uma estratégia de bloqueio passo a passo para isolar macrófagos residentes cardíacos por meio da classificação celular ativada por fluorescência.

Protocolo

O cuidado com os animais e todos os procedimentos experimentais foram conduzidos de acordo com as diretrizes do Comitê de Ética e Cuidados com os Animais da Universidade de Munique e todos os procedimentos realizados em camundongos foram aprovados pelo Governo da Baviera, Munique, Alemanha. Camundongos C57BL6/J foram obtidos comercialmente.

1. Preparações

1. Preparar o buffer de classificação de células (Tabela 1) e armazenar a 4 °C.
   NOTA: Durante todo o procedimento experimental, o tampão de classificação de células deve estar sempre no gelo.
2. Prepare o tampão de digestão (Tabela 1) pouco antes da digestão, pois a atividade da colagenase só pôde ser detectada por algumas horas à temperatura ambiente.
3. Consulte o protocolo publicado anteriormente para a preparação da placa de dissecação¹⁰. Em resumo, adicione 30 mL de gel de agarose (3%-4%) em uma placa de Petri de 100 mm de diâmetro e esfrie à temperatura ambiente.

2. Sacrifício de animais e excisão do coração

1. Anestesiar o rato com isoflurano, colocando-o numa câmara de incubação ligada a um vaporizador de isoflurano e lavada com 5% de isoflurano/95% de oxigénio.
2. Após a injeção de fentanil para analgesia, abra a caixa torácica e perfunda o coração injetando 5-10 mL de PBS 1x gelado diretamente no ventrículo esquerdo (VE). Extraia o coração dos ratos e coloque-o no prato de dissecação. Detalhes experimentais foram descritos em detalhes anteriormente¹⁰.

3. Microdissecção de SAN e AVN

1. Depois de isolar o coração, execute os seguintes procedimentos de microdissecção na placa de dissecção com PBS gelado 1x sob o microscópio de dissecação.
2. Use os marcos anatômicos cardíacos, ou seja, aorta, artéria pulmonar, seio coronariano, ventrículo esquerdo/direito, etc. para determinar a esquerda/direita (esquerda: VE; direita: VD) e anterior/posterior (anterior: aorta; posterior: seio coronário) do coração. Depois que a orientação for determinada, gire o coração com a frente dele na parte inferior do prato (para expor as grandes veias que estão localizadas posteriormente).
3. Microdissecção de SAN
   NOTA: A microdissecção da SAN foi descrita anteriormente¹⁰. O processo é descrito em resumo abaixo.
   1. Expor a região inter-caval fixando os apêndices atriais direitos (ARA) e o tecido adjacente à veia cava superior (VCS) e à veia cava inferior (VCI) na placa de microdissecção utilizando alfinetes de insetos.
   2. Cortar o coração ao longo do septo interatrial paralelo à crista terminal (TC) para separar a região intercaval e obter a amostra SAN (Figura 1A, Figura 2A). Coloque a amostra em um tubo de microcentrífuga vazio de 1,5 mL sobre gelo.
4. Microdissecção de AVN
   1. Após a coleta da amostra de SAN, certifique-se de que a ARA e partes do átrio direito (AR) já foram cortadas, deixando apenas o septo interatrial (SIA) e o septo interventricular (IVS).
   2. Prenda as partes restantes do coração através do tecido adjacente ao IAS e IVS usando pinos de insetos para tornar o lado atrial direito do IAS voltado para cima.
   3. Olhe para o átrio direito na superfície endocárdica para o triângulo de Koch. Será delimitada anteriormente pela linha articular do folheto septal da valva tricúspide (VC) e, posteriormente, pelo tendão de Todaro. O orifício do seio coronário é observado na base. (Figura 1B, Figura 2B).
   4. Corte o triângulo de Koch, que contém o AVN, e coloque-o diretamente em um tubo de microcentrífuga vazio de 1,5 mL no gelo.

4. Digestão

1. Preparar o tampão de digestão (Tabela 1) pouco antes do uso.
2. Pique bem o tecido SAN e AVN com bisturis.
   NOTA: Picar bem o tecido aumentará a eficiência da digestão e ajudará a obter uma boa suspensão celular para classificação. Como as amostras de SAN e AVN são bastante pequenas, recomenda-se picar o tecido diretamente dentro do tubo de microcentrífuga de 1,5 mL para reduzir a perda de amostra.
3. Adicionar 500 μL de tampão de digestão por amostra e lavar todo o tecido picado da parede do tubo de microcentrífuga de 1,5 ml. A pipetagem suave ajuda a digerir a amostra.
4. Homogeneizar o tubo em uma máquina de vórtice (configurações: 37 °C, 750 rpm por 1 h).
5. Após a digestão, transfira a suspensão tecidual para um tubo de centrífuga fresco de 15 mL, passando por um filtro celular de 40 μm. Lave o filtro celular com um adicional de 5 mL de tampão de classificação celular para interromper a digestão.
6. Centrifugar o tubo de 15 ml a 350 x g durante 7 min a 4 °C. Em seguida, remova o sobrenadante completamente usando a pipeta. Ressuspenda o pellet celular com um buffer de classificação celular de 90 μL.
   NOTA: Antes da separação magnética, pipetar a suspensão celular suavemente algumas vezes ou passar por um filtro celular de 30 μm para remover aglomerados celulares, se necessário, para obter uma única suspensão celular para um desempenho ideal de enriquecimento magnético de populações celulares interessantes.

5. Enriquecimento magnético de CD45 e coloração da amostra

NOTA: Para isolar os macrófagos cardíacos com alta eficiência de classificação, a exclusão de células indesejadas, incluindo linfócitos, foi realizada com microesferas CD45 de acordo com o protocolo do fabricante. Com base no painel de classificação, os macrófagos residentes cardíacos foram identificados como CD45^altoCD11b alto CD64 alto Ly6C^baixo/int F4/80^alto.

1. Adicionar 10 μL de microesferas CD45 por 10⁷ células totais à suspensão celular no tubo de centrífuga de 15 ml. Misturar bem as amostras e incubá-las durante 15 minutos a 4 °C.
   NOTA: A contagem de células usando um hemocitômetro deve ser feita brevemente para se certificar de que cada tubo contém não mais do que 10⁷ células totais. Ao trabalhar com números de células mais altos, o volume de contas magnéticas precisa ser ampliado.
2. Preparar a mistura de anticorpos diluindo os seguintes anticorpos em tampão de classificação celular (diluição 1:100 para cada anticorpo): CD45-PE, CD11b-APC-Cy7, CD64-APC, F4/80-PE-Cy7, Ly6C-FITC. DAPI será adicionado mais tarde à coloração por discriminação de vivos / mortos.
3. Após 15 min de incubação do grânulo magnético, adicionar 100 μL de mistura de anticorpos diretamente na suspensão celular no tubo de 15 mL (então a concentração final de todos os anticorpos é de 1:200) e incubar por 20 min a 4 °C.
4. Após 20 min de incubação de anticorpos, lavar a suspensão celular adicionando 1-2 mL de tampão de classificação celular por 10⁷ células e centrifugar a 350 x g por 10 min. Remova completamente o sobrenadante por pipetagem.
5. Ressuspeite até 10⁸ células em 500 μL de tampão de classificação celular.
   NOTA: O número máximo de células para separação magnética deve ser determinado de acordo com o protocolo do fabricante.
6. Prepare o conjunto de separação magnética.
   1. Fixe a coluna magnética a um separador magnético adequado e coloque um tubo de recolha sob a coluna magnética.
   2. Prepare as colunas magnéticas enxaguando com buffer de classificação de células: adicione 500 μL de buffer de classificação de células na parte superior da coluna e deixe o buffer passar.
7. Aplique a suspensão de célula imediatamente na coluna enquanto o buffer de classificação de células estiver passando.
   NOTA: Evite a formação de bolhas de ar na coluna. De acordo com o protocolo do fabricante, embora o tempo de enchimento da coluna possa mudar das condições de armazenamento, ele não tem influência na qualidade da separação.
8. Lave a coluna com 3 x 500 μL de tampão de classificação de células. O fluxo nas etapas 5.7 e 5.8 contém células não rotuladas, que podem ser descartadas se nenhum experimento adicional for necessário.
   Observação : adicione o buffer de classificação de célula imediatamente quando o reservatório de coluna estiver quase vazio.
9. Remova a coluna do separador magnético e coloque-a em um novo tubo de coleta.
10. Adicione 1 mL de buffer de classificação de células à coluna. Lavar imediatamente a coluna aplicando firmemente o êmbolo fornecido com a coluna. O fluxo contém as células magneticamente marcadas.
11. Adicione a solução DAPI a todas as suspensões celulares coletadas marcadas magneticamente pouco antes de executá-las no classificador de células. Ajustar a concentração final de DAPI para 0,3-0,5 μg/mL.
12. Realizar análise FACS.

6. Amostras para compensação

1. Prepare 6 tubos de microcentrífuga marrons de 1,5 mL rotulados como "PE", "APC-Cy7", "APC", "PE-Cy7", "FITC" e "DAPI", respectivamente, para proteger os anticorpos da luz. Prepare mais um tubo de microcentrífuga de 1,5 mL rotulado como "não manchado".
   NOTA: Isso pode ser feito ao mesmo tempo em que incuba a suspensão celular com as microesferas e anticorpos. A amostra não corada pode ser o tecido cardiomiócito coletado aleatoriamente do tecido cardíaco poupado e também tratado de acordo com a etapa 4.
2. Diluir cada anticorpo conjugado com fluorescência com tampão de classificação celular em 1:50 nos tubos de microcentrífuga marrom de 1,5 mL que são marcados de acordo.
3. Adicionar uma gota de solução de esferas de compensação e incubar durante 20 minutos a 4 °C.
4. Adicionar 2 mL de tampão de classificação celular em cada tubo de microcentrífuga marrom de 1,5 mL e centrífuga a 450 x g por 5 min. Descarte completamente o sobrenadante e ressuspenda o grânulo contendo pellet com tampão de classificação de células de 300 μL e transfira-os para tubos classificadores de células que também são marcados de acordo.

7. Execução no classificador de células e estratégia de bloqueio

1. Aplique primeiro a amostra não corada e os tubos de compensação e ajuste as tensões de cada canal para alinhar o pico positivo e negativo à posição adequada do eixo. Salve as configurações de compensação e aplique-as aos exemplos a seguir.
2. Aplique as amostras no classificador de células. Defina a estratégia de bloqueio conforme descrito na Figura 4. Os macrófagos residentes cardíacos são identificados como CD45^altoCD11b alto CD64 alto Ly6C^baixo/int F4/80^alto. DAPI é usado como um marcador de viabilidade celular.
3. Verifique os gráficos de citometria de fluxo para confirmar que a população celular de interesse é mostrada corretamente nos gráficos. Caso contrário, ajuste a tensão de cada canal para a visualização central de cada gráfico.
4. Se as configurações de tensão forem satisfatórias, inicie o procedimento de classificação. Coletar a população celular classificada em meio de cultura composto por DMEM contendo 10% de soro fetal bovino, suplementado com 100 μg/mL de estreptomicina e 100 U/mL de penicilina.

8. Cultura de macrófagos residentes

1. Depois de coletar os macrófagos classificados, transfira as células imediatamente para placas de cultura de tecidos de 35 mm ou placa de 24 poços, ou use-as diretamente para experimentos subsequentes.
2. Para a cultura de macrófagos classificados, incubar as células a 37 °C, incubadora de CO_{2 a} 5%.
3. Mude o meio de cultura a cada 48-72 h. As células mortas flutuantes podem ser facilmente removidas por mudança de meio. Use macrófagos vivos anexados ao fundo do prato de cultura para experimentos subsequentes.

Resultados

Descrevemos um procedimento prático para o isolamento de macrófagos residentes cardíacos especificamente da região SAN e AVN. Para confirmar uma dissecção correta, é realizada a coloração tricrômica de Masson e a coloração imunofluorescente de HCN4 (Figura 3)¹². Com este protocolo, pudemos coletar aproximadamente 60.000 macrófagos de um coração inteiro. A Figura 4 mostra a estratégia de gating para triagem de macrófagos c...

Discussão

Neste manuscrito, descrevemos um protocolo para o enriquecimento de macrófagos residentes cardíacos especificamente das regiões SAN e AVN em alta pureza.

Os macrófagos são divididos em subpopulações com base em sua localização anatômica e fenótipo funcional. Eles também podem mudar de um fenótipo funcional para outro em resposta a sinais microambientais variáveis¹³. Em comparação com outros órgãos, como medula óssea e fígado, o tecido cardíaco cont?...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Anesthesia
Isoflurane vaporizer system	Hugo Sachs Elektronik	34-0458, 34-1030, 73-4911, 34-0415, 73-4910	Includes an induction chamber, a gas evacuation unit and charcoal filters
Modified Bain circuit	Hugo Sachs Elektronik	73-4860	Includes an anesthesia mask for mice
Surgical Platform	Kent scientific	SURGI-M
In vivo instrumentation
Fine forceps	Fine Science Tools	11295-51
Iris scissors	Fine Science Tools	14084-08
Spring scissors	Fine Science Tools	91500-09
Tissue forceps	Fine Science Tools	11051-10
Tissue pins	Fine Science Tools	26007-01	Could use 27G needles as a substitute
General lab instruments
Orbital shaker	Sunlab	D-8040
Pipette,volume 10ul, 100ul, 1000ul	Eppendorf	Z683884-1EA
Magnetic stirrer	IKA	RH basic
Microscopes
Dissection stereo- zoom microscope	vwr	10836-004
Leica microscope	Leica microsystems	Leica DM6
Flow cytometry machine
Beckman Coulter	Beckman coulter	MoFlo Astrios
Software
FlowJo v10	FlowJo
General Lab Material
0.2 µm syringe filter	sartorius	17597
100 mm petri dish	Falcon	351029
27G needle	BD Microlance 3	300635
50 ml Polypropylene conical Tube	FALCON	352070
Cover slips	Thermo scientific	7632160
Eppendorf Tubes	Eppendorf	30121872
5ml Syringe	Braun	4606108V
Chemicals
0.5 M EDTA	Sigma	20-158
Acetic acid	Merck	100063	Component of TEA
Agarose	Biozym	850070
Bovine Serum Albumin	Sigma	A2153-100G
Collagenase I	Worthington Biochemical	LS004196
Collagenase XI	Sigma	C7657
DNase I	Sigma	D4527
Hyaluronidase	Sigma	H3506
HEPES buffer	Sigma	H4034
Bovine Serum Albumin	Sigma	A2153-100G
DPBS (1X) Dulbecco's Phosphate Buffered Saline	Gibco	14190-094
Fetal bovine serum	Sigma	F2442-500ml
Penicillin − Streptomycin	Sigma	P4083
DMEM	Gibco	41966029
Drugs
Fentanyl 0.5 mg/10 ml	Braun Melsungen
Isoflurane 1 ml/ml	Cp-pharma	31303
Oxygen 5L	Linde	2020175	Includes a pressure regulator
Antibodies
Anti-mouse Ly6C FITC (clone HK1.4)	BioLegend	Cat# 128006	diluted to 1:100
Anti-mouse F4/80 PE/Cy7(clone BM8)	BioLegend	Cat# 123114	diluted to 1:100
Anti-mouse CD64 APC (clone X54-5/7.1)	BioLegend	Cat# 139306	diluted to 1:100
Anti-mouse CD11b APC/Cy7(clone M1/70)	BioLegend	Cat# 101226	diluted to 1:100
Anti-mouse CD45 PE (clone 30-F11)	BioLegend	Cat# 103106	diluted to 1:100
Hoechst 33342, Trihydrochloride, Trihydrate (DAPI)	Invitrogen	H3570	diluted to 1:1000
Animals
Mouse, C57BL/6	Charles River Laboratories