JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • النتائج
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

نحن نقدم تقنية تستخدم التجميع بمساعدة الشعيرات الدموية في منصة الموائع الدقيقة لنمط الأجسام الصغيرة الحجم المعلقة في سائل ، مثل البكتيريا والغرويات ، في صفائف موصوفة على ركيزة polydimethylsiloxane.

Abstract

يوفر النمذجة الخاضعة للرقابة للكائنات الحية الدقيقة في ترتيبات مكانية محددة إمكانيات فريدة لمجموعة واسعة من التطبيقات البيولوجية ، بما في ذلك دراسات علم وظائف الأعضاء الميكروبية والتفاعلات. وعلى أبسط مستوى، من شأن الأنماط المكانية الدقيقة للكائنات الحية الدقيقة أن تمكن من التصوير الموثوق به والطويل الأجل لأعداد كبيرة من الخلايا الفردية وتحويل القدرة على الدراسة الكمية للتفاعلات بين الميكروبات والميكروبات المعتمدة على المسافة. وعلى نحو أكثر تفردا، فإن الاقتران بين الأنماط المكانية الدقيقة والتحكم الكامل في الظروف البيئية، على النحو الذي توفره تكنولوجيا الموائع الدقيقة، من شأنه أن يوفر منصة قوية ومتعددة الاستخدامات للدراسات أحادية الخلية في علم البيئة الميكروبي.

تقدم هذه الورقة منصة الموائع الدقيقة لإنتاج أنماط متعددة الاستخدامات ومحددة من قبل المستخدم للكائنات الحية الدقيقة داخل قناة الموائع الدقيقة ، مما يسمح بالوصول البصري الكامل للمراقبة طويلة الأجل عالية الإنتاجية. تعتمد تقنية الموائع الدقيقة الجديدة هذه على تجميع الجسيمات بمساعدة الشعيرات الدموية وتستغل القوى الشعرية الناشئة عن الحركة الخاضعة للرقابة لتعليق التبخر داخل قناة الموائع الدقيقة لإيداع كائنات فردية صغيرة الحجم في مجموعة من الفخاخ المصنعة على ركيزة متعددة الميثيل سيلوكسان (PDMS). تولد الترسبات المتسلسلة التخطيط المكاني المطلوب لأنواع مفردة أو متعددة من الكائنات صغيرة الحجم ، تمليها فقط هندسة الفخاخ وتسلسل التعبئة.

تمت معايرة المنصة باستخدام جزيئات غروية ذات أبعاد ومواد مختلفة: فقد أثبتت أنها أداة قوية لتوليد أنماط غروية متنوعة وإجراء عملية سطحية للجسيمات المحاصرة. علاوة على ذلك ، تم اختبار المنصة على الخلايا الميكروبية ، باستخدام خلايا الإشريكية القولونية كبكتيريا نموذجية . تم نقش الآلاف من الخلايا الفردية على السطح ، وتم رصد نموها بمرور الوقت. في هذه المنصة ، يسمح اقتران ترسب الخلية الواحدة وتكنولوجيا الموائع الدقيقة بكل من الأنماط الهندسية للكائنات الحية الدقيقة والتحكم الدقيق في الظروف البيئية. وبالتالي فإنه يفتح نافذة على فسيولوجيا الميكروبات المفردة وبيئة التفاعلات بين الميكروبات والميكروبات ، كما هو موضح في التجارب الأولية.

Introduction

إن الأنماط المكانية للكائنات الحية الدقيقة المفردة ، خاصة داخل الساحات التجريبية التي تمكن من التحكم الكامل في الظروف البيئية ، مثل أجهزة الموائع الدقيقة ، أمر مرغوب فيه للغاية في مجموعة واسعة من السياقات. على سبيل المثال، فإن ترتيب الكائنات الحية الدقيقة في صفائف منتظمة من شأنه أن يسمح بالتصوير الدقيق لأعداد كبيرة من الخلايا الفردية ودراسة نموها، وعلم وظائف الأعضاء، والتعبير الجيني استجابة للمحفزات البيئية، وقابلية الأدوية. كما سيسمح بدراسة التفاعلات بين الخلايا والخلايا ذات الأهمية الخاصة في البحوث في مجال الاتصالات الخلوية (على سبيل المثال، استشعار النصاب)، أو التغذية المتقاطعة (على سبيل المثال، التكافل بين الطحالب والبكتيريا)، أو العداء (على سبيل المثال، اعتلال الأليلو)، مع السيطرة الكاملة على التوطين المكاني للخلايا بالنسبة لبعضها البعض. تعد دراسات فسيولوجيا الخلية وتطورها1، ودراسات التفاعل بين الخلايا والخلايا2، وفحص التمايز الظاهري3، والرصد البيئي4، وفحص الأدوية5 من بين المجالات التي يمكن أن تستفيد بشكل كبير من التكنولوجيا القادرة على تحقيق مثل هذا التحليل الكمي أحادي الخلية.

تم اقتراح العديد من الاستراتيجيات لعزل الخلايا المفردة والتعامل معها في السنوات الأخيرة ، من الفخاخ البصرية ثلاثية الأبعاد 6 وطرق تشغيل السطح غير المتجانسة 7،8،9،10 إلى الكيموزتات أحادية الخلية 11 والموائع الدقيقة القطيرات 12. هذه الطرق إما صعبة للغاية من الناحية الفنية أو تؤثر على فسيولوجيا الخلية وتفشل في توفير منصة عالية الإنتاجية لنمط الميكروبات التي يمكن دراستها على مدى فترات طويلة ، مما يضمن دقة الخلية الواحدة ، والوصول البصري الكامل ، والتحكم في الظروف البيئية. الهدف من هذه الورقة هو وصف منصة لنمط البكتيريا بدقة ميكرومترية في ترتيبات مكانية محددة على سطح PDMS من خلال التجميع بمساعدة الشعيرات الدموية. تسمح هذه المنصة بنمط مكاني دقيق ومرن للميكروبات وتمكن من الوصول البصري الكامل والتحكم في الظروف البيئية ، وذلك بفضل طبيعتها الموائع الدقيقة.

التكنولوجيا الكامنة وراء هذه المنصة هي تقنية تجميع تم تطويرها في السنوات الأخيرة ، تسمى sCAPA13,14,15 (تجميع الجسيمات بمساعدة الشعيرات الدموية التسلسلية) التي تم دمجها في منصة الموائع الدقيقة 16. الغضروف المفصلي لقطرة سائلة متبخرة ، أثناء انحسارها فوق ركيزة منقوشة من polydimethylsiloxane (PDMS) داخل قناة ميكروفلويدية ، تمارس قوى شعرية تحبس الجسيمات الغروية الفردية المعلقة في السائل في آبار ميكرومترية دقيقة الصنع على الركيزة (الشكل 1A). يتم نقل الجسيمات العالقة أولا إلى واجهة الهواء السائل بواسطة تيارات الحمل الحراري ثم توضع في الفخاخ بواسطة الشعيرات الدموية. تعمل القوى الشعرية التي يمارسها الغضروف المفصلي المتحرك على نطاق أوسع مقارنة بالقوى المشاركة في تفاعلات الجسيمات.

وبالتالي ، لا تتأثر آلية التجميع بالمواد والأبعاد والخصائص السطحية للجسيمات. المعلمات مثل تركيز الجسيمات ، وسرعة الغضروف المفصلي ، ودرجة الحرارة ، والتوتر السطحي للتعليق هي المعلمات الوحيدة التي تؤثر على عائد عملية النقش. يمكن للقارئ العثور على وصف مفصل لتأثير المعلمات المذكورة أعلاه على عملية النقش في13،14،15. في تقنية sCAPA الأصلية13،14،15 ، تم تنفيذ عملية النقش الغروي في نظام مفتوح وتطلب مرحلة كهرضغطية عالية الدقة لدفع التعليق عبر القالب. تستغل هذه المنصة استراتيجية مختلفة وتسمح بإجراء النقش باستخدام المعدات القياسية المستخدمة بشكل عام في الموائع الدقيقة في بيئة خاضعة للرقابة ، وبالتالي تقليل مخاطر تلويث العينات.

تم تحسين هذه المنصة الموائع الدقيقة لأول مرة على الجسيمات الغروية لإنشاء صفائف منتظمة من الجسيمات الخاملة ثم تطبيقها بنجاح على البكتيريا. تم وصف كل من منصات الموائع الدقيقة في هذه الورقة (الشكل 1B ، C). ومعظم الخطوات التحضيرية والمعدات التجريبية الموصوفة في البروتوكول شائعة في التطبيقين (الشكل 2). نقوم بالإبلاغ عن الأنماط الغروية لإثبات أنه يمكن استخدام هذه التقنية لإجراء ترسبات متسلسلة متعددة على نفس السطح لإنشاء أنماط معقدة ومتعددة المواد. على وجه الخصوص ، تم إيداع جسيم واحد لكل فخ لكل خطوة لتشكيل صفائف غروية ذات هندسة وتكوين محددين ، تمليهما فقط هندسة الفخاخ وتسلسل التعبئة. أما بالنسبة للأنماط البكتيرية ، يتم وصف الترسبات الفردية ، مما يؤدي إلى ترسب بكتيريا واحدة لكل فخ. بمجرد أن يتم نقش الخلايا على السطح ، يتم مسح قناة الموائع الدقيقة بوسط لتعزيز نمو البكتيريا ، وهي الخطوة الأولية لأي دراسة أحادية الخلية.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

1. إعداد السيليكون الرئيسي

ملاحظة: تم تصنيع قوالب PDMS التي تحمل الفخاخ الدقيقة التي تشكل قالب النقش الغروي والميكروبي وفقا للطريقة التي قدمها Geissler et al. 17. تم إعداد سيد السيليكون بواسطة الطباعة الحجرية التقليدية في غرفة الأبحاث. راجع الخطوات التالية للاطلاع على الإجراء وجدول المواد الخاص بالمعدات.

  1. تصميم الميزات باستخدام برنامج التصميم بمساعدة الكمبيوتر (CAD).
  2. قم بإعداد قناع الكروم الزجاجي بطبقة من المقاومة الإيجابية للضوء من خلال تعريض الميزات المصممة باستخدام كاتب ليزر مباشر للأشعة فوق البنفسجية.
    1. طور قناع الكروم الزجاجي باستخدام مطور دوران باستخدام مطور بنسبة مقاومة للضوء إلى الماء تبلغ 1:4 لمدة 15 ثانية.
    2. اغمري القناع في قشر الكروم لمدة 50 ثانية.
    3. عالج رقاقة السيليكون مقاس 10 سم بالبلازما لمدة 3 دقائق عند 600 واط.
    4. ترسب البخار طبقة من سداسي ميثيل ديسيليزان وتخبز عند 110 درجة مئوية لتحسين الالتصاق نحو المقاومة للضوء.
    5. قم بإيداع طبقة من مقاومة الضوء عند 4500 × جم لمدة 2 دقيقة.
    6. تعريض الميزة للأشعة فوق البنفسجية من خلال قناع الكروم الزجاجي مع مصفف قناع لمدة 2 ثانية وتطوير مع مطور كما هو الحال بالنسبة للقناع.
  3. لإكمال تصنيع سيد السيليكون ، قم بحفر الرقاقة عبر التبادل الأيوني التفاعلي العميق ، وضبط وقت الحفر (<2 دقيقة) لتحقيق العمق المطلوب (يتم قياسه باستخدام مقياس التنميط).

2. إعداد قالب Microchannel

  1. صمم القناة باستخدام برنامج CAD وقم بتقطيعها باستخدام برنامج مقسم طريقة العرض لتحويل النموذج المصمم إلى تعليمات للطابعة ثلاثية الأبعاد ، مع ضبط مسافة التقطيع عند 0.05 مم.
  2. اطبع القناة باستخدام طابعة 3D لمدة 1 ساعة تقريبا.
  3. اغسل القالب وقم بمعالجته في غسالة ومعالجة مخصصة.
    1. ضع القالب في وعاء مملوء بكحول الأيزوبروبيل النقي (IPA) ودوامة السائل (اغسله لمدة 20 دقيقة). أخرج الحاوية المملوءة ب IPA من الماكينة.
    2. بمجرد إزالة القالب المغسول من حاوية IPA ، ضعه مرة أخرى في غسالة الغسيل والمعالجة وقم بمعالجته لمدة 15 دقيقة عند 35 درجة مئوية.
      ملاحظة: يبلغ جدول المواد عن الطابعة ثلاثية الأبعاد والمعالجة والغسالة المستخدمة في بروتوكول إعداد العفن. تم تقطيع نموذج 3D مع برنامج تقطيع شرائح الطابعة ثلاثية الأبعاد.
  4. ضع الطباعة في فرن الأشعة فوق البنفسجية لمدة 12 ساعة وضعها في فرن على درجة حرارة 80 درجة مئوية لمدة 12 ساعة.
    ملاحظة: تضمن هذه الخطوة معالجة كل البوليمر وإزالة جميع البوليمرات غير المعالجة من الطباعة لأنها ستمنع PDMS من المعالجة.
  5. سيلان القالب من خلال ترسب بخار تريكلورو (1H ، 1H ، 2H ، 2H-perfluorooctyl) سيلان.
    1. ضع القالب ثلاثي الأبعاد في مجفف فراغ مع 20 ميكرولتر من ثلاثي كلورو المركز بنسبة 100٪ (1H ، 1H ، 2H ، 2H-perfluorooctyl) silane ماصة على رقائق الألومنيوم الموضوعة بالقرب من القالب.
    2. قم بإنشاء فراغ في المجفف لتوليد البخار واتركه لمدة 40 دقيقة.
    3. قم بإزالة القالب من المجفف وشطفه بالإيثانول النقي قبل صب PDMS عليه.

3. تصنيع رقاقة الموائع الدقيقة

  1. تحضير خليط PDMS عن طريق خلط المطاط الصناعي مع عامل الربط المتقاطع (جدول المواد). حرك الخليط بقوة لمزج المكونين بشكل موحد حتى تتشكل فقاعات الهواء ، ويبدو خليط PDMS غير شفاف.
    ملاحظة: يجب أن تكون كمية الوصلة المتقاطعة 10٪ من وزن كمية المطاط الصناعي.
  2. قم بفك خليط المطاط الصناعي وعامل الربط المتقاطع في مجفف فراغ لإزالة فقاعات الهواء المحاصرة. انقل الخليط في المجفف إلى الحاوية المستخدمة للخلط (الخطوة 3.1). استمر في عملية إزالة الغاز حتى تتم إزالة جميع الفقاعات ويبدو الخليط شفافا مرة أخرى.
    ملاحظة: الوقت اللازم عادة للجفاف هو 30 دقيقة.
  3. صب 3 غرام من الخليط على سيد السيليكون لإنتاج القالب ، والذي سيكون بمثابة "أرضية" رقاقة الموائع الدقيقة.
    ملاحظة: يمكن ضبط سمك طبقة PDMS عن طريق تغيير كمية الخليط المصبوب على سيد السيليكون.
    1. للحصول على قالب بسماكة 400 ميكرومتر ، صب 3 جم من PDMS على سيد السيليكون ، وضع سيد السيليكون على معطف دوار ، وقم بتدوير المعطف عند 21 × جم لمدة 5 ثوان و 54 × جم لمدة 10 ثوان ، ثم قم بفك الغاز مرة أخرى كما هو موضح في الخطوة 3.2 لإزالة فقاعات الهواء المحاصرة.
  4. صب 20 جم من خليط PDMS على القالب المطبوع ثلاثي الأبعاد لصنع القناة الدقيقة ، والتي ستكون بمثابة "سقف" رقاقة الموائع الدقيقة ، وتفكيكها كما هو موضح في الخطوة 3.2 لمدة 30 دقيقة.
  5. خبز كل من رقاقة السيليكون والقالب المطبوع 3D في 70 درجة مئوية لمدة 2 ساعة على الأقل.
  6. قشر طبقة PDMS من القالب المطبوع 3D ، وقطع PDMS بشفرة حول القنوات الدقيقة ، ولكم الثقوب التي ستكون بمثابة مدخل ومخرج لقناة الموائع الدقيقة.
  7. قشر PDMS من سيد السيليكون وقطع طبقة PDMS إلى قطع أصغر بنفس أبعاد قنوات الموائع الدقيقة التي سيتم ربطها أعلى القوالب.
  8. افرك القوالب والقنوات الدقيقة بلطف باستخدام محلول منظف بنسبة 1٪ (انظر جدول المواد) لمدة 5 دقائق ثم اشطف بالماء منزوع الأيونات. بعد ذلك ، شطف القوالب والقنوات الدقيقة باستخدام الأيزوبروبانول وشطفها بالماء منزوع الأيونات. جفف القوالب والقنوات الدقيقة في درجة حرارة الغرفة لمدة 1 دقيقة مع الهواء المضغوط عند 1 بار.
  9. ضع القوالب والقنوات الدقيقة في منظف البلازما مع توجيه الأسطح المراد ربطها لأعلى. قم بتشغيل منظف البلازما ، وتعالج البلازما القوالب والقنوات الدقيقة لمدة 40 ثانية. أخرجها من منظف البلازما وقم على الفور بربط القنوات الدقيقة أعلى القوالب عن طريق وضعها على اتصال مع بعضها البعض.
  10. قم بتخزين رقائق الموائع الدقيقة في فرن على درجة حرارة 70 درجة مئوية لمدة خمسة أيام لضمان استرداد PDMS الكارهة للماء والحصول على زاوية تلامس انحسار ضمن النطاق الأمثل ، بين 30 و 60 درجة 10,11.

4. النقش البكتيري

  1. قبل يوم واحد من التجربة، تنمو مجموعة من الإشريكية القولونية (سلالة MG1655 prpsM-GFP). قم بتلقيح المستنبتة مباشرة من المخزون المجمد وتنمو بين عشية وضحاها لمدة 20 ساعة في وسط مرق الليزوجيني (LB) في حاضنة شاكر عند 37 درجة مئوية. أضف 50 ميكروغرام / مل من الكاناميسين للخلايا للاحتفاظ ببلازميد prpsM-GFP.
  2. في يوم التجربة، اضبط الحاضنة الصندوقية (الشكل 2A) على 37 درجة مئوية قبل عدة ساعات من التجربة للحصول على درجة حرارة موحدة ومستقرة قبل بدء التجربة. قم بإعداد مضخة المحقنة واللوحة الزجاجية المسخنة على مرحلة المجهر (الشكل 2B ، C) ، مع ضبط درجة الحرارة على نفس درجة حرارة حاضنة الصندوق.
    ملاحظة: تضمن الحاضنة الصندوقية التي يحيط بها النظام بأكمله، بما في ذلك المجهر (الشكل 2E)، الحفاظ على درجة حرارة موحدة وثابتة طوال التجربة بأكملها عندما يتم مسح القناة بمتوسط.
  3. قبل تسعين دقيقة من التجربة ، ضع شريحة الموائع الدقيقة في وعاء مملوء بالإيثانول بنسبة 100٪ (EtOH) واغسل القناة بنسبة 100٪ EtOH لمدة 10 دقائق على الأقل. ضع رقاقة الموائع الدقيقة في مجفف فراغ وقم بالتخلص منها لمدة 30 دقيقة على الأقل. استبدل EtOH بالماء المقطر وعالج الشريحة بالمكنسة الكهربائية لمدة 30 دقيقة على الأقل. ضع رقاقة الموائع الدقيقة في الفرن على درجة حرارة 70 درجة مئوية لمدة 10 دقائق لإزالة أي آثار للسائل المتبقي في القناة.
    ملاحظة: هذه الخطوة ضرورية لمنع تكوين الفقاعة في القناة عند مسحها بوسط الثقافة. تم تكييف بروتوكول منع الفقاعات هذا من Wang et al.18.
  4. ماصة 1 مل من 3-(N-morpholino) حمض البروبان سلفونيك (MOPS) متوسطة (1x) في قارورة جهاز طرد مركزي وإضافة 10 ميكرولتر من 0.132 M فوسفات البوتاسيوم (K2HPO4). خذ الثقافة بين عشية وضحاها من حاضنة 37 درجة مئوية و aliquot 100 ميكرولتر في قارورة جهاز الطرد المركزي وطرد مركزي الثقافة في 2300 × غرام لمدة دقيقتين. قم بإخراج المادة الفائقة بلطف من قوارير أجهزة الطرد المركزي ، وأعد تعليق الكريات في 1 مل من وسط MOPS الطازج مع 0.015٪ v / v من Tween 20 و 0.01٪ v / v من فوسفات البوتاسيوم.
    ملاحظة: التركيز النموذجي للتعليق البكتيري يتراوح بين 0.015-0.15 vol٪ ، مما يضمن تكوين منطقة تراكم ممتدة ومتحركة ويمنع تراكم الجسيمات على الركيزة. إن استبدال الوسط الليلي بوسط طازج يقلل من مخاطر إطلاق أفلام البكتيريا على القالب. يمنع نقص مصدر الكربون في الوسط الطازج الخلايا من النمو في التعليق أثناء نمط القالب. يعد تركيز 0.015٪ v / v من Tween 20 في التعليق ضروريا لزاوية تلامس السائل المتراجع على قالب PDMS لتقع ضمن النطاق الأمثل ، بين 30 و 60 درجة.
  5. قم بتحميل التعليق البكتيري في حقنة 1 مل وقم بتوصيل المحقنة بالشريحة من خلال أنابيب الموائع الدقيقة.
    1. لتأمين الاتصال بين المحقنة والأنابيب ، أدخل مباشرة إبرة بقطر خارجي يبلغ 0.6 مم في الأنابيب. لتجنب تشتت أي تعليق متبقي في محيط المدخل عبر القناة ، قم بغسل الوسط الطازج من خلال الفتحة المستخدمة كمنفذ أثناء عملية النقش (الشكل 3A-III) ، بدلا من الثقب المستخدم كمدخل.
    2. قم بتركيب المحقنة على مضخة المحقنة وحقن التعليق في رقاقة الموائع الدقيقة من خلال المدخل الموجود في الجزء العلوي من القناة حتى يغطي التعليق منطقة القالب بالفخاخ.
      ملاحظة: أثناء عملية حقن السائل، يمكن للهواء الهروب من خلال منفذ يقع في نهاية المصب من القناة.
    3. اضبط مضخة المحقنة لسحب التعليق البكتيري (الشكل 3A-I) بمعدل تدفق يتراوح بين 0.07-0.2 ميكرولتر / دقيقة ، والذي يتوافق في الهندسة الموصوفة مع سرعة انحسار الغضروف المفصلي من 80-100 ميكرومتر / دقيقة.
    4. مراقبة عملية النقش عبر برنامج المجهر.
      ملاحظة: هنا ، تم استخدام تكبير 10x لمراقبة الغضروف المفصلي المتراجع على القالب ، وتم استخدام تكبير 20x لمراقبة ترسب البكتيريا الفردية في الفخاخ الدقيقة التصنيع.
  6. بمجرد أن يتم نقش القالب بالخلايا (الشكل 3A-II) ، قم بزيادة معدل تدفق السحب لإفراغ قناة الموائع الدقيقة بسرعة وغسلها ب LB طازج تم تفكيكه مسبقا لمدة 30 دقيقة على الأقل وتم تسخينه مسبقا عند 30 درجة مئوية.
  7. اضبط مضخة المحقنة بمعدل تدفق 2 ميكرولتر / دقيقة لطرد القناة بلطف. بمجرد ملء القناة ، قم بزيادة معدل التدفق (15 ميكرولتر / دقيقة) وفقا للاحتياجات التجريبية المحددة.
  8. احصل على صور للبكتيريا النامية في التكبير المطلوب والفاصل الزمني.

5. النقش الغروي

  1. ماصة 900 ميكرولتر من محلول مائي 0.015٪ v / v Tween 20 في قارورة طرد مركزي وماصة 100 ميكرولتر من التعليق الغروي الأصلي فيها. جهاز طرد مركزي للتعليق عند 13500 × جم لمدة 1 دقيقة. قم بإزالة المادة الفائقة بلطف واستبدلها بمحلول Tween 20 المائي (0.015٪ v/v). كرر هذه العملية ثلاث مرات لضمان الاستبدال الكامل لمذيب المورد من تعليق المخزون.
  2. قم بتحميل التعليق الغروي في حقنة 1 مل وقم بتوصيل المحقنة بالشريحة من خلال أنابيب الموائع الدقيقة. حقن التعليق في رقاقة الموائع الدقيقة من خلال المدخل الموجود داخل القسم المركزي ، في الجزء العلوي من القناة ، وادفع التعليق تدريجيا حتى يتم تغطية القالب.
  3. اسحب التعليق الغروي بمعدل تدفق 0.07-0.2 ميكرولتر / دقيقة ، والذي يتوافق مع سرعة انحسار الغضروف المفصلي من 1-2 ميكرومتر / دقيقة ، وصور عملية النقش عبر برنامج المجهر. استخدم التكبير 10x لمراقبة الغضروف المفصلي المتراجع على القالب والتكبير 20x لمراقبة ترسب الجسيمات الفردية في الفخاخ الدقيقة الصنع. قم بزيادة معدل التدفق بمجرد وصول الغضروف المفصلي إلى نهاية القالب لإفراغ القناة بسرعة.
    ملاحظة: يمكن إنتاج صفائف غروية تتكون من عدة جسيمات عن طريق تشغيل عملية النقش من الخطوات 5.1 إلى 5.3 في سلسلة. يتم تحميل القناة بتعليق غرواني جديد في كل تكرار وفقا لتكوين المصفوفات الغروية المطلوبة. تضيف كل خطوة نقش جسيما واحدا إلى الصفيف الغروي ويمكن تشغيله بالتتابع حتى يتم ملء الفخاخ بتسلسل الجسيمات المطلوبة. يتم إعطاء تكوين المصفوفات الغروية الناتجة فقط من خلال تسلسل المعلقات الغروية المستخدمة لملء الفخاخ (الشكل 3B).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

النتائج

تم تطوير منصة الموائع الدقيقة التي تستغل التجميع بمساعدة الشعيرات الدموية لنمط الجسيمات الغروية والبكتيريا في الفخاخ الدقيقة الصنع على قالب PDMS. تم تصميم هندستين هندسيتين مختلفتين للقنوات لتحسين نمط الغرويات والبكتيريا من خلال التجميع بمساعدة الشعيرات الدموية. تتكون هندسة القناة الأول?...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

تسمح منصة الموائع الدقيقة الموصوفة هنا بنقش الأجسام الصغيرة الحجم ، مثل الغرويات والبكتيريا ، في ترتيبات مكانية موصوفة على ركيزة PDMS. إن التحكم الكامل في الظروف البيئية التي توفرها الموائع الدقيقة والقدرة على نمط الخلايا بدقة ميكرومترية تمنحها تقنية sCAPA يجعلها منصة واعدة للغاية لدراسات ع...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

وليس لدى المؤلفين أي تضارب في المصالح للإفصاح عنه.

Acknowledgements

يعترف المؤلفون بالدعم المقدم من منحة SNSF PRIMA 179834 (إلى E.S.) ، ومنحة أبحاث ETH ETH-15 17-1 (R. S.) ، وجائزة جوردون وبيتي مور للباحث في التكافل الميكروبي المائي (منحة GBMF9197) (R. S.). يشكر المؤلفون الدكتور ميغيل أنخيل فرنانديز رودريغيز (جامعة غرناطة ، إسبانيا) على تصوير SEM للبكتيريا وعلى المناقشات الثاقبة. يشكر المؤلفون الدكتورة جين نغوين (جامعة كولومبيا البريطانية ، كندا) ، والدكتورة لورا ألفاريز (ETH Zürich ، سويسرا) ، وكاميرون بوغون (ETH Zürich ، سويسرا) والدكتور فابيو غريلو على المناقشات الثاقبة.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
Alcatel AMS 200SE I-SpeederAlcatel Micro Machining Systemdeep reactive ion exchange system
Alconoxdetergent
AZ400K developerMicroChemicalsAZ400K
BD 10 mL Syringe (Luer-Lock)BD300912used to flush fresh Lysogeny broth into the microfluidic channel
Box IncubatorLife Imaging Servicesused to ensure a uniform and constant temperature in the channel
CentrifugeEppendorf5424Rused to replace the overnight media with fresh minimal media
Centrifuge vialEppendorf301200861.5 mL
CETONI Base 120CETONI GmbHsyringe pump
Fluorescent PS particles of diameter 0.98 µm (red)microParticles GmbHPS-FluoRed-Fi267
Fluorescent PS particles of diameter 1.08 µm (green)microParticles GmbHPS-FluoGreen-Fi182
Fluorescent PS particles of diameter 2.07 µm (green)microParticles GmbHPS-FluoGreen-Fi183
Fluorescent PS particles of diameter 2.08 µm (red)microParticles GmbHPS-FluoRed-Fi180
Gigabatch 310 MPVA TePlaused to plasma treat a 10 cm silicon wafer
H401-T-CONTROLLEROkolabcontroller of the heated glass plate
H601-NIKON-TS2R-GLASSOkolabheated glass plate
Heidelberg DWL 2000Heidelberg InstrumentsUV direct laser writer
Insulin syringes, U 100, with luerCodan Medical ApSCODA6216401 mL syringe used to withdraw the liquid suspension during the patterning process
KlayoutOpensourceused to design the features on the silicon master
LB Broth, Miller (Luria-Bertani)Fisher Scientific244610Lysogeny broth flushed into the microfluidic channel
Masterflex transfer tubingMasterflexHV-06419-050.020'' ID, 0.06'' OD
MOPS (10x)TeknovaM2101diluted tenfold with milliQ water and used to replace the overnight medium
Nikon Eclipse Ti2Nikon Instrumentsmicroscope
openSCADOpensourceused to design the mold
OPTIspin SB20ATM group51-0002-01-00spin developer
Plasma chamber ZeptoDiener ElectronicZEPTO-1used to plasma treat the template and microchannel to bond them
Positive photoresist AZ1505MicroChemicalsAZ1505
Potassium phosphate dibasicSigma AldrichP3786added to MOPS 1x
Prusa curing and Washing machine CW1SPrusaused to ensure all polymer is cured and uncured polymer is removed from the mold
Prusa Resin - ToughPrusa Research a.s.UV photosensitive 405nm liquid resin for 3D printing
Prusa SL1 3d printerPrusaused to print the mold
ScaleVWR-CH611-2605used to weight PDMS mixture
Silicon wafer (10 cm)Silicon Materials Inc.N/Phos <100> 1-10 Ω cm
Süss MA6 Mask alignerSUSS MicroTec Groupused to align the chrome-glass mask and the substrate, and expose the substrate
Sylgard 184Dow Corningsilicone elastomer kit; curing agent
Techni Etch Cr01Technicchromium etchant
Trichloro (1H, 1H, 2H, 2H-perfluorooctyl) silaneSigma Aldrich448931used to silianize the 3D printed mold
TWEEN 20Sigma AldrichP1379used to ensure an optimal receding contact angle during the patterning process
Veeco Dektak 6 MVeecoprofilometer
VTC-100 Vacuum Spin CoaterMTI corporationvacuum spin coater

References

  1. Choi, C. H., et al. Preparation of bacteria microarray using selective patterning of polyelectrolyte multilayer and poly(ethylene glycol)-poly(lactide) deblock copolymer. Macromolecular Research. 18 (3), 254-259 (2010).
  2. Smriga, S., Fernandez, V. I., Mitchell, J. G., Stocker, R. Chemotaxis toward phytoplankton drives organic matter partitioning among marine bacteria. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (6), 1576-1581 (2016).
  3. Thomas, C. M., Nielsen, K. M. Mechanisms of, and barriers to, horizontal gene transfer between bacteria. Nature Reviews Microbiology. 3 (9), 711-721 (2005).
  4. Suo, Z., Avci, R., Yang, X., Pascual, D. W. Efficient Immobilization and patterning of live bacterial cells. Langmuir. 24 (8), 4161-4167 (2008).
  5. Kane, B. J., Zinner, M. J., Yarmush, M. L., Toner, M. Liver-specific functional studies in a microfluidic array of primary mammalian hepatocytes. Analytical Chemistry. 78 (13), 4291-4298 (2006).
  6. Akselrod, G. M., et al. Laser-guided assembly of heterotypic three-dimensional living cell microarrays. Biophysical Journal. 91 (9), 3465-3473 (2006).
  7. Cerf, A., Cau, J. C., Vieu, C., Dague, E. Nanomechanical properties of dead or alive single-patterned bacteria. Langmuir. 25 (10), 5731-5736 (2009).
  8. Cerf, A., Cau, J. C., Vieu, C. Controlled assembly of bacteria on chemical patterns using soft lithography. Colloids and Surfaces: B Biointerfaces. 65 (2), 285-291 (2008).
  9. Rozhok, S., et al. Attachment of motile bacterial cells to prealigned holed microarrays. Langmuir. 22 (26), 11251-11254 (2006).
  10. Xu, L., et al. Microcontact printing of living bacteria arrays with cellular resolution. Nano Letters. 7 (7), 2068-2072 (2007).
  11. Ingham, C. J., et al. The micro-Petri dish, a million-well growth chip for the culture and high-throughput screening of microorganisms. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104 (46), 18217-18222 (2007).
  12. Moffitt, J. R., Lee, J. B., Cluzel, P. The single-cell chemostat: an agarose-based, microfluidic device for high-throughput, single-cell studies of bacteria and bacterial communities. Lab on a Chip. 12 (8), 1487-1494 (2012).
  13. Ni, S., Isa, L., Wolf, H. Capillary assembly as a tool for the heterogeneous integration of micro- and nanoscale objects. Soft Matter. 14 (16), 2978-2995 (2018).
  14. Ni, S., Leemann, J., Buttinoni, I., Isa, L., Wolf, H. Programmable colloidal molecules from sequential capillarity-assisted particle assembly. Science Advances. 2 (4), 1501779(2016).
  15. Ni, S., Leemann, J., Wolf, H., Isa, L. Nanoparticle Insights into mechanisms of capillary assembly. Faraday Discussions. 181, 225-242 (2014).
  16. Pioli, R., et al. Sequential capillarity-assisted particle assembly in a microfluidic channel. Lab on a Chip. 21 (5), 888-895 (2021).
  17. Geissler, M., et al. Fabrication of metal nanowires using microcontact printing. Langmuir. 19 (15), 6301-6311 (2003).
  18. Wang, Y., et al. Systematic prevention of bubble formation and accumulation for long-term culture of pancreatic islet cells in microfluidic device. Biomedical Microdevices. 14 (2), 419-426 (2012).
  19. Crowley, L. C., et al. Measuring cell death by propidium iodide uptake and flow cytometry. Cold Spring Harbor Protocols. 7, 647-651 (2016).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

177

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved