Modelado de microorganismos y micropartículas a través del ensamblaje secuencial asistido por capilaridad

Resumen

Presentamos una tecnología que utiliza el ensamblaje asistido por capilaridad en una plataforma microfluídica para modelar objetos de tamaño micro suspendidos en un líquido, como bacterias y coloides, en matrices prescritas en un sustrato de polidimetilsiloxano.

Resumen

El modelado controlado de microorganismos en arreglos espaciales definidos ofrece posibilidades únicas para una amplia gama de aplicaciones biológicas, incluidos estudios de fisiología e interacciones microbianas. En el nivel más simple, el patrón espacial preciso de microorganismos permitiría obtener imágenes confiables a largo plazo de un gran número de células individuales y transformaría la capacidad de estudiar cuantitativamente las interacciones microbio-microbio dependientes de la distancia. De manera más singular, el acoplamiento de patrones espaciales precisos y el control total sobre las condiciones ambientales, como lo ofrece la tecnología microfluídica, proporcionaría una plataforma poderosa y versátil para estudios unicelulares en ecología microbiana.

Este documento presenta una plataforma microfluídica para producir patrones de microorganismos versátiles y definidos por el usuario dentro de un canal microfluídico, lo que permite un acceso óptico completo para un monitoreo a largo plazo y de alto rendimiento. Esta nueva tecnología microfluídica se basa en el ensamblaje de partículas asistido por capilaridad y explota las fuerzas capilares que surgen del movimiento controlado de una suspensión evaporadora dentro de un canal microfluídico para depositar objetos individuales de tamaño micrométrico en una serie de trampas microfabricadas sobre un sustrato de polidimetilsiloxano (PDMS). Las deposiciones secuenciales generan el diseño espacial deseado de uno o varios tipos de objetos de tamaño micro, dictado únicamente por la geometría de las trampas y la secuencia de relleno.

La plataforma ha sido calibrada utilizando partículas coloidales de diferentes dimensiones y materiales: ha demostrado ser una herramienta poderosa para generar diversos patrones coloidales y realizar la funcionalización superficial de partículas atrapadas. Además, la plataforma se probó en células microbianas, utilizando células de Escherichia coli como bacteria modelo. Miles de células individuales fueron modeladas en la superficie, y su crecimiento fue monitoreado a lo largo del tiempo. En esta plataforma, el acoplamiento de la deposición unicelular y la tecnología microfluídica permite tanto el modelado geométrico de microorganismos como el control preciso de las condiciones ambientales. Por lo tanto, abre una ventana a la fisiología de los microbios individuales y la ecología de las interacciones microbio-microbio, como lo demuestran los experimentos preliminares.

Introducción

El modelado espacial de microorganismos individuales, particularmente dentro de ámbitos experimentales que permiten un control total sobre las condiciones ambientales, como los dispositivos microfluídicos, es muy deseable en una amplia gama de contextos. Por ejemplo, la organización de microorganismos en matrices regulares permitiría la obtención de imágenes precisas de un gran número de células individuales y el estudio de su crecimiento, fisiología, expresión génica en respuesta a estímulos ambientales y susceptibilidad a los medicamentos. También permitiría estudiar las interacciones célula-célula de particular interés en la investigación de la comunicación celular (por ejemplo, la detección de quórum), la alimentación cruzada (por ejemplo, la simbiosis argalo-bacteriana) o el antagonismo (por ejemplo, la alelopatía), con control total sobre la localización espacial de las células entre sí. Los estudios de fisiología y evolución ^celular1, los estudios de interacción ^{célula-célula2}, el cribado de diferenciación fenotípica3, el monitoreo ^ambiental4 y el cribado ^{farmacológico5} se encuentran entre los campos que pueden beneficiarse enormemente de una tecnología capaz de lograr dicho análisis cuantitativo unicelular.

En los últimos años se han propuesto varias estrategias para aislar y manejar células individuales, desde trampas ópticas holográficas6 y métodos heterogéneos de funcionalización de superficies7,8,9,10 hasta quimiostatos unicelulares11 y microfluídica de ^gotas12. Estos métodos son técnicamente muy exigentes o afectan la fisiología celular y no proporcionan una plataforma de alto rendimiento para modelar microbios que puedan estudiarse durante largos períodos, asegurando la resolución de una sola célula, el acceso óptico completo y el control sobre las condiciones ambientales. El objetivo de este artículo es describir una plataforma para modelar bacterias con precisión micrométrica en arreglos espaciales prescritos en una superficie PDMS a través del ensamblaje asistido por capilaridad. Esta plataforma permite un modelado espacial preciso y flexible de microbios y permite un acceso óptico completo y control sobre las condiciones ambientales, gracias a su naturaleza microfluídica.

La tecnología detrás de esta plataforma es una tecnología de ensamblaje desarrollada en los últimos años, denominada sCAPA13,14,15 (sequential capillarity-assisted particle assembly) que se integró en una plataforma microfluídica16. El menisco de una gota líquida que se evapora, mientras retrocede sobre un sustrato de polidimetilsiloxano (PDMS) patrón dentro de un canal microfluídico, ejerce fuerzas capilares que atrapan las partículas coloidales individuales suspendidas en el líquido en pozos micrométricos microfabricados sobre el sustrato (Figura 1A). Las partículas suspendidas se transportan primero a la interfaz aire-líquido por corrientes convectivas y luego se colocan en las trampas por capilaridad. Las fuerzas capilares ejercidas por el menisco en movimiento actúan a mayor escala en comparación con las fuerzas involucradas en las interacciones de partículas.

Por lo tanto, el mecanismo de ensamblaje no está influenciado por el material, las dimensiones y las propiedades superficiales de las partículas. Parámetros como la concentración de partículas, la velocidad del menisco, la temperatura y la tensión superficial de la suspensión son los únicos parámetros que influyen en el rendimiento del proceso de modelado. El lector puede encontrar una descripción detallada de la influencia de los parámetros antes mencionados en el proceso de patronaje en13,14,15. En la tecnología sCAPA original13,14,15, el proceso de modelado coloidal se llevó a cabo en un sistema abierto y requirió una etapa piezoeléctrica de alta precisión para impulsar la suspensión a través de la plantilla. Esta plataforma explota una estrategia diferente y permite realizar el patronaje con equipos estándar generalmente utilizados en microfluídica en un entorno controlado, minimizando así los riesgos de contaminación de las muestras.

Esta plataforma microfluídica se optimizó primero en partículas coloidales para crear matrices regulares de partículas inertes y luego se aplicó con éxito a las bacterias. Ambas plataformas microfluídicas se describen en este documento (Figura 1B, C). La mayoría de los pasos preparatorios y el equipo experimental descrito en el protocolo son comunes para las dos aplicaciones (Figura 2). Informamos sobre patrones coloidales para demostrar que la técnica se puede utilizar para realizar múltiples deposiciones secuenciales en la misma superficie para crear patrones complejos y multimateriales. En particular, se depositó una sola partícula por trampa para cada paso para formar matrices coloidales con una geometría y composición específicas, dictadas únicamente por la geometría de las trampas y la secuencia de llenado. En cuanto al patrón bacteriano, se describen deposiciones individuales, lo que resulta en un depósito de una bacteria por trampa. Una vez que las células están modeladas en la superficie, el canal microfluídico se enjuaga con medio para promover el crecimiento bacteriano, el paso preliminar de cualquier estudio unicelular.

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Protocolo

1. Preparación maestra de silicio

NOTA: Las plantillas PDMS que llevan las trampas microfabricadas que forman la plantilla para patrones coloidales y microbianos se fabricaron de acuerdo con el método introducido por Geissler et al. ¹⁷. El maestro de silicio fue preparado por litografía convencional en una sala blanca. Consulte los siguientes pasos para conocer el procedimiento y la Tabla de materiales para el equipo.

1. Diseñe las características utilizando software de diseño asistido por computadora (CAD).
2. Prepare la máscara de vidrio cromado con una capa de fotorresistente positiva exponiendo las características diseñadas con un escritor láser directo UV.
   1. Desarrolle la máscara de vidrio cromado con un revelador de giro utilizando un revelador en una proporción de fotorresistencia a agua de 1: 4 durante 15 s.
   2. Sumergir la mascarilla en cromo etchant durante 50 s.
   3. Tratamiento con plasma de una oblea de silicio de 10 cm durante 3 min a 600 W.
   4. Deposita vapor una capa de hexametildisilizano y hornea a 110 °C para mejorar la adhesión hacia la fotorresistente.
   5. Deposite una capa de fotorresistente a 4.500 × g durante 2 min.
   6. Exponga la función a los rayos UV a través de la máscara de vidrio cromado con un alineador de máscara para 2 s y desarrolle con un revelador como para la máscara.
3. Para completar la fabricación del maestro de silicio, grabe la oblea a través de un intercambio iónico reactivo profundo, ajustando el tiempo de grabado (<2 min) para lograr la profundidad deseada (medida con un perfilómetro).

2. Preparación de moldes de microcanales

1. Diseñe el canal con software CAD y córtelo con un software de segmentación de datos para convertir el modelo diseñado en instrucciones para la impresora 3D, estableciendo la distancia de corte en 0,05 mm.
2. Imprima el canal con una impresora 3D durante ~1 h.
3. Lave y postcure el molde en una máquina de curado y lavado dedicada.
   1. Coloque el molde en un recipiente lleno de alcohol isopropílico puro (IPA) y vórtice el líquido (lave durante 20 min). Saque el recipiente lleno de IPA de la máquina.
   2. Una vez que el molde lavado se retire del recipiente IPA, vuelva a colocarlo en la lavadora y curadora y vuelva a colocarlo durante 15 minutos a 35 ° C.
      NOTA: La Tabla de Materiales informa de la impresora 3D y de la máquina de curado y lavado utilizada en el protocolo de preparación del molde. El modelo 3D fue cortado con el software de rebanadora patentado de la impresora 3D.
4. Coloque la impresión en un horno UV durante 12 h y colóquela en un horno a 80 °C durante 12 h.
   NOTA: Este paso garantiza que todo el polímero esté curado y que todo el polímero sin curar se elimine de la impresión, ya que evitaría que el PDMS se cure.
5. Silanizar el molde a través de la deposición de vapor de tricloro (1H, 1H, 2H, 2H-perfluorooctil) silano.
   1. Coloque el molde 3D en un desecador al vacío junto con 20 μL de tricloro 100% concentrado (1H, 1H, 2H, 2H-perfluorooctil) silano pipeteado en una lámina de aluminio colocada cerca del molde.
   2. Crea un vacío en el desecador para generar vapor y deja actuar durante 40 min.
   3. Retire el molde del desecador y enjuáguelo con etanol puro antes de verter PDMS sobre él.

3. Fabricación del chip microfluídico

1. Preparar una mezcla PDMS mezclando el elastómero con su agente de reticulación (Tabla de Materiales). Revuelva la mezcla vigorosamente para mezclar los dos componentes de manera uniforme hasta que se formen burbujas de aire y la mezcla de PDMS se vea opaca.
   NOTA: La cantidad de reticulante debe ser del 10% en peso de la cantidad de elastómero.
2. Desgasifica la mezcla de elastómero y agente de reticulación en un desecador al vacío para eliminar las burbujas de aire atrapadas. Transfiera la mezcla en el desecador al recipiente utilizado para mezclar (paso 3.1). Continúe el proceso de desgasificación hasta que se hayan eliminado todas las burbujas y la mezcla se vea transparente nuevamente.
   NOTA: El tiempo normalmente requerido para la desecación es de 30 minutos.
3. Vierta 3 g de la mezcla en el maestro de silicio para producir la plantilla, que servirá como el "piso" del chip microfluídico.
   NOTA: El grosor de la capa PDMS se puede ajustar cambiando la cantidad de mezcla vertida en el maestro de silicio.
   1. Para obtener una plantilla de 400 μm de espesor, vierta 3 g de PDMS en el maestro de silicio, coloque el maestro de silicio en un recubrimiento de espín y gire la capa a 21 × g durante 5 s y 54 × g durante 10 s, y luego desgasifique nuevamente como se describe en el paso 3.2 para eliminar las burbujas de aire atrapadas.
4. Vierta 20 g de la mezcla PDMS en el molde impreso en 3D para hacer el microcanal, que servirá como el "techo" del chip microfluídico, y desgasifique como se describe en el paso 3.2 durante 30 minutos.
5. Hornea tanto la oblea de silicio como el molde impreso en 3D a 70 °C durante al menos 2 h.
6. Despegue la capa pdms del molde impreso en 3D, corte el PDMS con una cuchilla alrededor de los microcanales y perfore los orificios que servirán como entrada y salida del canal microfluídico.
7. Despegue el PDMS del maestro de silicio y corte la capa de PDMS en trozos más pequeños con las mismas dimensiones de los canales microfluídicos que se unirán en la parte superior de las plantillas.
8. Frote suavemente las plantillas y los microcanales con una solución de detergente al 1% (consulte la Tabla de materiales) durante 5 minutos y luego enjuague con agua desionizada. A continuación, enjuague las plantillas y microcanales con isopropanol y enjuáguelos con agua desionizada. Seque las plantillas y microcanales a temperatura ambiente durante 1 min con aire comprimido a 1 bar.
9. Coloque las plantillas y los microcanales en un limpiador de plasma con las superficies a unir hacia arriba. Encienda el limpiador de plasma y trate con plasma las plantillas y los microcanales durante 40 s. Sácalos del limpiador de plasma e inmediatamente une los microcanales en la parte superior de las plantillas poniéndolos en contacto entre sí.
10. Almacene los chips microfluídicos en un horno a 70 °C durante cinco días para garantizar la recuperación hidrofóbica de PDMS y tener un ángulo de contacto de retroceso dentro del rango óptimo, entre 30 y 60 °^10,11.

4. Patrón bacteriano

1. Un día antes del experimento, crece una población de Escherichia coli (cepa MG1655 prpsM-GFP). Inocular el cultivo directamente del caldo congelado y crecer durante la noche durante 20 h en caldo de lisogenia (LB) medio en una incubadora agitadora a 37 °C. Añadir 50 μg/ml de kanamicina para que las células retengan el plásmido prpsM-GFP.
2. El día del experimento, ajuste la incubadora de cajas (Figura 2A) a 37 °C varias horas antes del experimento para tener una temperatura uniforme y estable antes de comenzar el experimento. Configure la bomba de jeringa y la placa de vidrio calentada en la etapa del microscopio (Figura 2B, C), ajustando la temperatura a la misma temperatura que la incubadora de cajas.
   NOTA: La incubadora de cajas en la que se encierra todo el sistema, incluido el microscopio (Figura 2E), garantiza que se mantenga una temperatura uniforme y constante durante todo el experimento cuando el canal se enjuaga con medio.
3. Noventa minutos antes del experimento, coloque el chip microfluídico en un recipiente lleno de etanol al 100% (EtOH) y enjuague el canal con 100% etOH durante al menos 10 minutos. Coloque el chip microfluídico en un desecador al vacío y desgasifique durante al menos 30 minutos. Intercambie el EtOH con agua destilada y trate al vacío el chip durante al menos 30 minutos. Coloque el chip microfluídico en el horno a 70 °C durante 10 minutos para eliminar cualquier rastro de líquido que quede en el canal.
   NOTA: Este paso es necesario para evitar la formación de burbujas en el canal cuando se enjuaga con medio de cultivo. Este protocolo de prevención de burbujas fue adaptado de Wang et ^al.18.
4. Pipetear 1 ml de medio de ácido 3-(N-morfolino)propanosulfónico (MOPS) (1x) en un vial de centrífuga y añadir 10 μL de fosfato potásico de 0,132 M (_K2HPO4). Saque el cultivo nocturno de la incubadora de 37 °C y alícuota 100 μL en el vial de la centrífuga y centrífique el cultivo a 2.300 × g durante 2 min. Pipetee suavemente el sobrenadante de los viales de la centrífuga y resuspenda el pellet en 1 ml de medio MOPS fresco con 0.015% v / v de Tween 20 y 0.01% v / v de fosfato de potasio.
   NOTA: La concentración típica de la suspensión bacteriana está en el rango de 0.015-0.15 vol%, lo que asegura la formación de una zona de acumulación extendida y móvil y evita la acumulación de partículas en el sustrato. Reemplazar el medio nocturno con un medio fresco minimiza los riesgos de liberar películas de bacterias en la plantilla. La falta de fuente de carbono en el medio fresco impide que las células crezcan en la suspensión durante el modelado de la plantilla. Es necesaria una concentración de 0.015% v/v de Tween 20 en la suspensión para que el ángulo de contacto del líquido que retrocede en la plantilla PDMS caiga dentro del rango óptimo, entre 30 y 60°.
5. Cargue la suspensión bacteriana en una jeringa de 1 ml y conecte la jeringa al chip a través de tubos microfluídicos.
   1. Para asegurar la conexión entre la jeringa y el tubo, inserte directamente una aguja con un diámetro exterior de 0,6 mm en el tubo. Para evitar la dispersión de cualquier suspensión que quede en la vecindad de la entrada a través del canal, enjuague el medio fresco a través del orificio utilizado como salida durante el proceso de modelado (Figura 3A-III), en lugar del orificio utilizado como entrada.
   2. Monte la jeringa en la bomba de la jeringa e inyecte la suspensión en el chip microfluídico a través de la entrada ubicada en la parte aguas arriba del canal hasta que la suspensión cubra la región de la plantilla con trampas.
      NOTA: Durante el proceso de inyección de líquido, el aire puede escapar a través de una salida ubicada en el extremo aguas abajo del canal.
   3. Ajuste la bomba de la jeringa para retirar la suspensión bacteriana (Figura 3A-I) a un caudal de 0,07-0,2 μL/min, que en la geometría descrita corresponde a una velocidad de retroceso del menisco de 80-100 μm/min.
   4. Monitoree el proceso de modelado a través del software del microscopio.
      NOTA: Aquí, se utilizó un aumento de 10x para monitorear el menisco en retroceso en la plantilla, y se usó un aumento de 20x para monitorear la deposición de bacterias individuales en las trampas microfabricadas.
6. Una vez que la plantilla haya sido modelada con celdas (Figura 3A-II), aumente el caudal de extracción para vaciar rápidamente el canal microfluídico y enjuáguelo con LB fresco que se desgasificó previamente durante al menos 30 min y se precalenció a 30 ° C.
7. Ajuste la bomba de la jeringa a un caudal de 2 μL/min para enjuagar suavemente el canal. Una vez que se haya llenado el canal, aumente el caudal (15 μL/min) de acuerdo con las necesidades experimentales específicas.
8. Adquiera imágenes de bacterias en crecimiento en el aumento deseado y el intervalo de tiempo.

5. Patrón coloidal

1. Pipetear 900 μL de una solución acuosa Tween 20 al 0,015% v/v en un vial de centrífuga y pipetear 100 μL de la suspensión coloidal original en él. Centrifugar la suspensión a 13.500 × g durante 1 min. Retire suavemente el sobrenadante y reemplácelo con la solución acuosa Tween 20 (0.015% v / v). Repita este proceso tres veces para garantizar la sustitución completa del disolvente del proveedor de la suspensión de stock.
2. Cargue la suspensión coloidal en una jeringa de 1 ml y conecte la jeringa al chip a través de tubos microfluídicos. Inyecte la suspensión en el chip microfluídico a través de la entrada ubicada dentro de la sección central, en la parte aguas arriba del canal, y empuje gradualmente la suspensión hasta que la plantilla esté cubierta.
3. Retire la suspensión coloidal a un caudal de 0,07-0,2 μL/min, que corresponde a una velocidad de retroceso del menisco de 1-2 μm/min, e imagine el proceso de modelado mediante un software de microscopio. Use un aumento de 10x para monitorear el menisco que retrocede en la plantilla y un aumento de 20x para observar la deposición de partículas individuales en las trampas microfabricadas. Aumente el caudal una vez que el menisco llegue al final de la plantilla para vaciar el canal rápidamente.
   NOTA: Las matrices coloidales compuestas de varias partículas se pueden producir ejecutando el proceso de modelado de los pasos 5.1 a 5.3 en serie. El canal se carga con una nueva suspensión coloidal en cada iteración de acuerdo con la composición de las matrices coloidales deseadas. Cada paso de modelado agrega una partícula a la matriz coloidal y se puede ejecutar secuencialmente hasta que las trampas se hayan llenado con la secuencia de partículas deseada. La composición de las matrices coloidales resultantes viene dada únicamente por la secuencia de suspensiones coloidales utilizadas para llenar las trampas (Figura 3B).

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Resultados

Se desarrolló una plataforma microfluídica que explota el ensamblaje asistido por capilaridad para modelar partículas coloidales y bacterias en trampas microfabricadas en una plantilla PDMS. Se han diseñado dos geometrías de canal diferentes para optimizar el modelado de coloides y bacterias a través del ensamblaje asistido por capilaridad. La primera geometría del canal (Figura 1B) consta de tres secciones paralelas de 23 mm de largo sin barrera física entre ellas. Las dos secciones...

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Discusión

La plataforma microfluídica descrita aquí permite el modelado de objetos de tamaño micro, como coloides y bacterias, en arreglos espaciales prescritos en un sustrato PDMS. El control total sobre las condiciones ambientales que ofrece la microfluídica y la capacidad de modelar células con precisión micrométrica otorgada por la tecnología sCAPA lo convierten en una plataforma muy prometedora para futuros estudios de fisiología y ecología.

En los experimentos presentados en este trabajo...

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Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
Alcatel AMS 200SE I-Speeder	Alcatel Micro Machining System		deep reactive ion exchange system
Alconox			detergent
AZ400K developer	MicroChemicals	AZ400K
BD 10 mL Syringe (Luer-Lock)	BD	300912	used to flush fresh Lysogeny broth into the microfluidic channel
Box Incubator	Life Imaging Services		used to ensure a uniform and constant temperature in the channel
Centrifuge	Eppendorf	5424R	used to replace the overnight media with fresh minimal media
Centrifuge vial	Eppendorf	30120086	1.5 mL
CETONI Base 120	CETONI GmbH		syringe pump
Fluorescent PS particles of diameter 0.98 µm (red)	microParticles GmbH	PS-FluoRed-Fi267
Fluorescent PS particles of diameter 1.08 µm (green)	microParticles GmbH	PS-FluoGreen-Fi182
Fluorescent PS particles of diameter 2.07 µm (green)	microParticles GmbH	PS-FluoGreen-Fi183
Fluorescent PS particles of diameter 2.08 µm (red)	microParticles GmbH	PS-FluoRed-Fi180
Gigabatch 310 M	PVA TePla		used to plasma treat a 10 cm silicon wafer
H401-T-CONTROLLER	Okolab		controller of the heated glass plate
H601-NIKON-TS2R-GLASS	Okolab		heated glass plate
Heidelberg DWL 2000	Heidelberg Instruments		UV direct laser writer
Insulin syringes, U 100, with luer	Codan Medical ApS	CODA621640	1 mL syringe used to withdraw the liquid suspension during the patterning process
Klayout	Opensource		used to design the features on the silicon master
LB Broth, Miller (Luria-Bertani)	Fisher Scientific	244610	Lysogeny broth flushed into the microfluidic channel
Masterflex transfer tubing	Masterflex	HV-06419-05	0.020'' ID, 0.06'' OD
MOPS (10x)	Teknova	M2101	diluted tenfold with milliQ water and used to replace the overnight medium
Nikon Eclipse Ti2	Nikon Instruments		microscope
openSCAD	Opensource		used to design the mold
OPTIspin SB20	ATM group	51-0002-01-00	spin developer
Plasma chamber Zepto	Diener Electronic	ZEPTO-1	used to plasma treat the template and microchannel to bond them
Positive photoresist AZ1505	MicroChemicals	AZ1505
Potassium phosphate dibasic	Sigma Aldrich	P3786	added to MOPS 1x
Prusa curing and Washing machine CW1S	Prusa		used to ensure all polymer is cured and uncured polymer is removed from the mold
Prusa Resin - Tough	Prusa Research a.s.		UV photosensitive 405nm liquid resin for 3D printing
Prusa SL1 3d printer	Prusa		used to print the mold
Scale	VWR-CH	611-2605	used to weight PDMS mixture
Silicon wafer (10 cm)	Silicon Materials Inc.		N/Phos <100> 1-10 Ω cm
Süss MA6 Mask aligner	SUSS MicroTec Group		used to align the chrome-glass mask and the substrate, and expose the substrate
Sylgard 184	Dow Corning		silicone elastomer kit; curing agent
Techni Etch Cr01	Technic		chromium etchant
Trichloro (1H, 1H, 2H, 2H-perfluorooctyl) silane	Sigma Aldrich	448931	used to silianize the 3D printed mold
TWEEN 20	Sigma Aldrich	P1379	used to ensure an optimal receding contact angle during the patterning process
Veeco Dektak 6 M	Veeco		profilometer
VTC-100 Vacuum Spin Coater	MTI corporation		vacuum spin coater