JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • النتائج
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

هنا ، يقدم البروتوكول تحضير محلول نارينجينين للإعطاء داخل الصفاق في الجسم الحي . يذوب نارينجينين بالكامل في خليط من ثنائي ميثيل سلفوكسيد وتوين 80 والمالحة. تم تقييم التأثيرات المضادة لهشاشة العظام للنارينجينين عن طريق اختبار الجلوكوز في الدم ، وتلطيخ الفوسفاتيز الحمضي المقاوم للطرطرات ، ومقايسة الممتز المناعي المرتبط بالإنزيم.

Abstract

يعد تحضير محلول مركب (كيميائي نباتي) خطوة يتم التغاضي عنها ولكنها حاسمة قبل تطبيقه في دراسات مثل فحص الأدوية. الذوبان الكامل للمركب ضروري للاستخدام الآمن والنتائج المستقرة نسبيا. هنا ، يتم عرض بروتوكول لإعداد محلول نارينجينين وإدارته داخل الصفاق في نظام غذائي عالي الدهون ونموذج السكري الناجم عن الستربتوزوتوسين (STZ) كمثال. تم استخدام كمية صغيرة من نارينجينين (3.52-6.69 مجم) لاختبار ذوبانه في المذيبات ، بما في ذلك الإيثانول وثنائي ميثيل سلفوكسيد (DMSO) و DMSO بالإضافة إلى Tween 80 المعاد تشكيله في محلول ملحي فسيولوجي (PS) ، على التوالي. يتم تحديد الذوبان الكامل للمركب من خلال مراقبة لون المحلول ، أو وجود رواسب بعد الطرد المركزي (2000 × جم لمدة 30 ثانية) ، أو السماح للمحلول بالوقوف لمدة 2 ساعة في درجة حرارة الغرفة (RT). بعد الحصول على مركب مستقر / محلول كيميائي نباتي ، يمكن تحضير التركيز / الكمية النهائية للمركب المطلوب للدراسات في الجسم الحي في محلول مخزون مذيب فقط (بدون PS) ، ثم تخفيفه / خلطه مع PS حسب الرغبة. تم تقييم التأثيرات المضادة لهشاشة العظام للنارينجينين في الفئران (الإعطاء داخل الصفاق عند 20 مغ/كغ من وزن الجسم، 2 مغ/مل) عن طريق قياس نسبة الجلوكوز في الدم، وكتلة العظام (التصوير المقطعي المحوسب الدقيق)، ومعدل ارتشاف العظام (تلطيخ TRAP وELISA). سيستفيد الباحثون الذين يبحثون عن مستحضرات مفصلة للمحلول العضوي / الكيميائي النباتي من هذه التقنية.

Introduction

مع زيادة الدراسات المتعلقة باستخدام المركبات الكيميائية النباتية لفحص الأدوية ، فإن مناهج إعداد المحاليل الكيميائية النباتية لتقييم آثارها المثلى تستحق الاهتمام بها. يجب مراعاة العديد من الجوانب مثل منهجية الذوبان والجرعة والتركيز عند تحضير المركب1.

يستخدم الذوبان القائم على المذيبات على نطاق واسع لإعداد المركب العضوي1. تشمل المذيبات شائعة الاستخدام الماء والزيت وثنائي ميثيل سلفوكسيد (DMSO) والميثانول والإيثانول وحمض الفورميك والمراهقين والجلسرين وما إلى ذلك2. على الرغم من أن التعليق بمواد غير مذابة يكون مقبولا عندما يتم إعطاء المركب عن طريق التجويف المعدي ، إلا أن المذاب المذاب بالكامل أمر بالغ الأهمية للإعطاء عن طريق الوريد. نظرا لأن محلول الزيت والتعليق والمستحلب يمكن أن يسبب انسدادات شعرية ، يقترح وجود محلول مائي لإعداد المركب ، خاصة عند إعطاء الحقن في الوريد والعضل وداخل الصفاق3.

يختلف نطاق الجرعة الفعالة بين المركبات وحتى بين الأمراض التي تعالج بنفس المركب. تعتمد تحديد الجرعة الفعالة والآمنة والتركيز على الأدبيات والتجارب الأولية4. هنا ، يتم توضيح إعداد مركب naringenin كمثال.

تمت دراسة Naringenin (4،5،7-trihydroxy-flavanone) ، وهو مركب بوليفينول ، في علاج الأمراض ل hepatoprotective5 ، ومضاد لمرض السكر6 ، ومضاد للالتهابات7 ، وأنشطة مضادة للأكسدة8. بالنسبة للتطبيقات في الجسم الحي ، يشيع استخدام تناول نارينجينين عن طريق الفم. أفادت الدراسات السابقة عن تحضير محلول نارينجينين في 0.5٪ -1٪ كربوكسي ميثيل السليلوز ، وجرعة 0.5٪ ميثيل سلولوز ، و 0.01٪ DMSO ، ومحلول ملحي فسيولوجي (PS) عند 50-100 مجم / كجم ، يتم إعطاؤه عن طريق التجويف الفموي9،10،11،12. إلى جانب ذلك ، أبلغت دراسات أخرى عن مكملات نارينجينين مع تشاو بنسبة 3٪ (بالوزن / الوزن) للتناول الفموي بجرعة 3.6 جم / كجم / يوم13,14. وقد أبلغت الدراسات أيضا عن استخدام الإيثانول (0.5٪ v / v) و PS و DMSO لإذابة نارينجينين للحقن داخل الصفاق عند 10-50 مجم / كجم15،16،17،18. في دراسة لصرع الفص الصدغي ، تلقت الفئران حقنة نارينجينين معلقة في 0.25٪ كربوكسي ميثيل السليلوز المذاب في PS19. على الرغم من أن هذه الدراسات تشير إلى استخدام مذيبات مختلفة لإعداد محاليل نارينجينين ، إلا أنه لم يتم الإبلاغ عن مزيد من التفاصيل ، مثل حالة الذوبان واستجابة الحيوان.

يقدم هذا البروتوكول إجراء لإعداد محلول نارينجينين للتطبيق في الجسم الحي في هشاشة العظام الناجمة عن مرض السكري. يتضمن تحضير محلول الحقن تحضير المذيبات والمركبات وتقدير الجرعة وعملية الذوبان والترشيح. تم تحديد الجرعة بناء على أبحاث الأدبيات والتجارب الأولية من خلال مراقبة الفئران بعد إعطاء الحقن كل يوم لمدة 3 أيام وتعديل الجرعة وفقا لسلوكيات الفئران. تم إعطاء التركيز النهائي المختار (20 مغ / كغ من وزن الجسم) داخل الصفاق 5 أيام في الأسبوع لمدة 8 أسابيع في نظام غذائي غني بالدهون والفئران السكرية التي يسببها الستربتوزوتوسين (STZ)20,21. تم تقييم آثار نارينجينين في هشاشة العظام السكري عن طريق اختبار الجلوكوز في الدم ، والتصوير المقطعي المحوسب الدقيق ، وتلطيخ حمض الفوسفاتيز المقاوم للطرطرات (TRAP) ، ومقايسة الممتز المناعي المرتبط بالإنزيم (ELISA).

بشكل عام ، لوحظ أن نارينجينين في نطاق تركيز 40-400 ملغم / مل لم يذوب تماما في الإيثانول أو DMSO أو 5٪ (الإيثانول أو DMSO) بالإضافة إلى 95٪ PS (v / v). ومع ذلك ، يذوب نارينجينين تماما في خليط من 3.52٪ DMSO و 3.52٪ توين 80 و 92.96٪ PS. سيساعد الإجراء التفصيلي الباحثين على تحضير المركب كمحلول حقن للتطبيق في الجسم الحي .

Protocol

تتوافق التحقيقات الموصوفة مع المبادئ التوجيهية لرعاية واستخدام المختبر التابعة للمجلس الوطني للبحوث وتمت الموافقة عليها من قبل لجنة رعاية واستخدام الحيوانات بجامعة شنغهاي للطب الصيني التقليدي. عند إجراء التجارب ، يلزم استخدام معاطف المختبر وقفازات النتريل التي تستخدم لمرة واحدة والنظارات الواقية لأغراض السلامة.

1. تحضير المذيبات وتقدير النارينجينين المطلوب للتطبيق في الجسم الحي

  1. تحضير المذيبات التالية: Tween-80 (نطاق التركيز النهائي: 0.5٪ -1٪) ، DMSO ، الجليسرين (نطاق التركيز النهائي: 15٪ -20٪) ، الإيثانول (نطاق التركيز النهائي: 12٪ للحقن العضلي)22 ، و 0.9٪ PS.
  2. تقدير كمية نارينجينين المطلوبة بناء على الجرعة وعدد الفئران وتكرار الحقن.
    1. اطلب 10 فئران (C57BL / 6 ، ذكر ، عمر 5 أسابيع ، عامل حماية من الشمس) لإدارة نارينجينين 5 أيام في الأسبوع لمدة 8 أسابيع. احتفظ بالفئران في ظروف محددة خالية من مسببات الأمراض (SPF).
      ملاحظة: الجرعة المطلوبة للحقن داخل الصفاق هي 20 ملغ/كغ من وزن الجسم 23.
    2. تزن 160 مجم من نارينجينين بناء على الحساب التالي: 20 مجم / كجم × 0.02 كجم / فأر × 10 فئران × 5 أيام / أسبوع × 8 أسابيع = 160 مجم.
  3. احسب تركيز نارينجينين المراد حقنه في الجسم الحي.
    1. تحضير الحجم الموصى به على أساس وزن الجسم من الفئران. الحجم الموصى به من naringenin المطبق على كل فأر هو 1 ٪ من وزن الجسم (0.3 مل). في هذه التجربة ، تم استخدام 0.2 مل لكل ماوس.
    2. احسب الحجم الإجمالي: 0.2 مل لكل ماوس × 10 ماوس × 5 أيام / أسبوع × 8 أسابيع = 80 مل.
    3. احسب تركيز Naringenin في المخزون: 160 مجم / 80 مل من المذيبات = 2 مجم / مل.
    4. احسب الحجم لكل يوم: 0.2 مل لكل ماوس × 10 فئران = 2 مل.

2. الحل

  1. حل الإيثانول
    1. لتحضير محلول نارينجينين عند 2 ملغم/مل، تزن 3.52 ملغ من نارينجينين وتضاف إلى أنبوب سعة 2.0 مل.
      ملاحظة: لتحقيق تركيز 2 ملغم / مل ، سيكون الحجم الإجمالي المطلوب 1760 ميكرولتر (الحساب: 3.52 مجم / 1760 ميكرولتر = 2 مجم / مل).
    2. قم بالدوران بسرعة (2000 × جم لمدة 30 ثانية) لجعل مسحوق نارينجينين يستقر في قاع الأنبوب (الشكل 1 أ).
    3. أضف 8.8 ميكرولتر من الإيثانول بنسبة 100٪ إلى الأنبوب لتحضير محلول 0.5٪ (v / v) فيما يتعلق بالحجم الكلي المطلوب2. نارينجينين لا يذوب تماما (الشكل 1 ب).
    4. استمر في إضافة 79.2 ميكرولتر من الإيثانول بنسبة 100٪ إلى الأنبوب لتحضير محلول 5٪ (v / v) فيما يتعلق بالحجم الإجمالي المطلوب (الحساب: (79.2 ميكرولتر + 8.8 ميكرولتر) / 1760 ميكرولتر × 100٪ = 5٪). نارينجينين لا يذوب تماما (الشكل 1 ب).
    5. أضف 1672 ميكرولتر من 0.9٪ PS إلى الأنبوب الذي يحتوي على 5٪ إيثانول كما هو موضح في الخطوة 2.1.4. سيؤدي ذلك إلى إنتاج مستحلب (الشكل 1 د). جهاز طرد مركزي (2000 × جم لمدة 30 ثانية) الحل للتحقق مما إذا كان نارينجينين يذوب تماما في المحلول. تظهر رواسب بيضاء من نارينجينين غير المذاب في المحلول (الشكل 1E).
  2. حل DMSO
    1. لتحضير محلول نارينجينين عند 2 ملغم/مل، تزن 3.95 ملغ من نارينجينين وتضاف إلى أنبوب سعة 2.0 مل.
      ملاحظة: لتحقيق تركيز 2 ملغم / مل ، سيكون الحجم الإجمالي المطلوب 1975 ميكرولتر (الحساب: 3.95 ملغم / 1975 ميكرولتر = 2 ملغم / مل).
    2. تدور بسرعة لأسفل (2000 × غرام لمدة 30 ثانية) لجعل مسحوق نارينجينين يستقر في الجزء السفلي من الأنبوب.
    3. أضف 9.8 ميكرولتر من DMSO إلى الأنبوب لتحضير محلول 0.5٪ (v / v) (الحساب: 9.8 ميكرولتر / 1975 ميكرولتر × 100٪ = 5٪). نارينجينين يذوب تماما (الشكل 2 أ).
    4. أضف 88.2 ميكرولتر من DMSO إلى الأنبوب لتحضير محلول 5٪ (v / v) فيما يتعلق بالحجم الإجمالي المطلوب (الحساب: (88.2 ميكرولتر + 9.8 ميكرولتر) / 1975 ميكرولتر × 100٪ = 5٪). نارينجينين يذوب تماما (الشكل 2 ب).
    5. أضف 1877 ميكرولتر من 0.9٪ PS (v / v ٪ من 95٪) إلى المحلول المعد في الخطوة 2.2.4. يتم إنتاج مستحلب (الشكل 1C). جهاز طرد مركزي (2000 × جم لمدة 30 ثانية) الحل للتحقق مما إذا كان نارينجينين يذوب تماما في المحلول. تظهر رواسب بيضاء من نارينجينين غير المذاب في المحلول (الشكل 1 د).
  3. حل توين -80 و DMSO
    1. لتحضير محلول نارينجينين عند 2 ملغم/مل، تزن 6.69 ملغ من النارينجينين وتضاف إلى أنبوب سعة 5.0 مل.
      ملاحظة: لتحقيق التركيز النهائي البالغ 2 مجم / مل ، سيكون إجمالي حجم المحلول المطلوب 3345 ميكرولتر (الحساب: 6.69 مجم / 3345 ميكرولتر = 2 مجم / مل).
    2. تدور بسرعة لأسفل (2000 × غرام لمدة 30 ثانية) لجعل مسحوق نارينجينين يستقر في الجزء السفلي من الأنبوب.
    3. أضف 117.7 ميكرولتر من DMSO لإعداد محلول 3.5٪ (v / v) فيما يتعلق بالحجم الإجمالي المطلوب (الحساب: 117.7 ميكرولتر / 3345 ميكرولتر × 100٪ = 3.5٪). نارينجينين يذوب تماما (الشكل 3 أ)
    4. أضف 117.7 ميكرولتر من توين 80 إلى المحلول المعد في الخطوة 2.3.3 لتحقيق 3.5٪ (v / v) توين 80 و 3.5٪ (v / v) DMSO. مراقبة الذوبان الكامل للنارينجينين (الشكل 3 ب)
    5. أضف ببطء المحلول المحضر في الخطوة 2.3.4 إلى أنبوب سعة 5.0 مل يحتوي على 3109.6 ميكرولتر من 0.9٪ PS (v / v بالمائة من 93٪) ورجه جيدا للحصول على محلول نارينجينين ظاهر (الشكل 3C).
    6. دع الحل الذي تم إعداده في الخطوة 2.3.5 يبقى في درجة حرارة الغرفة (RT) لمدة 2 ساعة. لا يزال المحلول واضحا بدون أي رواسب مرئية (الشكل 3 د).
  4. تحضير محلول نارينجينين للإدارة في الجسم الحي
    1. وفقا للخطوة 1.2.2 ، تزن 160 مجم من نارينجينين (160 مجم / 2 مجم / مل = 80 مل).
    2. أضف 2.8 مل من DMSO للحصول على حل 3.5٪ (v / v) (الحساب: 2.8 مل / 80 مل × 100٪ = 3.5٪)
    3. ثم أضف 2.8 مل من توين 80 إلى الحل المعد في الخطوة 2.4.2 لتحقيق 3.5٪ (v / v) توين 80 و 3.5٪ (v / v) DMSO.
    4. احصل على المحلول المحضر في الخطوة 2.4.3 في أربعة أنابيب ، 1.4 مل لكل أنبوب [(2.8 مل + 2.8 مل) / 4 = 1.4 مل].
    5. القسمة 18.6 مل من 0.9٪ PS إلى خمسة أنابيب 15 مل.
    6. قم بتخزين المحلول المحضر في الخطوة 2.4.3 (محلول المخزون) و 2.4.5 عند 4 درجات مئوية (2.8 مل + 2.8 مل + 18.6 مل × 4 = 80 مل).
    7. خذ 140 ميكرولتر من محلول المخزون (الخطوة 2.4.3) واخلطه مع 1860 ميكرولتر من 0.9٪ PS لتحضير 2 مل من محلول نارينجينين لمدة يوم واحد من الإدارة.
    8. قم بتصفية المحلول من خلال مرشح 0.2 ميكرومتر.

3. إدارة حل نارينجينين

  1. التعامل وضبط النفس
    1. رش القفص واليدين بنسبة 70-75٪ كحول قبل فتح الغطاء. ارفع الماوس من قاعدة الذيل وضعه على سطح صلب لوضع ذيله برفق للخلف.
    2. أمسك الرقبة خلف الأذنين بالإبهام الأيسر والسبابة وضع الذيل بين الإصبع الصغير والإصبع الخاتم. حافظ على الماوس في وضع ضعيف مع نهايته الخلفية مرتفعة قليلا.
  2. حقن
    1. أمسك الجلد الخلفي للفأر بحيث يكون جلد البطن مشدودا.
    2. ادفع الإبرة (حقنة الأنسولين) بزاوية 10 درجات بين الإبرة وسطح البطن ، في الربع السفلي الأيمن أو الأيسر من البطن لتجنب ضرب المثانة أو الكبد أو الأعضاء الداخلية الأخرى.
    3. قم بتشغيل الإبرة تحت الجلد في اتجاه الجمجمة لمدة 3-5 مم ، ثم أدخلها بزاوية 45 درجة في تجويف البطن.
    4. عندما تمر الإبرة عبر جدار البطن وتختفي المقاومة ، قم بإجراء طموح للتأكد من عدم سحب أي مادة ارتداد. ثم ادفع الحل ببطء.
    5. بعد الحقن ، اسحب الإبرة ببطء وقم بتدويرها قليلا لمنع التسرب. الحجم الموصى به هو 50-100 ميكرولتر / 10 جم.
    6. تخلص من بقايا نارينجينين في حاوية بيولوجية.

4. اختبار الجلوكوز في الدم

ملاحظة: اختبار نسبة الجلوكوز في الدم 1 يوم قبل الحقن و 1 و 2 أشهر بعد الحقن.

  1. صوم الفئران لمدة 15 ساعة قبل اختبار الجلوكوز في الدم. يمكن الاستمرار في توفير المياه.
  2. افتح شرائط الاختبار وحدد التاريخ. بمجرد فتحها ، استخدم شرائط الاختبار في غضون 3 أشهر. قم بتخزين شرائط الاختبار في درجة حرارة 2-30 درجة مئوية. أغلق الغطاء بإحكام بعد إزالة الشريط لمنع تكوين الرطوبة.
  3. ضع الحيوان في غرفة الحث. قم بتشغيل المرذاذ بمستوى تحريض 4٪ للأيزوفلوران و 4 لتر / دقيقة للأكسجين. بعد تخدير الحيوان بالكامل ، حافظ على المخدر بمخروط الأنف وتسليم المخدر بمستوى 1.5٪ للأيزوفلوران و 0.4 لتر / دقيقة للأكسجين.
  4. امسح الذيل بكرات / مسحات قطنية مبللة بالكحول بنسبة 70٪ -75٪.
  5. بدءا من أدنى نقطة في الذيل ، قم بعمل ثقب صغير على الوريد الجانبي للذيل بوخز إبرة 25G واضغط على قطرة دم.
  6. امسح قطرة الدم بمناديل ورقية.
  7. اعصر قطرة دم أخرى واجمعها على حافة شريط اختبار.
  8. قراءة وتسجيل النتيجة المعروضة على جهاز قياس الجلوكوز.
  9. لوقف النزيف ، قرصة ذيل الماوس بشاش معقم ومسح المنطقة مع الكحول 75 ٪.
  10. يمكن الحصول على عينات إضافية عن طريق تقنية مماثلة تتحرك أعلى الذيل الجمجمة.

5. فخ تلطيخ

  1. إعداد الشرائح
    1. إجراء اختبارات الجلوكوز في الدم الصائم على الفئران مرة واحدة في الأسبوع. عندما تكون مستويات الجلوكوز في الدم ≥ 11.1 مليمول / لتر (مما يدل على نجاح الفئران السكري من النوع الثاني نموذج 24) ، قم بالقتل الرحيم للفئران باستخدام CO2 ، متبوعا بخلع عنق الرحم ، وجمع القطني 4-6عشر (L4-L6) (لا يتم إجراء القتل الرحيم أثناء صيام اختبار الجلوكوز في الدم).
    2. ثبت عينات L4-L6 بنسبة 4٪ بارافورمالدهيد لمدة 24 ساعة (تأكد من أن حجم البارافورمالدهيد >20x حجم الأنسجة) ، ثم اغسل لمدة 2 ساعة في تدفق مستمر لماء الصنبور.
    3. لإزالة الكلس من العينات ، اغمرها في محلول حمض الإيثيلين ديامينيترايتيك (EDTA) بنسبة 10٪ لمدة 2 أسابيع في RT في حالة ثابتة حتى يتم تليين العينات. تأكد من أن حجم محلول إزالة الكلس هو 20-30 ضعف حجم الأنسجة / العينة. قم بتغيير حل EDTA كل يوم.
    4. جفف العينة باستخدام مجفف.
      1. ضع العينات في أشرطة تضمين معالجة الأنسجة. قم بترقيم الكاسيت باستخدام قلم رصاص.
      2. اضبط برنامج المجفف على النحو التالي: 75٪ كحول لمدة 2 ساعة ، 85٪ كحول لمدة 1 ساعة ، 95٪ كحول لمدة 1 ساعة ، 95٪ كحول لمدة 2 ساعة ، إيثانول لا مائي (I) لمدة 2 ساعة ، إيثانول لا مائي (II) لمدة 2 ساعة ، إيثانول لا مائي (III) لمدة 2 ساعة ، زيلين (I) لمدة 1 ساعة ، زيلين (II) لمدة 1 ساعة ، زيلين (III) لمدة 1 ساعة ، شمع البارافين (I) لمدة 2 ساعة ، وشمع البارافين (II) لمدة 2 ساعة ، في RT.
    5. تضمين العينات في شمع البارافين.
      1. أضف شمع البارافين إلى صينية الكاسيت الخاصة بمحطة تضمين البارافين وقم بتسخينه إلى 60 درجة مئوية. اغمر العينات المجففة لمدة 2 ساعة على الأقل.
      2. ضع علبة المناديل في درج الكاسيت وقم بالتسخين المسبق.
      3. يضاف شمع البارافين إلى خزان البارافين ويسخن إلى 60 درجة مئوية.
      4. بعد 2 ساعة ، خذ كل من كاسيت الأنسجة والعينات إلى منطقة العمل. صب شمع البارافين المسخن مسبقا من خزان البارافين في كاسيت الأنسجة. ضع العينة في شمع البارافين ، وتأكد من أن شمع البارافين يغطي الأنسجة بالكامل ، ثم انقل الكاسيت على الفور إلى محطة الجليد.
      5. استخدم ميكروتوم لتقطيع العينات المضمنة بالبارافين إلى أقسام 5-6 ميكرومتر. افتح المقاطع في ماء دافئ 40 درجة مئوية لمدة تقل عن 10 ثوان. اجمع الأقسام الموجودة على APS (أمينو سيلان) شرائح زجاجية مطلية. جفف الشرائح في RT لمدة 1 ساعة ، ثم انقل الشرائح إلى فرن مضبوط على 60 درجة مئوية طوال الليل.
  2. إعداد كاشف TRAP
    1. تحضير محلول حضانة المخزون الأساسي: قم بإذابة 9.2 جم من أسيتات الصوديوم اللامائية ، و 11.4 جم من حمض الطرطريك (+) L ، و 2.8 مل من الحمض الجليدي في 1000 مل من الماء المقطر. اضبط الرقم الهيدروجيني على 4.7-5.0 واحفظه في RT لمدة تصل إلى 6 أشهر.
    2. تحضير محلول النفثول الأثير: قم بإذابة 0.1 جم من فوسفات النفثول AS-BI في 5 مل من إيثيلين جلايكول أحادي إيثيل الأثير. يحفظ في درجة حرارة 4 درجات مئوية لمدة تصل إلى 5 أسابيع.
    3. تحضير محلول نتريت الصوديوم: قم بإذابة 1 جم من نتريت الصوديوم في 25 مل من الماء المقطر. يحفظ في درجة حرارة 4 درجات مئوية.
    4. تحضير صبغة الباروسانيلين: أضف 1 جم من قاعدة الباروسانيلين إلى 20 مل من 2N HCl (83 مل من حمض الهيدروكلوريك في 417 مل من الماء). استخدم صفيحة تقليب لإذابة القاعدة وتصفيتها قبل الاستخدام.
  3. تلطيخ فخ
    1. املأ برطمان كوبلين ب 50 مل من محلول حضانة المخزون الأساسي وضعه في فرن 37 درجة مئوية لمدة 2 ساعة.
    2. خذ جرة كوبلين واحدة وأضف 0.5 مل من محلول نابتول الأثير.
    3. ضع الشرائح في جرة كوبلين واحتضنها عند 37 درجة مئوية لمدة 1 ساعة.
      ملاحظة: قم بإعداد ثلاث شرائح على الأقل لكل مجموعة.
    4. قبل دقائق قليلة من انتهاء وقت الحضانة ، أضف 1 مل من محلول نتريت الصوديوم و 1 مل من صبغة الباروسانيلين. تخلط بلطف لمدة 30 ثانية وتترك لمدة 2 دقيقة.
    5. أضف المحلول المعد في الخطوة 5.2.2 إلى جرة كوبلين الأخرى المسخنة مسبقا والتي تحتوي على محلول المخزون الأساسي. امزج المحلول جيدا وأدخل الشرائح من جرة كوبلين في الخطوة 5.3.3.
    6. احتضان لمدة 15-20 دقيقة في RT.
    7. اشطف الشرائح في جرة كوبلين أخرى مع 200 مل من PBS لمدة 5 دقائق.
    8. قم بتلطيخ الشرائح بنسبة 100٪ هيماتوكسيلين لمدة 30 ثانية في جرة كوبلين.
    9. جفف الشرائح بنسبة 85٪ و 95٪ و 100٪ كحول (200 مل) لمدة دقيقتين لكل منها وعالجها بالزيلين (200 مل) لمدة دقيقتين لمدة 3 مرات. استخدم برطمانات كوبلن لأداء كل خطوة.
    10. قم بتأمين القسم الموجود على زجاج الغطاء باستخدام غطاء باستخدام الراتنج. تأكد من تجنب محاصرة فقاعات الهواء.

6. إليسا

  1. إعداد العينة
    1. إزالة الأنسجة الرخوة من عظم الفخذ والساق من الماوس. تنظيف العظام مع الشاش.
    2. ضع عينات العظام في أنبوب طرد مركزي دقيق سعة 1 مل وقم بتخزين أنابيب العينة عند -80 درجة مئوية.
      ملاحظة: يمكن أيضا تخزين العينات في خزان النيتروجين السائل لمدة لا تزيد عن 6 أشهر.
    3. وزن عينة العظام. تمييع مع 0.9 ٪ PS بنسبة 1:10. على سبيل المثال ، تمييع 0.1 غرام من العظام مع 1 مل من PS.
    4. أضف حبات زركونيا 3 مم في الأنبوب وطحن العينات 3x عند 70 هرتز لمدة 30 ثانية مع بقاء 20 ثانية بينهما.
    5. أجهزة الطرد المركزي العينات عند 4 درجات مئوية و 12000 × جم لمدة 5 دقائق. جمع طاف .
  2. طقم فحص إليسا
    ملاحظة: قم بإجراء ELISA وفقا لبروتوكول الفحص المحدد من قبل الشركة المصنعة.
    1. أضف 100 ميكرولتر من كل تخفيف قياسي وفارغ وعينة في الآبار المناسبة. احتضان لمدة 90 دقيقة عند 37 درجة مئوية.
    2. صب السائل من كل بئر وأضف 100 ميكرولتر من محلول عمل الأجسام المضادة للكشف عن البيوتينيلات. احتضان لمدة 1 ساعة عند 37 درجة مئوية.
    3. صب الحل ، إضافة 350 ميكرولتر من العازلة غسل لكل بئر. نقع لمدة 1 دقيقة ، كرر 3x.
    4. أضف 100 ميكرولتر من حل العمل المترافق HRP لكل بئر. احتضان لمدة 30 دقيقة عند 37 درجة مئوية.
    5. صب الحل. كرر عملية الغسيل 5 مرات كما هو موضح في الخطوة 6.2.3.
    6. أضف 90 ميكرولتر من كاشف الركيزة. احتضان لمدة 15 دقيقة عند 37 درجة مئوية محمية من الضوء.
    7. أضف 50 ميكرولتر من محلول الإيقاف.
  3. استخدم قارئ لوحة لتسجيل امتصاص كل بئر عند 450 نانومتر.
  4. توليد منحنى قياسي
    1. ارسم متوسط قيم الامتصاص ذات الصلة مقابل تركيزات البروتين المخففة بشكل متسلسل.
    2. انضم إلى النقاط لإنشاء أفضل منحنى ملاءمة. استخدم أي تطبيق كمبيوتر مناسب (جدول بيانات) لإنشاء معادلة المنحنى القياسية.
  5. عوض بقيمة الامتصاص لكل عينة في معادلة المنحنى القياسي للحصول على تركيز العينة المعنية.

النتائج

تم العثور على وزن الجسم للفئران السكرية التي تتغذى على نظام غذائي عالي الدهون و STZ لينخفض بالمقارنة مع المجموعات الضابطة من 0-8 أسابيع بعد العلاج STZ. كان فقدان الوزن للفئران المعالجة بنارينجينين كبيرا مقارنة بالفئران غير المعالجة (مجموعة STZ) في الأسبوع 4. تم إعطاء مجموعات التحكم ومجموعات STZ ب?...

Discussion

إعداد محلول كيميائي نباتي هو الأساس لتطبيقه في الجسم الحي. في هذا البروتوكول ، تم توضيح تحضير محلول نارينجينين باستخدام مذيبات مختلفة ، مثل الإيثانول ، DMSO ، Tween 80 ، و 0.9٪ PS. يحتاج المحلول في حالة الذوبان تماما إلى مزيد من المراقبة من خلال السماح له بالبقاء في درجة حرارة الغرفة لبضع ساعا?...

Disclosures

ليس لدى المؤلفين ما يكشفون عنه.

Acknowledgements

تم دعم هذا العمل من قبل المؤسسة الوطنية للعلوم الطبيعية في الصين (81973607 و 81573992).

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
1.5 mL  microtubesCorning Science (Wujiang) Co.23218392Holding liquid
Automatic DehydratorLeica Microsystems (Shanghai) Co.LEICA ASP 300SDehydrate samples
Blood glucose test stripsJohnson & Johnson (China) Medical Equipment Co.4130392
CentrifugeMIULABMinute centrifugeCentrifugal solution
DehydratorLeica Microsystems (Shanghai) Trading Co.LEICA  ASP300SDehydration
DMSOSangon Biotech (Shanghai ) Co.,Ltd.E918BA0041Co-Solvent
ELISA assay kitElabscience Biotechnology Co.,LtdMouse COL1(Collagen Type I) ELISA Kit: E-EL-M0325c
Mouse  CTX I ELISA Kit: E-EL-M0366c
Mouse PICP ELISA Kit: E-EL-M0231c
Mouse PINP ELISA Kit: E-EL-M0233c
Ethanol absoluteSinopharm Chemical ReagentCo., Ltd10009218Co-Solvent
Ethylene glycol monoethyl etherSangon Biotech (Shanghai ) Co.,Ltd.A501118-0500TRAP staining
Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA)Sinopharm Chemical ReagentCo., Ltd10009617Decalcification
FilterMerck Millpore LTD.Millex-GP, 0.22 µmfilter solution
Glacial acidSinopharm Chemical ReagentCo., Ltd10000218TRAP staining
Glucose meterJohnson & Johnson (China) Medical Equipment Co.One Touch Ultra VueSerial number:COJJG8GW
GrinderShanghaijingxin Experimental TechnologyTissuelyser-24
HematoxylinNanjing Jiancheng Bioengineering InstituteD005TRAP staining
Insulin syringeShanghai Kantaray Medical Devices Co.0.33 mm x 13 mm, RW LBIntraperitoneal injection
L-(+) tartaric acidSinopharm Chemical ReagentCo., Ltd100220008TRAP staining
MicroscopeOLYMPUSsz61Observation
MicrotomeLeica Microsystems (Shanghai) Trading Co.LEICA RM 2135Section
Mini centrifugeHangzzhou Miu Instruments Co., Ltd. Mini-6KCCentrifuge
Naphthol AS-BI phosphateSIGMA-ALDRICHBCBS3419TRAP staining
NaringeninJiangsu Yongjian Pharmaceutical Co.,Ltd102764Solute
Paraffin Embedding stationLeica Microsystems (Shanghai) Co.LEICA  EG 1150 H, LEICA  EG 1150 CEmbed  samples
Pararosaniline baseBBI Life SciencesE112BA0045TRAP staining
Pipetteseppendorf2–20 µL, 100–1000 µL, 20–200 µL  transferre Liquid
Plate readerBioTek Instruments USA, Inc.BioTek CYTATION 3 imaging readerELISA
ResinShanghai Yyang Instrument Co., Ltd.Neutral balsamTRAP staining
saline (0.9 PS)Baxter Healthcare (Shanghai) Co.,LtdA6E1323Solvent
Sodium acetate anhydrousSinopharm Chemical ReagentCo., LtdMerck-1.06268.0250 | 250gTRAP staining
Sodium nitriteSinopharm Chemical ReagentCo., Ltd10020018TRAP staining
Tween-80Sangon Biotech (Shanghai ) Co.,Ltd.E819BA0006Emulsifier
Zirconia beadsShanghaijingxin Experimental Technology11079125z 454gGrinding

References

  1. Stoye, D. Solvents. Ullmann's Encyclopedia of Industrial Chemistry. , (2000).
  2. Bouchard, D., et al. Optimization of the solvent-based dissolution method to sample volatile organic compound vapors for compound-specific isotope analysis. Journal of Chromatography A. 1520, 23-34 (2017).
  3. Turner, P. V., Brabb, T., Pekow, C., Vasbinder, M. A. Administration of substances to laboratory animals: routes of administration and factors to consider. Journal of the American Association for Laboratory Animal Science: JAALAS. 50 (5), 600-613 (2011).
  4. Vandenberg, L. N., et al. Hormones and endocrine-disrupting chemicals: low-dose effects and nonmonotonic dose responses. Endocrine Reviews. 33 (3), 378-455 (2012).
  5. Hernández-Aquino, E., Muriel, P. Beneficial effects of naringenin in liver diseases: Molecular mechanisms. World Journal of Gastroenterology. 24 (16), 1679-1707 (2018).
  6. Den Hartogh, D. J., Tsiani, E. Antidiabetic properties of naringenin: A citrus fruit polyphenol. Biomolecules. 9 (3), (2019).
  7. Tutunchi, H., Naeini, F., Ostadrahimi, A., Hosseinzadeh-Attar, M. J. Naringenin, a flavanone with antiviral and anti-inflammatory effects: A promising treatment strategy against COVID-19. Phytotherapy Research. 34 (12), 3137-3147 (2020).
  8. Zaidun, N. H., Thent, Z. C., Latiff, A. A. Combating oxidative stress disorders with citrus flavonoid: Naringenin. Life Sciences. 208, 111-122 (2018).
  9. Tsuhako, R., Yoshida, H., Sugita, C., Kurokawa, M. Naringenin suppresses neutrophil infiltration into adipose tissue in high-fat diet-induced obese mice. Journal of Natural Medicines. 74 (1), 229-237 (2020).
  10. Annadurai, T., et al. Antihyperglycemic and anti-oxidant effects of a flavanone, naringenin, in streptozotocin-nicotinamide-induced experimental diabetic rats. Journal of Physiology and Biochemistry. 68 (3), 307-318 (2012).
  11. Li, S., et al. Naringenin improves insulin sensitivity in gestational diabetes mellitus mice through AMPK. Nutrition & Diabetes. 9 (1), 28 (2019).
  12. Devan, S., Janardhanam, V. A. Effect of Naringenin on metabolic markers, lipid profile and expression of GFAP in C6 glioma cells implanted rat's brain. Annals of Neurosciences. 18 (4), 151-155 (2011).
  13. Burke, A. C., et al. Naringenin enhances the regression of atherosclerosis induced by a chow diet in Ldlr-/- mice. Atherosclerosis. 286, 60-70 (2019).
  14. Assini, J. M., et al. Naringenin prevents obesity, hepatic steatosis, and glucose intolerance in male mice independent of fibroblast growth factor 21. Endocrinology. 156 (6), 2087-2102 (2015).
  15. Alifarsangi, A., Esmaeili-Mahani, S., Sheibani, V., Abbasnejad, M. The citrus flavanone naringenin prevents the development of morphine analgesic tolerance and conditioned place preference in male rats. The American Journal of Drug and Alcohol Abuse. 47 (1), 43-51 (2020).
  16. Sirovina, D., Oršolić, N., Gregorović, G., Končić, M. Z. Naringenin ameliorates pathological changes in liver and kidney of diabetic mice: a preliminary study. Archives of Occupational Hygiene and Toxicology. 67 (1), 19-24 (2016).
  17. Nguyen-Ngo, C., Willcox, J. C., Lappas, M. Anti-diabetic, anti-inflammatory, and anti-oxidant effects of Naringenin in an In vitro human model and an in vivo murine model of gestational diabetes mellitus. Molecular Nutrition & Food Research. 63 (19), 1900224 (2019).
  18. Ahmed, L. A., Obaid, A. A. Z., Zaki, H. F., Agha, A. M. Naringenin adds to the protective effect of L-arginine in monocrotaline-induced pulmonary hypertension in rats: favorable modulation of oxidative stress, inflammation and nitric oxide. European Journal of Pharmaceutical Sciences. 62, 161-170 (2014).
  19. Park, J., et al. Naringenin ameliorates kainic acid-induced morphological alterations in the dentate gyrus in a mouse model of temporal lobe epilepsy. Neuroreport. 27 (15), 1182-1189 (2016).
  20. Matsui, H., et al. Early-stage Type 2 diabetes mellitus impairs erectile function and neurite outgrowth from the major pelvic ganglion and downregulates the gene expression of neurotrophic factors. Urology. 99, 1-7 (2017).
  21. Sharma, G., Ashhar, M. U., Aeri, V., Katare, D. P. Development and characterization of late-stage diabetes mellitus and -associated vascular complications. Life Sciences. 216, 295-304 (2019).
  22. Rowe, R. C., Sheskey, P. J., Owen, S. C. . Handbook of Pharmaceutical Excipients. , (2003).
  23. Fallahi, F., Roghani, M., Moghadami, S. Citrus flavonoid naringenin improves aortic reactivity in streptozotocin-diabetic rats. Indian Journal of Pharmacology. 44 (3), 382-386 (2012).
  24. Liu, F., Yang, H., Zhou, W. Comparison of the characteristics of induced and spontaneous db/db mouse models of type 2 diabetes mellitus. Acta Laboratorium Animalis Scientia Sinica. 22 (6), 54-59 (2014).
  25. Liu, S., Dong, J., Bian, Q. A dual regulatory effect of naringenin on bone homeostasis in two diabetic mice models. Traditional Medicine and Modern Medicine. 03 (02), 101-108 (2020).
  26. Sun, C., Wu, Z., Wang, Z., Zhang, H. Effect of ethanol/water solvents on phenolic profiles and anti-oxidant properties of beijing propolis extracts. Evidence-Based Complementary and Alternative Medicine. 2015, 595393 (2015).
  27. Huaman-Castilla, N. L., et al. The impact of temperature and ethanol concentration on the global recovery of specific polyphenols in an integrated HPLE/RP process on carménère pomace extracts. Molecules. 24 (17), (2019).
  28. van Thriel, C. Toxicology of solvents (including alcohol). Reference Module in Biomedical Sciences. , (2014).
  29. Linakis, J. G., Cunningham, C. L. Effects of concentration of ethanol injected intraperitoneally on taste aversion, body temperature, and activity. Psychopharmacology. 64 (1), 61-65 (1979).
  30. Magwaza, L. S., et al. Rapid methods for extracting and quantifying phenolic compounds in citrus rinds. Food Science & Nutrition. 4 (1), 4-10 (2016).
  31. Smith, E. R., Hadidian, Z., Mason, M. M. The single--and repeated--dose toxicity of dimethyl sulfoxide. Annals of the New York Academy of Sciences. 141 (1), 96-109 (1967).
  32. Colucci, M., et al. New insights of dimethyl sulphoxide effects (DMSO) on experimental in vivo models of nociception and inflammation. Pharmacological Research. 57 (6), 419-425 (2008).
  33. Kawakami, K., Oda, N., Miyoshi, K., Funaki, T., Ida, Y. Solubilization behavior of a poorly soluble drug under combined use of surfactants and co-solvents. European Journal of Pharmaceutical Sciences. 28 (1-2), 7-14 (2006).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

174 DMSO 80 TRAP ELISA

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved