Dreidimensionale Bildgebung von Organoiden zur Untersuchung der primären Ziliogenese während der ex vivo Organogenese

Zusammenfassung

Aus Stammzellen gewonnene Organoide erleichtern die Analyse molekularer und zellulärer Prozesse, die die Selbsterneuerung und Differenzierung von Stammzellen während der Organogenese in Säugetiergeweben regulieren. Hier stellen wir ein Protokoll zur Analyse der Biologie des primären Ziliums in Mamma-Organoiden der Maus vor.

Zusammenfassung

Organoide sind aus Stammzellen gewonnene dreidimensionale Strukturen, die ex vivo die komplexe Architektur und Physiologie von Organen reproduzieren. Daher stellen Organoide nützliche Modelle dar, um die Mechanismen zu untersuchen, die die Selbsterneuerung und Differenzierung von Stammzellen bei Säugetieren steuern, einschließlich der primären Ziliogenese und der ziliären Signalübertragung. Die primäre Ziliogenese ist der dynamische Prozess des Zusammensetzens des primären Ziliums, eines wichtigen zellulären Signalzentrums, das die Selbsterneuerung und/oder Differenzierung der Stammzellen in verschiedenen Geweben steuert. Hier präsentieren wir ein umfassendes Protokoll für die Immunfluoreszenzfärbung von Zelllinien- und primären Zilienmarkern in ganzmontierbaren Maus-Mamma-Organoiden für die Lichtblattmikroskopie. Wir beschreiben das bildgebende Verfahren der Mikroskopie und eine Bildverarbeitungstechnik zur quantitativen Analyse der primären Zilienanordnung und -länge in Organoiden. Dieses Protokoll ermöglicht eine präzise Analyse von primären Zilien in komplexen dreidimensionalen Strukturen auf Einzelzellebene. Diese Methode ist anwendbar für die Immunfluoreszenzfärbung und Bildgebung von primären Zilien und ziliären Signalwegen in Brustorganoiden, die aus normalen und genetisch veränderten Stammzellen, aus gesunden und pathologischen Geweben gewonnen wurden, um die Biologie des primären Ziliums in Gesundheit und Krankheit zu untersuchen.

Einleitung

Die Entwicklung mehrzelliger Organismen und die Aufrechterhaltung der Homöostase in ihren adulten Geweben beruhen auf einer fein abgestimmten Regulation zwischen Selbsterneuerung und Differenzierung der Stammzellen, die zeitlich und räumlich die normale Gewebeentwicklung und -regeneration orchestrieren¹. Die Unterwanderung dieser Regulation führt zu Entwicklungsanomalien und Krebs². Daher ist das Verständnis der molekularen und zellulären Mechanismen, die die Selbsterneuerung und Differenzierung von Stammzellen orchestrieren, von zentralem Interesse für die Entwicklungs- und Krebsbiologie.

Die jüngste Entwicklung von ex vivo-Organogenesemethoden, bei denen Gewebestammzellen dreidimensionale Organoide erzeugen, hat unsere Fähigkeiten zur Untersuchung der Dynamik von Stammzellen während der Organogenese von Säugetieren und zur Aufrechterhaltung der Gewebehomöostase in einer Schale verändert³. Organoide stellen eine gute Alternative zu umständlichen gentechnisch veränderten Tiermodellen dar, um diese Prozesse zu untersuchen. Inzwischen wurden Protokolle für die Entwicklung von Organoiden aus Gewebestammzellen vieler Organe entwickelt³, darunter Dünndarm und Dickdarm, Magen, Leber, Bauchspeicheldrüse, Prostata und Brustdrüse³. Darüber hinaus ermöglicht die Entwicklung somatischer Genom-Editing-Techniken in organoidbildenden Stammzellen nun eine schnelle Untersuchung der molekularen und zellulären Mechanismen, die ihre Biologie steuern ^4,5.

Das primäre Zilium ist eine auf Mikrotubuli basierende Struktur, die an der Oberfläche von Stammzellen und/oder differenzierten Zellen verschiedener Gewebe angeordnet ist⁶. Es ist im Allgemeinen unbeweglich und wird als eine einzige Struktur pro Zelle zusammengesetzt⁷. Die primäre Ziliogenese ist der dynamische Prozess des Zusammensetzens des primären Ziliums⁷. An der Zelloberfläche fungiert das Zilium als zelluläre Signalplattform⁸. Daher wird angenommen, dass das primäre Zilium als Schlüsselregulator der Selbsterneuerung und/oder Differenzierung von Stammzellen in vielen Geweben fungiert, darunter das Gehirn ^9,10, die Brustdrüse ^4,11, das Fettgewebe¹² und das olfaktorische Epithel¹³. Die primäre Ziliogenese und/oder die ziliäre Signalgebung werden in verschiedenen Zelllinien und in verschiedenen Entwicklungsstadien dynamisch reguliert ^4,13,14, aber die zugrunde liegenden Mechanismen müssen noch weitgehend bestimmt werden.

Die Ex-vivo-Organogenese ist vielversprechend für die Entwicklung von Grundlagenwissen über die molekularen und zellulären Mechanismen, die die Stammzellbiologie steuern, einschließlich der primären Ziliogenese und der ziliären Signalwege. Es beruht jedoch auf der Fähigkeit, ganze Mount Organoide auf Einzelzellebene und auf subzellulärer Ebene korrekt abzubilden. Wir haben kürzlich ein Organoidmodell aus Maus-Mammastammzellen verwendet, um zu zeigen, dass primäre Zilien die Organoidbildungskapazität von Bruststammzellen der Maus positiv steuern⁴. In dieser Arbeit stellen wir ein umfassendes Protokoll für die Immunfluoreszenzfärbung von Mamma-Organoiden der Ganzmontierung der Maus vor (Abbildung 1A,B), das die Analyse primärer Zilien durch Lichtblattmikroskopie während der ex vivo Organogenese in drei Dimensionen ermöglicht. Kürzlich wurden alternative Methoden für die Immunfluoreszenzfärbung und Bildgebung von Organoiden mittels konfokaler Mikroskopie veröffentlicht^15,16. Dieses Protokoll konzentriert sich stattdessen auf die Präparation und Bildgebung von Organoiden durch Lichtblattmikroskopie.

Protokoll

HINWEIS: Das folgende Protokoll wird für die Färbung von Organoiden empfohlen, die in 5 Vertiefungen einer 96-Well-Platte gezüchtet und zusammen gepoolt wurden (> 100 Organoide). Organoide wurden aus Bruststammzellen von Mäusen gewonnen. Die Spendermäuse wurden in Übereinstimmung mit den vom Tierpflegeausschuss der Universität Rennes (Frankreich) genehmigten Protokollen untergebracht und behandelt.

1. Reagenzien

1. Zur Herstellung der Fixierlösung verdünnen Sie 125 μl 16 % wässrige Paraformaldehyd (PFA)-Lösung in 375 μl phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS), um eine 4 %ige PFA-Lösung zu erhalten.
   VORSICHT: Manipulieren Sie PFA, das eine giftige Substanz ist, unter einer chemischen Haube.
2. Zur Herstellung des Permeabilisierungspuffers 1,5 μl Triton X100 in 500 μl PBS verdünnen, um eine 0,3%ige Triton X100-Lösung herzustellen.
3. Zur Herstellung des Blockierungspuffers verdünnen Sie 1,5 μl Tween-20 und 75 μl normales Ziegenserum in PBS, um eine 5%ige Ziegenserum-0,1%ige Tween-20-Lösung zu erhalten.
4. Zur Herstellung des Einbettmediums für leichte Bleche wird 1 g hochreine Agarose mit niedrigem Schmelzpunkt in 100 mL dH20 oder PBS bei 65 °C gelöst. Bereiten Sie 1 ml Aliquote vor und lagern Sie sie bei Raumtemperatur.

2. Wiederherstellung von Organoiden

1. Übertragen Sie die Organoide aus den Kulturvertiefungen in ein 1,7-ml-Polymerröhrchen mit geringer Bindung, nachdem Sie sie 3 Mal in den Vertiefungen auf und ab pipettiert haben, mit einer FBS-beschichteten Spitze, für die das Ende abgeschnitten wurde (minimaler Durchmesser des Endes 1,5 mm).
   HINWEIS: Die Beschichtung verhindert, dass Organoide an der Spitze haften bleiben. Das niedrig bindende Polymermaterial ermöglicht es, die Anheftung von Organoiden an der Seite des Röhrchens während des gesamten Färbevorgangs zu reduzieren.
2. Füllen Sie die Tube mit PBS und schleudern Sie sie 3 Minuten lang bei 350 x g herunter. Entfernen Sie den Überstand.

3. Fixierung, Permeabilisierung und Blockierung

1. Resuspendieren Sie die Organoide in 500 μl 4% PFA. 30 min bei Raumtemperatur inkubieren. Bei 350 x g für 30 s nach unten drehen. Entfernen Sie den Überstand.
   HINWEIS: Ab diesem Schritt resuspendieren Sie Organoide in den verschiedenen Puffern, indem Sie die Puffer einfach auf das Organoidpellet geben, ohne sie zu berühren. Führen Sie alle Waschschritte bei Raumtemperatur durch.
2. Waschen Sie die Organoide mit 1 mL PBS für 3 min. Bei 350 x g für 30 s nach unten drehen. Entfernen Sie den Überstand.
   PAUSE: Fixierte Organoide können mindestens eine Woche lang bei PBS bei 4 °C gehalten werden.
3. Permeabilisieren Sie die Organoide, indem Sie sie in 500 μl PBS-Triton X100 0,3% resuspendieren und 30 Minuten lang bei Raumtemperatur inkubieren. Schleudern Sie die Organoide bei 350 g für 30 s herunter.
4. Waschen Sie die Organoide, indem Sie sie mit 1 ml PBS resuspendieren und 3 Minuten lang inkubieren. Bei 350 x g für 30 s nach unten drehen. Entfernen Sie den Überstand. Wiederholen Sie den Vorgang einmal.
5. Optional: Resuspendieren Sie die Organoide in 500 μL eiskaltem Methanol. Inkubieren bei - 20 °C für 10 min. Dieser Schritt kann für die Färbung spezifischer zentrosomaler Marker erforderlich sein.
6. Optional (wenn Schritt 5 durchgeführt wurde): Waschen Sie die Organoide 3 Minuten lang mit 1 mL PBS. Bei 350 x g für 30 s nach unten drehen. Entfernen Sie den Überstand. Wiederholen Sie den Vorgang einmal.
7. Blockieren Sie unspezifische Antikörperbindungsstellen in Organoiden, indem Sie sie mit 500 μl Blockierungspuffer (PBS, 5 % Ziegenserum, 0,1 % Tween 20) resuspendieren. 1 h und 30 min bei Raumtemperatur inkubieren. Bei 350 g für 30 s runterschleudern. Entfernen Sie den Überstand.
8. Waschen Sie die Organoide, indem Sie sie mit 1 ml PBS resuspendieren und 3 Minuten lang inkubieren. Bei 350 x g für 30 s nach unten drehen. Entfernen Sie den Überstand.

4. Etikettierung

1. Die Organoide werden mit 200 μl Blockierungspuffer mit verdünnten Primärantikörpern resuspendiert und über Nacht bei 4 °C unter leichtem Schütteln (60 U/min auf einem horizontalen Schüttler) inkubiert. Platzieren Sie die Röhrchen in einem Winkel von 45° mit dem horizontalen Grundriss des Schüttlers. Dadurch werden die Organoide am Boden der Röhrchen im Färbepuffer gehalten.
2. Waschen Sie die Organoide, indem Sie sie mit 1 ml PBS resuspendieren und 5 Minuten lang inkubieren. Bei 350 x g für 30 s nach unten drehen. Entfernen Sie den Überstand. Wiederholen Sie den Vorgang zweimal.
   HINWEIS: Einige Organoide im letzten Schritt können an der Seite des Röhrchens haften bleiben, was zu einem Organoidverlust während der Aspiration des Überstands nach der Zentrifugation führt. Die Zugabe von 0,2 % (w/v) Rinderserumalbumin (BSA) zum PBS in den Waschschritten kann den Organoidverlust verringern.
3. Die Organoide werden mit 200 μl Blocking-Puffer mit Sekundärantikörpern resuspendiert und 1 h und 30 min unter leichtem Schütteln (60 U/min auf einem horizontalen Schüttler) inkubiert. Platzieren Sie die Röhrchen in einem Winkel von 45° mit dem horizontalen Grundriss des Schüttlers. Dadurch werden die Organoide am Boden der Röhrchen im Färbepuffer gehalten.
   HINWEIS: Hoechst (oder andere nukleare Farbstoffe wie DAPI oder DRAQ5) können dem Puffer mit Sekundärantikörpern zugesetzt werden.
4. Waschen Sie die Organoide, indem Sie sie mit 1 ml PBS resuspendieren und 5 Minuten lang inkubieren. Bei 350 x g für 30 s nach unten drehen. Entfernen Sie den Überstand. Wiederholen Sie den Vorgang zweimal.
   HINWEIS: Einige Organoide im letzten Schritt können an der Seite des Röhrchens haften bleiben, was zu einem Organoidverlust während der Aspiration des Überstands nach der Zentrifugation führt. Die Zugabe von 0,2 % (w/v) BSA zum PBS in den Waschschritten kann den Organoidverlust verringern.

5. Vorbereitung der Agarose-Probe für die Bildgebung

1. Schmelzen Sie das Einbettmedium für leichte Bleche, indem Sie es bei 65 °C inkubieren. Sobald das Medium geschmolzen ist, inkubieren Sie es 5 Minuten lang bei 37 °C.
2. Die Organoide werden in 100 μl Eindeckmedium mit einer 200-μl-Spitze resuspendiert, wobei das Ende der Spitze abgeschnitten wird (minimale Größe der Extremität: 1,5 mm), indem zweimal auf und ab pipettiert wird.
3. Saugen Sie das Einbettmedium mit den Organoiden in einer Glaskapillare (grüne Kapillare, Innendurchmesser: 1,5 mm) mit einem Kolben an. Inkubieren Sie die Kapillare 5 Minuten lang bei Raumtemperatur, damit sich das Einbettmedium verfestigt.
   PAUSE: Kapillaren können vor der Bildgebung eine Woche lang bei 4 °C in PBS gelagert werden.

6. Bildgebung

1. Mit einem Lichtblattmikroskop (z.B. ZEISS Lightsheet Z.1) bilden Sie die Organoide mit 20x oder 40x Wasserimmersionsobjektiven ab.
   1. Platzieren Sie die Glaskapillare in der Beobachtungskammer. Lokalisieren Sie die Kapillare mit der Frontkamera und platzieren Sie die Spitze der Glaskapillare an der oberen Grenze des Detektionsobjektivs.
   2. Wählen Sie die Probe aus und stellen Sie den optimalen Fokus mit der Spitze der Glaskapillare bei Hellfeldbeleuchtung ein. Schieben Sie die Agarose-Probe langsam aus der Kapillare heraus und lokalisieren Sie Organoide in der erstarrten Agarose.
   3. Bewahren Sie die abzubildenden Organoide in der Nähe der Kapillarspitze auf, um Bewegungen der Agaroseprobe im PBS zu reduzieren. Drehen Sie die Kapillare, um die optimale Probenausrichtung einzustellen und den gewünschten Zoom zu definieren.
   4. Wählen Sie den Aufnahmemodus aus. Definieren Sie die zu bebildernden Kanäle, stellen Sie die richtige Ausrichtung des Lichtblatts ein, stellen Sie die Laserleistung für jeden Kanal ein (um Photobleaching zu reduzieren, verwenden Sie eine niedrige Laserleistung), stellen Sie die Größe des Bildes und die gewünschte(n) Beleuchtungsseite(n) ein. Beispiel für Bildparameter: Bildgröße 1920 x 1920, Beleuchtung: beidseitig.
   5. Definieren Sie den Z-Stapel für das Bild, indem Sie die Z-Enden des Stapels mit dem Z-Stapel-Modul festlegen und die Z-Schrittgröße auf optimal festlegen.
2. Verarbeiten Sie die Ausgabedatei mit dem Bildverarbeitungsmodul der Mikroskopsoftware, um in der Probe zu navigieren, eine Z-Projektion und eine 3D-Darstellung zu erhalten.
3. Drehen Sie die Probe und nehmen Sie ein neues Bild aus einem anderen Winkel oder andere Organoide auf.
4. Analysieren Sie Bilder mit einer interaktiven Mikroskopie-Bildanalysesoftware (z. B. Imaris), die (i) die Visualisierung der Probe in 3D, (ii) die Segmentierung von Objekten, (iii) die Identifizierung und quantitative Analyse von Objekten ermöglicht.

Ergebnisse

Ex-vivo-Organogenese-Methoden verändern unsere Möglichkeiten, die Entwicklung von Säugetiergewebe und die Aufrechterhaltung der Gewebehomöostase in einer Schale zu untersuchen. Die Analyse molekularer und zellulärer Mechanismen, die diese Prozesse regulieren, einschließlich der primären Ziliogenese und der ziliären Signalübertragung, beruht auf der Fähigkeit, Organoide dreidimensional abzubilden.

Das oben beschriebene Protokoll ermöglicht ...

Diskussion

Das hier vorgestellte detaillierte Protokoll ermöglicht die Färbung und Bildgebung von Maus-Mamma-Organoiden, die in halbfestem Medium wachsen. Dieses Protokoll ist vermutlich auf die Färbung von Organoiden anwendbar, die die Architektur verschiedener Gewebe nachahmen, die in halbfesten und festen Medien wachsen. Bei Organoiden, die in 100% Matrigel mit Medium darüber wachsen, unterscheiden sich die Rückgewinnungs- und Fixierungsschritte geringfügig. Das Nährmedium muss aus der Ku...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
Anti-mouse IgG1 647	Thermo-Fisher	A21240
Anti-mouse IgG2A 488	Thermo-Fisher	A21131
Anti-rabbit 546	Thermo-Fisher	A11035
Arl13b	NeuroMab	73-287
EMS 16% Paraformaldehyde Aqueous Solution, EM Grade	Electron Microscopy Sciences	15710
FBS	Thermo-Fisher	10270106
gtubulin	Sigma-Aldrich	T5326
Hoechst 33342	Thermo-Fisher	62249
Integrin a6	Biolegend	313616
Light Sheet Capillary	Zeiss	701908
Light Sheet plunger	Zeiss	701998
Low binding Microcentrifuge tubes	BioScience	27210
Normal Goat Serum Blocking Solution	Vector labs	S-1000
PBS	Sigma-Aldrich	p3587
Slug	Cell Signaling Technology	9585
Triton-X100	Sigma-Aldrich	T9284
Tween-20	Euromedex	9005-64-5
UltraPure Low Melting Point Agarose	Thermo-Fisher	16520050