JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • النتائج
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

تسهل العضيات المشتقة من الخلايا الجذعية تحليل العمليات الجزيئية والخلوية التي تنظم التجديد الذاتي للخلايا الجذعية والتمايز أثناء تكوين الأعضاء في أنسجة الثدييات. نقدم هنا بروتوكولا لتحليل بيولوجيا الأهداب الأولية في العضيات الثديية للفئران.

Abstract

العضيات هي هياكل ثلاثية الأبعاد مشتقة من الخلايا الجذعية تتكاثر خارج الجسم الحي الهندسة المعمارية المعقدة وعلم وظائف الأعضاء وبالتالي ، تمثل العضيات نماذج مفيدة لدراسة الآليات التي تتحكم في التجديد الذاتي للخلايا الجذعية وتمايزها في الثدييات ، بما في ذلك تكوين الهدبي الأولي والإشارات الهدبية. تكوين الهدبي الأولي هو العملية الديناميكية لتجميع الأهداب الأولية ، وهو مركز إشارات خلوي رئيسي يتحكم في التجديد الذاتي للخلايا الجذعية و / أو التمايز في الأنسجة المختلفة. نقدم هنا بروتوكولا شاملا لتلوين التألق المناعي لنسب الخلايا وعلامات الأهداب الأولية ، في عضيات ثدييات الفئران الكاملة ، للفحص المجهري للصفائح الضوئية. نصف طريقة التصوير المجهري وتقنية معالجة الصور للتحليل الكمي لتجميع الأهداب الأولية وطولها في العضيات. يتيح هذا البروتوكول تحليلا دقيقا للأهداب الأولية في الهياكل المعقدة ثلاثية الأبعاد على مستوى الخلية الواحدة. هذه الطريقة قابلة للتطبيق على تلطيخ التألق المناعي وتصوير الأهداب الأولية والإشارات الهدبية في العضيات الثديية المشتقة من الخلايا الجذعية الطبيعية والمعدلة وراثيا ، من الأنسجة السليمة والمرضية ، لدراسة بيولوجيا الأهداب الأولية في الصحة والمرض.

Introduction

يكمن تطور الكائنات متعددة الخلايا والحفاظ على التوازن في أنسجتها البالغة في تنظيم دقيق بين التجديد الذاتي وتمايز الخلايا الجذعية ، والتي تنسق في الزمان والمكان نمو الأنسجة الطبيعيةوتجديدها 1. يؤدي تخريب هذه اللائحة إلى تشوهات في النمو والسرطانات2. وبالتالي ، فإن فهم الآليات الجزيئية والخلوية التي تنسق التجديد الذاتي للخلايا الجذعية والتمايز أمر مهم في بيولوجيا النمو والسرطان.

أدى التطور الأخير لطرق تكوين الأعضاء خارج الجسم الحي ، حيث تولد الخلايا الجذعية للأنسجة عضيات ثلاثية الأبعاد ، إلى تحويل قدراتنا على دراسة ديناميكيات الخلايا الجذعية أثناء تكوين الأعضاء في الثدييات والحفاظ على توازن الأنسجة في طبق3. تمثل العضيات بديلا جيدا للنماذج الحيوانية المرهقة المعدلة وراثيا لدراسة هذه العمليات. تم الآن تطوير بروتوكولات لتطوير العضيات من الخلايا الجذعية للأنسجة للعديد من الأعضاء3 ، بما في ذلك الأمعاء الدقيقة والقولون والمعدة والكبد والبنكرياس والبروستاتا والغدة الثديية3. بالإضافة إلى ذلك ، فإن تطوير تقنيات تحرير الجينوم الجسدي في الخلايا الجذعية المكونة للعضيات يتيح الآن استجواب الآليات الجزيئية والخلوية التي تتحكم في بيولوجيتهابسرعة 4،5.

الأهداب الأولية عبارة عن هيكل قائم على الأنابيب الدقيقة يتم تجميعه على سطح الخلايا الجذعية و / أو الخلايا المتمايزة من الأنسجةالمختلفة 6. إنه غير متحرك بشكل عام ويتم تجميعه كهيكل واحد لكل خلية7. تكوين الأهداب الأولي هو العملية الديناميكية لتجميع الأهدابالأولية 7. على سطح الخلية ، يعمل الأهداب كمنصة إشارات خلية8. وبالتالي ، يعتقد أن الأهداب الأولية تعمل كمنظم رئيسي للتجديد الذاتي للخلايا الجذعية و / أو التمايز في العديد من الأنسجة ، بما في ذلك الدماغ9،10 ، والغدة الثديية4،11 ، والأنسجة الدهنية12 ، والظهارة الشمية13 ، من بين أمور أخرى. يتم تنظيم تكوين الأهداب الأولي و / أو الإشارات الهدبية ديناميكيا في سلالات الخلايا المتميزة وفي مراحل النمو المختلفة4،13،14 ، ولكن لا يزال يتعين تحديد الآليات الأساسية إلى حد كبير.

يظهر تكوين الأعضاء خارج الجسم الحي وعدا بتطوير المعرفة الأساسية حول الآليات الجزيئية والخلوية التي تتحكم في بيولوجيا الخلايا الجذعية ، بما في ذلك تكوين الهدبي الأولي والإشارات الهدبية. ومع ذلك ، فإنه يعتمد على القدرة على تصوير العضيات المثبتة بالكامل بشكل صحيح على مستوى الخلية المفردة وعلى المقاييس الخلوية الفرعية. استخدمنا مؤخرا نموذجا عضويا مشتقا من الخلايا الجذعية للثدييات للفأر لإظهار أن الأهداب الأولية تتحكم بشكل إيجابي في قدرة تكوين الخلايا الجذعية العضوية للثديفي الفأر 4. نقدم هنا بروتوكولا شاملا لتلوين التألق المناعي للعضيات الثديية للفأر الجبل بالكامل (الشكل 1 أ ، ب) ، والذي يتيح تحليل الأهداب الأولية من خلال الفحص المجهري للصفائح الضوئية أثناء تكوين الأعضاء خارج الجسم الحي في ثلاثي الأبعاد. تم نشر طرق بديلة مؤخرا لتلوين التألق المناعي وتصوير العضيات من خلال الفحص المجهري متحد البؤر15،16. يركز هذا البروتوكول بدلا من ذلك على تحضير وتصوير العضيات من خلال الفحص المجهري للصفائح الضوئية.

Protocol

ملاحظة: يوصى باستخدام البروتوكول أدناه لتلوين العضيات التي نمت في 5 آبار من صفيحة 96 بئر وتم تجميعها معا (> 100 عضوية). اشتقت العضيات من الخلايا الجذعية الثديية للفأر. تم إيواء الفئران المانحة والتعامل معها وفقا للبروتوكولات المعتمدة من قبل لجنة رعاية بجامعة رين (فرنسا).

1. الكواشف

  1. لتحضير المحلول المثبت ، قم بتخفيف 125 ميكرولتر من محلول تجاري مائي 16٪ بارافورمالدهايد (PFA) في 375 ميكرولتر من محلول ملحي مخزن بالفوسفات (PBS) لتوليد محلول PFA بنسبة 4٪.
    تنبيه: معالجة PFA وهي مادة سامة تحت غطاء كيميائي.
  2. لتحضير المخزن المؤقت للنفاذية ، قم بتخفيف 1.5 ميكرولتر من Triton X100 في 500 ميكرولتر من PBS ، لإنتاج محلول Triton X100 بنسبة 0.3٪.
  3. لتحضير المخزن المؤقت للحجب ، قم بتخفيف 1.5 ميكرولتر من Tween-20 و 75 ميكرولتر من مصل الماعز العادي في PBS ، لتوليد محلول مصل الماعز بنسبة 5٪ -0.1٪ Tween 20.
  4. لتحضير وسط تركيب الألواح الخفيفة ، قم بإذابة 1 جم من الاغاروز المنخفض نقطة الانصهار المنخفضة فائقة النقاء في 100 مل من dH20 أو PBS عند 65 درجة مئوية. تحضير 1 مل من الكميات وتخزينها في درجة حرارة الغرفة.

2. استعادة العضيات

  1. انقل العضيات من آبار الاستزراع إلى أنبوب بوليمر منخفض الارتباط سعة 1.7 مل ، بعد ماصتها لأعلى ولأسفل 3 مرات في الآبار ، مع طرف مطلي بالFBS تم قطع نهايته (الحد الأدنى لقطر الطرف 1.5 مم).
    ملاحظة: يمنع الطلاء العضيات من الالتصاق بالطرف. تتيح مادة البوليمر منخفضة الارتباط تقليل ارتباط العضيات بجانب الأنبوب أثناء إجراء التلوين بأكمله.
  2. املأ الأنبوب ب PBS ، وقم بالتدوير لأسفل عند 350 × جم لمدة 3 دقائق. قم بإزالة المادة الطافية.

3. التثبيت والنفاذية والحجب

  1. أعد تعليق العضيات في 500 ميكرولتر من 4٪ PFA. احتضن لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. تدور لأسفل عند 350 × جم لمدة 30 ثانية. قم بإزالة المادة الطافية.
    ملاحظة: من هذه الخطوة فصاعدا ، قم بإعادة تعليق العضيات في المخازن المؤقتة المختلفة ببساطة عن طريق إضافة المخازن المؤقتة على حبيبات العضيات دون لمسها. قم بتنفيذ جميع خطوات الغسيل في درجة حرارة الغرفة.
  2. اغسل العضيات ب 1 مل من PBS لمدة 3 دقائق. تدور لأسفل عند 350 × جم لمدة 30 ثانية. قم بإزالة المادة الطافية.
    وقفة: يمكن الاحتفاظ بالعضيات الثابتة في PBS عند 4 درجات مئوية لمدة أسبوع على الأقل.
  3. قم باختراق العضيات عن طريق تعليقها في 500 ميكرولتر من PBS-Triton X100 0.3٪ واحتضانها لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. قم بتدوير العضيات عند 350 جم لمدة 30 ثانية.
  4. اغسل العضيات عن طريق تعليقها ب 1 مل من PBS واحتضانها لمدة 3 دقائق. تدور لأسفل عند 350 × جم لمدة 30 ثانية. قم بإزالة المادة الطافية. كرر مرة واحدة.
  5. اختياري: أعد تعليق العضيات في 500 ميكرولتر من الميثانول المثلج. احتضان عند - 20 درجة مئوية لمدة 10 دقائق. قد تكون هذه الخطوة مطلوبة لتلوين علامات سنتروزومية محددة.
  6. اختياري (إذا تم تنفيذ الخطوة 5): اغسل العضيات ب 1 مل من PBS لمدة 3 دقائق. تدور لأسفل عند 350 × جم لمدة 30 ثانية. قم بإزالة المادة الطافية. كرر مرة واحدة.
  7. قم بمنع مواقع ربط الأجسام المضادة غير المحددة في العضيات عن طريق تعليقها ب 500 ميكرولتر من المخزن المؤقت المانع (PBS ، مصل الماعز 5٪ ، 0.1٪ توين 20). احتضان 1 ساعة و 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. تدور عند 350 جم لمدة 30 ثانية. قم بإزالة المادة الطافية.
  8. اغسل العضيات عن طريق تعليقها ب 1 مل من PBS واحتضانها لمدة 3 دقائق. تدور لأسفل عند 350 × جم لمدة 30 ثانية. قم بإزالة المادة الطافية.

4. وضع العلامات

  1. أعد تعليق العضيات ب 200 ميكرولتر من المخزن المؤقت المانع مع الأجسام المضادة الأولية المخففة واحتضانها طوال الليل عند 4 درجات مئوية مع اهتزاز خفيف (60 دورة في الدقيقة على شاكر أفقي). ضع الأنابيب بزاوية 45 درجة مع المخطط الأفقي للشاكر. سوف يحافظ على العضيات في الجزء السفلي من الأنابيب في المخزن المؤقت للتلطيخ.
  2. اغسل العضيات عن طريق تعليقها ب 1 مل من PBS واحتضانها لمدة 5 دقائق. تدور لأسفل عند 350 × جم لمدة 30 ثانية. قم بإزالة المادة الطافية. كرر مرتين.
    ملاحظة: قد تلتصق بعض العضيات في الخطوة الأخيرة بجانب الأنبوب ، مما يؤدي إلى فقدان العضوية أثناء شفط المادة الطافية بعد الطرد المركزي ، وإضافة 0.2٪ (وزن / حجم) ألبومين مصل البقر (BSA) إلى PBS في خطوات الغسيل قد يقلل من فقدان العضوية.
  3. أعد تعليق العضيات ب 200 ميكرولتر من المخزن المؤقت المانع مع الأجسام المضادة الثانوية واحتضانها لمدة ساعة واحدة و 30 دقيقة مع اهتزاز خفيف (60 دورة في الدقيقة على شاكر أفقي). ضع الأنابيب بزاوية 45 درجة مع المخطط الأفقي للشاكر. سوف يحافظ على العضيات في الجزء السفلي من الأنابيب في المخزن المؤقت للتلطيخ.
    ملاحظة: يمكن إضافة Hoechst (أو الأصباغ النووية الأخرى ، مثل DAPI أو DRAQ5) إلى المخزن المؤقت بالأجسام المضادة الثانوية.
  4. اغسل العضيات عن طريق تعليقها ب 1 مل من PBS واحتضانها لمدة 5 دقائق. تدور لأسفل عند 350 × جم لمدة 30 ثانية. قم بإزالة المادة الطافية. كرر مرتين.
    ملاحظة: قد تلتصق بعض العضيات في الخطوة الأخيرة بجانب الأنبوب ، مما يؤدي إلى فقدان العضوية أثناء شفط المادة الطافية بعد الطرد المركزي ، وإضافة 0.2٪ (وزن / حجم) BSA إلى PBS في خطوات الغسيل قد يقلل من فقدان العضوية.

5. تحضير عينة الاغاروز للتصوير

  1. قم بإذابة وسط تركيب الألواح الخفيفة عن طريق احتضانها عند 65 درجة مئوية. بمجرد ذوبان الوسط ، احتضنه عند 37 درجة مئوية لمدة 5 دقائق.
  2. أعد تعليق العضيات في 100 ميكرولتر من وسط التركيب باستخدام طرف 200 ميكرولتر، مع قطع طرف الطرف (الحد الأدنى لحجم الطرف: 1.5 مم)، عن طريق سحب العينة لأعلى ولأسفل مرتين.
  3. امتصاص وسط التثبيت مع العضيات في شعرية زجاجية (شعرية خضراء ، القطر الداخلي: 1.5 مم) باستخدام مكبس. احتضان الشعيرات الدموية في درجة حرارة الغرفة لمدة 5 دقائق حتى يتجمد وسط التثبيت.
    وقفة: يمكن تخزين الشعيرات الدموية في PBS عند 4 درجات مئوية لمدة أسبوع قبل التصوير.

6. التصوير

  1. باستخدام مجهر الألواح الضوئية (على سبيل المثال ، ZEISS Lightsheet Z.1) ، قم بتصوير العضيات بأهداف الغمر في الماء 20x أو 40x.
    1. ضع الشعيرات الدموية الزجاجية في غرفة المراقبة. حدد موقع الشعيرات الدموية بالكاميرا الأمامية وضع طرف الشعيرات الدموية الزجاجية عند الحد الأعلى لهدف الكشف.
    2. حدد العينة واضبط التركيز البؤري الأمثل باستخدام طرف الشعيرات الدموية الزجاجية في إضاءة المجال الساطع. ادفع عينة الاغاروز ببطء من الشعيرات الدموية وحدد موقع العضيات داخل الاغاروز المتصلب.
    3. احتفظ بالعضيات المراد تصويرها بالقرب من طرف الشعيرات الدموية ، لتقليل حركات عينة الاغاروز في PBS. قم بتدوير الشعيرات الدموية لتعيين الاتجاه الأمثل للعينة وتحديد التكبير/التصغير المطلوب.
    4. حدد وضع الاكتساب. حدد القنوات للتصوير ، وتعيين الاتجاهات المناسبة لورقة الضوء ، واضبط طاقة الليزر لكل قناة (لتقليل التبييض الضوئي ، واستخدام طاقة الليزر المنخفضة) ، وتعيين حجم الصورة وجانب (جانبي) الإضاءة المطلوبة. مثال على معلمات التصوير: حجم الصورة 1920 × 1920 ، الإضاءة: الجانب المزدوج.
    5. حدد Z-stack إلى صورة عن طريق تعيين Z-extremities للمكدس باستخدام الوحدة النمطية Z-stack وتعيين حجم الخطوة Z إلى الأمثل.
  2. قم بمعالجة ملف الإخراج باستخدام وحدة معالجة الصور لبرنامج المجهر للتنقل في العينة ، والحصول على إسقاط Z وتمثيل ثلاثي الأبعاد.
  3. اقلب العينة واحصل على صورة جديدة من زاوية مختلفة أو صورة عضيات أخرى.
  4. قم بتحليل الصور باستخدام برنامج تحليل الصور المجهري التفاعلي (على سبيل المثال ، Imaris) مما يتيح (1) تصور العينة في 3D (2) تجزئة الكائنات (3) تحديد الأشياء والتحليل الكمي.

النتائج

تعمل طرق تكوين الأعضاء خارج الجسم الحي على تحويل قدراتنا على دراسة تطور أنسجة الثدييات والحفاظ على توازن الأنسجة في الطبق. يعتمد تحليل الآليات الجزيئية والخلوية التي تنظم هذه العمليات ، بما في ذلك تكوين الأهداب الأولية والإشارات الهدبية ، على القدرة على تصوير العض...

Discussion

يتيح البروتوكول التفصيلي المقدم هنا تلطيخ وتصوير عضيات ثدي الفئران التي تنمو في وسط شبه صلب. من المفترض أن ينطبق هذا البروتوكول على تلطيخ العضيات التي تحاكي بنية الأنسجة المختلفة التي تنمو في وسائط شبه صلبة وصلبة. بالنسبة للعضويات التي تنمو بنسبة 100٪ Matrigel مع متوسط في الأ...

Disclosures

ويعلن أصحاب البلاغ عدم وجود تضارب في المصالح.

Acknowledgements

نشكر كزافييه بينسون للمساعدة في تطوير الفحص المجهري للصفائح الخفيفة. مركز Biosit للتكنولوجيا الحيوية ، بما في ذلك MRic و Arche والمرافق الأساسية لقياس التدفق الخلوي و SFR Santé F. Bonamy ، بما في ذلك مرفق MicroPICell الأساسي ، للحصول على الدعم الفني. تم دعم هذا العمل من قبل مؤسسة ARC ، Cancéropôle Grand Ouest ، جامعة رين 1 ، مؤسسة فرنسا. حصل دكتوراه في الطب على دعم زمالة الدراسات العليا من جامعة رين. VJ تم دعمه من قبل زمالة ما بعد الدكتوراه من Fondation ARC.

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
Anti-mouse IgG1 647Thermo-FisherA21240
Anti-mouse IgG2A 488Thermo-FisherA21131
Anti-rabbit 546Thermo-FisherA11035
Arl13bNeuroMab73-287
EMS 16% Paraformaldehyde Aqueous Solution, EM GradeElectron Microscopy Sciences15710
FBSThermo-Fisher10270106
gtubulinSigma-AldrichT5326
Hoechst 33342Thermo-Fisher62249
Integrin a6Biolegend313616
Light Sheet CapillaryZeiss701908
Light Sheet plungerZeiss701998
Low binding Microcentrifuge tubesBioScience27210
Normal Goat Serum Blocking SolutionVector labsS-1000
PBSSigma-Aldrichp3587
SlugCell Signaling Technology9585
Triton-X100Sigma-AldrichT9284
Tween-20Euromedex9005-64-5
UltraPure Low Melting Point AgaroseThermo-Fisher16520050

References

  1. Visvader, J. E., Clevers, H. Tissue-specific designs of stem cell hierarchies. Nature Cell Biology. 18 (4), 349-355 (2016).
  2. Batlle, E., Clevers, H. Cancer stem cells revisited. Nature Medicine. 23 (10), 1124-1134 (2017).
  3. Clevers, H. Modeling Development and Disease with Organoids. Cell. 165 (7), 1586-1597 (2016).
  4. Guen, V. J., et al. EMT programs promote basal mammary stem cell and tumor-initiating cell stemness by inducing primary ciliogenesis and Hedgehog signaling. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. , (2017).
  5. Hendriks, D., Clevers, H., Artegiani, B. CRISPR-Cas Tools and Their Application in Genetic Engineering of Human Stem Cells and Organoids. Cell Stem Cell. 27 (5), 705-731 (2020).
  6. Satir, P., Pedersen, L. B., Christensen, S. T. The primary cilium at a glance. Journal of Cell Science. 123, 499-503 (2010).
  7. Guen, V. J., Prigent, C. Targeting Primary Ciliogenesis with Small-Molecule Inhibitors. Cell Chemical Biology. 27 (10), 1224-1228 (2020).
  8. Goetz, S. C., Anderson, K. V. The primary cilium: a signalling centre during vertebrate development. Nature Reviews Genetics. 11 (5), 331-344 (2010).
  9. Han, Y. G., et al. Hedgehog signaling and primary cilia are required for the formation of adult neural stem cells. Nature Neuroscience. 11 (3), 277-284 (2008).
  10. Tong, C. K., et al. Primary cilia are required in a unique subpopulation of neural progenitors. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (34), 12438-12443 (2014).
  11. Wilson, M. M., Weinberg, R. A., Lees, J. A., Guen, V. J. Emerging Mechanisms by which EMT Programs Control Stemness. Trends in Cancer. 6 (9), 775-780 (2020).
  12. Hilgendorf, K. I., et al. Omega-3 Fatty Acids Activate Ciliary FFAR4 to Control Adipogenesis. Cell. 179 (6), 1289-1305 (2019).
  13. Joiner, A. M., et al. Primary Cilia on Horizontal Basal Cells Regulate Regeneration of the Olfactory Epithelium. Journal of Neuroscience. 35 (40), 13761-13772 (2015).
  14. Bangs, F. K., Schrode, N., Hadjantonakis, A. K., Anderson, K. V. Lineage specificity of primary cilia in the mouse embryo. Nature Cell Biology. 17 (2), 113-122 (2015).
  15. van Ineveld, R. L., Ariese, H. C. R., Wehrens, E. J., Dekkers, J. F., Rios, A. C. Single-Cell Resolution Three-Dimensional Imaging of Intact Organoids. Journal of Visualized Experiments. (160), e60709 (2020).
  16. Pleguezuelos-Manzano, C., et al. Establishment and Culture of Human Intestinal Organoids Derived from Adult Stem Cells. Current Protocols in Immunology. 130 (1), 106 (2020).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved