JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • النتائج
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

تصف هذه الدراسة طريقة جديدة لعزل الخلايا الشحمية البنية للفئران لتحليل التعبير الجيني والبروتيني.

Abstract

الأنسجة الدهنية البنية (BAT) هي المسؤولة عن توليد الحرارة غير المرتعش في الثدييات ، والخلايا الشحمية البنية (BAs) هي الوحدات الوظيفية ل BAT. بتحتوي هذه القطيرات على قطرات ليبيدات متعددة الأعراق وميتوكوندريا وفيرة، وتعبر عن فصل البروتين 1 (UCP1). يتم تصنيف BAs إلى نوعين فرعيين بناء على أصلها: BAs الكلاسيكية المشتقة من الجنين (cBAs) والخلايا الشحمية البيضاء المشتقة BAs. نظرا لكثافتها المنخفضة نسبيا ، لا يمكن عزل BAs عن BAT بطريقة الطرد المركزي التقليدية. في هذه الدراسة ، تم تطوير طريقة جديدة لعزل BAs من الفئران لتحليل التعبير الجيني والبروتيني. في هذا البروتوكول ، تم هضم BAT بين الكتفين من الفئران البالغة بمحلول Collagenase و Dispase ، وتم إثراء BAs المنفصلة بمحلول يوديكسانول 6٪. ثم تم تحليل BAs المعزولة باستخدام كاشف Trizol للعزل المتزامن للحمض النووي الريبي والحمض النووي والبروتين. بعد عزل الحمض النووي الريبي ، تم استخدام المرحلة العضوية من المحللة لاستخراج البروتين. أظهرت بياناتنا أن محلول يوديكسانول 6٪ يثري BAs بكفاءة دون التدخل في دراسات التعبير الجيني والبروتيني المتابعة. عامل النمو المشتق من الصفائح الدموية (PDGF) هو عامل نمو ينظم نمو وتكاثر خلايا اللحمة المتوسطة. بالمقارنة مع الأنسجة الدهنية البنية ، كان لدى BAs المعزولة تعبير أعلى بكثير عن Pdgfa. باختصار ، توفر هذه الطريقة الجديدة منصة لدراسة بيولوجيا الخلايا الشحمية البنية على مستوى خلية واحدة.

Introduction

لدى كل من الفئران والبشر نوعان من الأنسجة الدهنية: الأنسجة الدهنية البيضاء (WAT) والأنسجة الدهنية البنية (BAT)1. يخزن WAT الطاقة في شكل دهون ثلاثية في الخلايا الشحمية البيضاء ، وتبدد الخلايا الشحمية البنية (BAs) من BAT الطاقة الكيميائية كحرارة2. بناء على أصلها التنموي ، يتم تصنيف BAs بشكل أكبر إلى BAs الكلاسيكية (cBAs) التي تشكلت أثناء نمو الجنين والخلايا الشحمية البيضاء المشتقة من BAs (خلايا بيج / برايت ، محولة من الخلايا الشحمية البيضاء في ظل ظروف الإجهاد)3. بتكون متعددة العينات، وتعبر عن البروتين الحراري الذي يفصل البروتين 1 (UCP1)4. يعد مستودع BAT بين الكتفين (iBAT) أحد مستودعات cBAs الأولية في الثدييات الصغيرة5 ، بينما تنتشر الخلايا البيج داخل WAT6.

نظرا لطبيعتها في تبديد الطاقة ، حظيت BAs باهتمام كبير كهدف علاجي للحد من السمنة7. لاستغلال BAs لغرض علاج السمنة ، من الضروري فهم الآليات الجزيئية التي تتحكم في وظيفة BAs وبقائها وتجنيدها. الأنسجة الدهنية بما في ذلك BAT و WAT غير متجانسة. باستثناء الخلايا الشحمية ، تحتوي الأنسجة الدهنية على العديد من أنواع الخلايا الأخرى ، مثل الخلايا البطانية والخلايا الجذعية الوسيطة والبلاعم8. على الرغم من توفر الأدوات الجينية لاستنفاد الجينات المرشحة على وجه التحديد في الفئران BAs ، مثل UCP1::Cre line9 ، فإن تقنيات تنقية BAs من BAT أو WAT محدودة ، مما يجعل من الصعب دراسة BAs على مستوى نوع الخلية الواحدة. بالإضافة إلى ذلك ، بدون الحصول على BAs خالصة ، لن يتم تحديد العلاقة بين BAs وغير BAs بوضوح. على سبيل المثال ، تم استخدام مستقبلات عامل النمو المشتق من الصفائح الدموية ألفا (PDGFRα) كعلامة لخلايا اللحمة المتوسطة غير المتمايزة ، ويتم التعبير عنها في الخلايا البطانية والخلالية ل BAT. في BAT المجهدة الباردة ، تؤدي الخلايا السلفية الإيجابية PDGFRα إلى ظهور BAs10 جديدة. يتم تنشيط PDGFRα بواسطة ليجند PDGF ، وهو عامل نمو ينظم نمو وتكاثر خلايا اللحمة المتوسطة11 ؛ ومع ذلك ، فمن غير الواضح ما إذا كانت BAs تؤثر على سلوك الخلايا السلفية الإيجابية PDGFRα عن طريق إفراز PDGF.

في الآونة الأخيرة ، تم نشر بروتوكول عزل BAs ، والذي يعتمد على فرز الخلايا المنشط بالفلورة (FACS)12. في هذا البروتوكول ، تم استخدام محلول ألبومين مصل البقر (BSA) بنسبة 3٪ لفصل BAs عن غير BAs ، وتم تنقية BAs المخصبة بواسطة FACS. وتطبيق هذا البروتوكول مقيد بمقتضيات عملية نظام مراقبة الأصول الميدانية، التي تعتمد على كل من المعدات وخبرات تشغيل نظام مراقبة الأصول الميدانية. في هذه الدراسة ، تم تطوير بروتوكول جديد لعزل BAs من BAT. يمكن استخدام BAs المعزولة بواسطة هذا البروتوكول مباشرة لدراسات التعبير الجيني والبروتيني. علاوة على ذلك ، تشير البيانات المستقاة من هذه الدراسة إلى أن BAs هي مورد PDGF رئيسي.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

تم الحفاظ على جميع الفئران في ظروف خالية من مسببات الأمراض ، وتمت الموافقة على جميع الإجراءات من قبل لجنة رعاية واستخدام الحيوان المؤسسية للبحوث الطبية الماسونية (IACUC). UCP1::Cre9 و Rosa 26tdتم الإبلاغ عن خطوط الفئران13 سابقا. تم الاحتفاظ بجميع الفئران في درجة حرارة الغرفة مع دورة ضوء / مظلمة لمدة 12 ساعة.

1. تحضير المحاليل والأنسجة الدهنية البنية (BAT)

  1. تحضير محلول الهضم ومحلول الفصل في أنابيب طرد مركزي سعة 15 مل.
  2. 10 مل من محلول الهضم BAT: إلى 10 مل من محلول ملحي معقم مخزن بالفوسفات (PBS) ، أضف 3.5 مجم / مل Dispase II و 1 مجم / مل كولاجيناز II و 10 مللي مول CaCl2 لعمل محلول هضم BAT.
  3. 10 مل من محلول يوديكسانول 12٪ (محلول فصل): امزج 1 مل من 10x PBS ، 2 مل من 60٪ يوديكسانول ، 0.01 مل من 1 M MgCl 2 ، 0.025 مل من 1 M KCl ، 0.1 مل من 0.2 M حمض إيثيلين ديامينيترايتيك (EDTA) و 6.865 مل من ddH2O للحصول على 12٪ يوديكسانول.
  4. القتل الرحيم فأر بالغ واحد مع جرعة زائدة من CO2 . باختصار ، املأ قفص الماوس بنسبة 100٪ CO2 بمعدل إزاحة 10-30٪ حجم قفص في الدقيقة. بعد 5 دقائق ، تأكد من الوفاة عن طريق التحقق من عدم وجود تنفس واضح.
  5. تشريح الحيوان وجمع الخفافيش بين الكتفين. قم بإزالة WAT وطبقات العضلات تحت مجهر ستيريو.
  6. للحصول على هضم كاف ، قم بتقطيع كل فص BAT إلى ~ 3 مم3 أجزاء وضعها في قارورة نظيفة سعة 50 مل مع قضيب تحريك معدني ومحلول هضم 5 مل. قبل البدء في الهضم ، دع القارورة التي تحتوي على BAT ومخزن الهضم يجلس على الجليد لمدة 1 ساعة.
    ملاحظة: في الخطوات التالية ، تم استخدام حوالي 80 ملغ BAT لعزل الخلايا الشحمية البنية.

2. إجراء عزل BAs

  1. ضع القارورة على محرك مغناطيسي محاط بالحاضنة. اضبط سرعة التحريك على 60 دورة في الدقيقة ودرجة حرارة الحاضنة على 35 درجة مئوية على التوالي. سيستمر الهضم لمدة 30 دقيقة تقريبا. إذا شكلت شرائح BAT كتلا حول شريط التقليب أثناء الهضم ، فاستخدم طرف ماصة سعة 1 مل لتعطيل الأنسجة المجمعة.
  2. ضع مرشح مصفاة 70 ميكرومتر فوق أنبوب طرد مركزي نظيف سعة 50 مل. ماصة حوالي 4 مل تعليق الخلية من خلال مصفاة. اغسل المصفاة ب 4 مل من محلول يوديكسانول 12٪. ماصة لأعلى ولأسفل لخلط الخلايا ومحلول اليوديكسانول. انقل خليط الخلية إلى أنبوبي اختبار بوليسترين شفافين سعة 5 مل.
    ملاحظة: في نهاية عملية الهضم ، يجب أن يكون محلول الهضم غائما ، مما يشير إلى الهضم الكافي. استخدم محلول الهضم الطازج في كل مرة. بمجرد التحضير ، يجب استخدام محلول الهضم في غضون 2 ساعة.
  3. كرر الخطوتين 2.2 و 2.3 مرة أخرى إذا لم يكن الهضم كافيا.
  4. اترك أنابيب البوليسترين الشفافة التي تحتوي على محلول الفصل و BAs على الثلج لمدة 1 ساعة. ستشكل BAs طبقة في الأعلى.
  5. أخرج 20 ميكرولتر من BAs المعزولة لفحص المجهر.

3. عزل الحمض النووي الريبي والبروتين من BAs

  1. ماصة طبقة BAs في أنبوبين للطرد المركزي الدقيق سعة 1.7 مل لعزل الحمض النووي الريبي والبروتين. قم بإزالة محلول اليوديكسانول الزائد بعناية دون تعطيل طبقة BAs.
  2. أضف 1 مل تريزول لعزل الحمض النووي الريبوزي (RNA) والحمض النووي (DNA) والبروتين في محلول الخلية في نفس الوقت. تخلط بما فيه الكفاية لتحلل الخلايا.
  3. أضف 200 ميكرولتر من الكلوروفورم لفصل المراحل.
  4. جهاز طرد مركزي للأنبوب لمدة 9,981 × جم لمدة 10 دقائق عند 4 درجات مئوية.
  5. بعد الطرد المركزي ، استخدم المرحلة المائية لعزل الحمض النووي الريبي. في هذه الدراسة ، تم استخدام إجمالي الحمض النووي الريبي للنسخ العكسي ، وتم إجراء RT-PCR الكمي باستخدام تفاعل البوليميراز المتسلسل في الوقت الفعلي. يتم سرد تسلسل التمهيدي في جدول المواد.
  6. نقل 300 ميكرولتر من المرحلة العضوية إلى أنبوب طرد مركزي دقيق سعة 2 مل.
  7. إلى المرحلة العضوية ، أضف 2.5 حجم 100٪ إيثانول ودوامة لمدة 10 ثوان.
  8. أضف 200 ميكرولتر من 1-برومو-3-كلوروبروبان ودوامة لمدة 10 ثوان.
  9. أضف 600 ميكرولتر من الماء المقطر المزدوج والدوامة لمدة 10 ثوان.
  10. دع المحلول المختلط يقف لمدة 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة.
  11. جهاز طرد مركزي عند 9,981 × جم لمدة 10 دقائق عند 4 درجات مئوية. في هذه الخطوة ، سيتم فصل المراحل. يتم توطين مرحلة البروتين في الطبقة الوسطى.
  12. إزالة المحلول المائي العلوي. أضف 1 مل 100٪ إيثانول إلى المحلول المتبقي.
  13. جهاز طرد مركزي لمدة 10 دقائق ، 9,981 × جم ، 4 درجات مئوية. بعد الطرد المركزي ، سوف تتشكل حبيبات البروتين. تخلص من المادة الطافية.
  14. اغسل الحبيبات ب 1 مل 100٪ إيثانول.
  15. جهاز طرد مركزي لمدة 10 دقائق ، 9981 × جم ، 4 درجات مئوية. احفظ الحبيبات وتخلص من المادة الطافية.
  16. جفف الحبيبات بالهواء لمدة 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة.
  17. قياس وزن بيليه الرطب. أضف محلول SDS 1٪ بنسبة 20 ميكرولتر / ملغ بيليه.
  18. قم بإذابة الحبيبات عن طريق وضع الأنبوب في شاكر ساخن. اضبط درجة الحرارة على 55 درجة مئوية ، والسرعة على 11 × جم. عادة ما يستغرق 5-10 دقائق لإذابة حبيبات البروتين تماما.
    ملاحظة: يمكن قياس تركيز البروتين المذاب بواسطة مقايسة BCA14.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

النتائج

تحضير BAT بين الكتفين لعزل الخلايا الشحمية البنية
يوضح الشكل 1 أ عملية عزل الخلايا الشحمية البنية. ستستغرق العملية برمتها ، من إعداد BAT وحلول الهضم / الفصل إلى الحصول على BAs المعزولة حوالي 4 ساعات.

في الفئران البالغة ، توجد BAT وفيرة في المنطقة بين الكت?...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

في هذه الدراسة ، تم تطوير طريقة جديدة لعزل BAs لتحليل التعبير الجيني والبروتيني.

في بروتوكول عزل BAs المنشور ، تم استخدام محلول BSA بنسبة 3٪ لإثراء BAs12. ومع ذلك ، لا يمكن استخدام BAs المخصبة التي حققها هذا البروتوكول المنشور مباشرة لتحليل تعبير البروتين. وذلك لأن BSA الم...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

اي

Acknowledgements

تم دعم Z. Lin من قبل المعاهد الوطنية للصحة HL138454-01 وصناديق معهد البحوث الطبية الماسونية.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
Antibodies
AntigenCompanyCatalog
PPARγLSBioLs-C368478
PDGFRaSanta Cruzsc-398206
UCP1R&D systemIC6158P
Chemical and solutions
Collagenase, Type IIThermo Fisher Scientific17101015
1-Bromo-3-chloropropaneSigma-AldrichB62404
Bovine Serum Albumin (BSA) GoldbioA-421-10
Calcium chlorideBio BasicCT1330
ChloroformIBI ScientificIB05040
Dispase II, proteaseSigma-AldrichD5693
EDTABio BasicEB0107
EthanolIBI ScientificIB15724
LiQuant Universal Green qPCR Master MixLifeSctLS01131905Y
Magnesium Chloride HexahydrateBoston BioProductsP-855
OneScrip Plus cDNA Synthesis SuperMixABMG454
OptiPrep (Iodixanol)Cosmo Bio USAAXS-1114542
PBS (10x)Caisson LabsPBL07
PBS (1x)Caisson LabsPBL06
Pierce BCA Protein Assay KitThermo Fisher Scientific23227
Potassium ChlorideBoston BioProductsP-1435
SimplyBlue safe StainInvitrogenLC6060
Sodium dodecyl sulfate (SDS)Sigma-Aldrich75746
Trizol reagentLife technoologies15596018
Primers
Gene name (Species) ForwardReverse
Pdgfra (Mouse)CTCAGCTGTCTCCTCACAgGCAACGCATCTCAGAGAAAAGG
Pdgfa (Mouse)TGTGCCCATTCGCAGGAAGAGTTGGCCACCTTGACACTGCG
36B4(Mouse)TGCTGAACATCTCCCCCTTCTCTCTCCACAGACAATGCCAGGAC
Ucp1ACTGCCACACCTCCAGTCATTCTTTGCCTCACTCAGGATTGG
Equipment
NameCompanyApplication
Keyence BZ-X700KeyenceImaging brown adipocytes
Magnetic stirrerVWRDissociate BAT
QuantStudio 6 Flex Real-Time PCR SystemApplied BiosystemQuantitative PCR
The Odyssey Fc Imaging systemLI-CORWestern blot immaging

References

  1. Zwick, R. K., Guerrero-Juarez, C. F., Horsley, V., Plikus, M. V. Anatomical, physiological, and functional diversity of adipose tissue. Cell Metabolism. 27, 68-83 (2018).
  2. Symonds, M. E. Brown adipose tissue growth and development. Scientifica. 2013, Cairo. 305763(2013).
  3. Giralt, M., Villarroya, F. White, brown, beige/brite: Different adipose cells for different functions. Endocrinology. 154, 2992-3000 (2013).
  4. Cannon, B., Nedergaard, J. Brown adipose tissue: function and physiological significance. Physiological Reviews. 84, 277-359 (2004).
  5. Cinti, S. The adipose organ. Prostaglandins, Leukotrienes and Essential Fatty Acids. 73, 9-15 (2005).
  6. Wu, J., et al. Beige adipocytes are a distinct type of thermogenic fat cell in mouse and human. Cell. 150, 366-376 (2012).
  7. Cypess, A. M., Kahn, C. R. Brown fat as a therapy for obesity and diabetes. Current Opinion in Endocrinology, Diabetes and Obesity. 17, 143-149 (2010).
  8. Schoettl, T., Fischer, I. P., Ussar, S. Heterogeneity of adipose tissue in development and metabolic function. Journal of Experimental Biology. 221, (2018).
  9. Kong, X., et al. IRF4 is a key thermogenic transcriptional partner of PGC-1α. Cell. 158, 69-83 (2014).
  10. Lee, Y. H., Petkova, A. P., Konkar, A. A., Granneman, J. G. Cellular origins of cold-induced brown adipocytes in adult mice. The FASEB Journal. 29, 286-299 (2015).
  11. Kim, W. -S., Park, H. -S., Sung, J. -H. The pivotal role of PDGF and its receptor isoforms in adipose-derived stem cells. Histology and Histopathology. 30 (7), 793-799 (2015).
  12. Hagberg, C. E. Flow cytometry of mouse and human adipocytes for the analysis of browning and cellular heterogeneity. Cell Report. 24, 2746-2756 (2018).
  13. Madisen, L., et al. A robust and high-throughput Cre reporting and characterization system for the whole mouse brain. Nature Neuroscience. 13, 133-140 (2010).
  14. Smith, P. K., et al. Measurement of protein using bicinchoninic acid. Analytical biochemistry. 150, 76-85 (1985).
  15. Chey, S., Claus, C., Liebert, U. G. Improved method for simultaneous isolation of proteins and nucleic acids. Analytical Biochemistry. 411, 164-166 (2011).
  16. Ford, T., Graham, J., Rickwood, D. Iodixanol: A nonionic iso-osmotic centrifugation medium for the formation of self-generated gradients. Analytical Biochemistry. 220, 360-366 (1994).
  17. Kovacovicova, K., Vinciguerra, M. Isolation of senescent cells by iodixanol (OptiPrep) density gradient-based separation. Cell Proliferation. 52, 12674(2019).
  18. Lock, M., et al. versatile manufacturing of recombinant adeno-associated viral vectors at scale. Human Gene Therapy. 21, 1259-1271 (2010).
  19. Marin, R. D., Crespo-Garcia, S., Wilson, A. M., Sapieha, P. RELi protocol: Optimization for protein extraction from white, brown, and beige adipose tissues. MethodsX. 6, 918-928 (2019).
  20. Sonna, L. A., Fujita, J., Gaffin, S. L., Lilly, C. M. Invited Review: effects of heat and cold stress on mammalian gene expression. Journal of Applied Physiology. 92, 1725-1742 (2002).
  21. Gensch, N., Borchardt, T., Schneider, A., Riethmacher, D., Braun, T. Different autonomous myogenic cell populations revealed by ablation of Myf5-expressing cells during mouse embryogenesis. Development. 135, 1597-1604 (2008).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

169

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved