Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • النتائج
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

يصف هذا البروتوكول مجموعة من الطرق التي تتضمن كروماتوغرافيا استبعاد الحجم التحليلي لدراسة قلة القلة واستقرارية هيستون ، ومقايسة السحب لأسفل لكشف تفاعلات هيستون تشابيرون هيستون ، والجامعة الأمريكية بالقاهرة لتحليل القياس المتكافئ لمجمعات البروتين ، ومقايسة مرافقة هيستون لتوصيف وظيفيا لمرافقة هيستون مفترضة في المختبر.

Abstract

ترتبط بروتينات الهستون بالحمض النووي (DNA) لتكوين الكروماتين حقيقي النواة. الوحدة الأساسية للكروماتين هي نيوكليوسوم ، يتكون من ثماني هيستون يتكون من نسختين من الهستونات الأساسية H2A و H2B و H3 و H4 ، ملفوفة حول الحمض النووي. يتكون الأوكتامير من نسختين من ثنائي H2A / H2B ونسخة واحدة من رباعي H3 / H4. الهستونات الأساسية عالية الشحنة عرضة لتفاعلات غير محددة مع العديد من البروتينات في السيتوبلازم الخلوي والنواة. تشكل مرافقات هيستون فئة متنوعة من البروتينات التي تنقل الهستونات من السيتوبلازم إلى النواة وتساعد على ترسبها على الحمض النووي ، وبالتالي تساعد في عملية تجميع النيوكليوسوم. بعض مرافقي هيستون محددون إما ل H2A / H2B أو H3 / H4 ، وبعضها يعمل كمرافقين لكليهما. يصف هذا البروتوكول كيف يمكن استخدام التقنيات المختبرية في المختبر مثل المقايسات المنسدلة ، وكروماتوغرافيا استبعاد الحجم التحليلية ، والطرد المركزي التحليلي الفائق ، ومقايسة مرافقة هيستون جنبا إلى جنب لتأكيد ما إذا كان بروتين معين يعمل كمرافق هيستون.

Introduction

تشكل النيوكليوسومات المكونة من الحمض النووي وبروتينات هيستون الوحدة الهيكلية للكروماتين وتنظم العديد من الأحداث الخلوية الحرجة. يتم تغيير موضع النيوكليوسومات ديناميكيا وإعادة تشكيلها لجعل الحمض النووي في متناول العمليات المختلفة مثل النسخ المتماثل والنسخ والترجمة 1,2. الهستونات الأساسية للغاية إما تميل إلى التفاعل مع البروتينات الحمضية في الوسط الخلوي أو تخضع للتجميع ، مما يؤدي إلى عيوب خلوية مختلفة3،4،5. تساعد مجموعة من البروتينات المخصصة تسمى مرافقو هيستون في نقل الهستونات من السيتوبلازم إلى النواة ومنع أحداث تجميع الحمض النووي الهستون الشاذة 6,7. بشكل أساسي ، تقوم معظم مرافقات الهستون بتخزين ونقل الهستونات إلى الحمض النووي بالقوة الأيونية الفسيولوجية ، مما يساعد على تكوين النيوكليوسومات 8,9. بعض مرافقي هيستون لديهم تفضيل واضح لأوليغومرات هيستون H2A / H2B أو H3 / H410.

تتميز مرافقات هيستون بناء على قدرتها على تجميع النيوكليوسومات المعتمدة أو المستقلة عن تخليق الحمض النووي11. على سبيل المثال ، يعتمد عامل تجميع الكروماتين -1 (CAF-1) بينما منظم هيستون A (HIRA) مستقل عن تخليق الحمض النووي12,13. وبالمثل ، تشارك عائلة النيوكليوبلازمين من مرافقي هيستون في تكثيف كروماتين الحيوانات المنوية وتجميع النيوكليوسوم14. يسهل أفراد عائلة بروتين تجميع النيوكليوسوم (NAP) تكوين هياكل تشبه النيوكليوسوم في المختبر ويشاركون في نقل الهستونات بين السيتوبلازم والنواة15. تعتبر كل من بروتينات عائلة النيوكليوبلازمين وبروتينات عائلة NAP مرافقين هيستون وظيفيين ولكنهما لا يشتركان في أي ميزات هيكلية. بشكل أساسي ، لا توجد ميزة هيكلية واحدة تسمح بتصنيف البروتين على أنه مرافقة هيستون16. يعمل استخدام المقايسات الوظيفية والفيزيائية الحيوية جنبا إلى جنب مع الدراسات الهيكلية بشكل أفضل في توصيف مرافقي الهستون.

يصف هذا العمل الطرق البيوكيميائية والفيزيائية الحيوية لتوصيف البروتين على أنه مرافقة هيستون تساعد على تجميع النيوكليوسوم. أولا ، تم إجراء كروماتوغرافيا استبعاد الحجم التحليلي لتحليل حالة قلة القسيمات واستقرار مرافقي هيستون. بعد ذلك ، تم إجراء اختبار منسدل لتحديد القوى الدافعة والطبيعة التنافسية لتفاعلات هيستون المرافقة والهيستون. ومع ذلك ، لا يمكن حساب المعلمات الهيدروديناميكية لهذه التفاعلات بدقة باستخدام كروماتوغرافيا استبعاد الحجم التحليلية بسبب شكل البروتين ومعقداته التي تؤثر على هجرتها عبر العمود. لذلك ، تم استخدام الطرد المركزي التحليلي الفائق ، والذي يوفر خصائص جزيئية كبيرة في المحلول تشمل الوزن الجزيئي الدقيق ، والقياس المتكافئ للتفاعل ، وشكل الجزيئات البيولوجية. استخدمت الدراسات السابقة على نطاق واسع مقايسة مرافقة هيستون في المختبر لتوصيف مرافقي هيستون وظيفيا مثل yScS116 17 و DmACF18 و ScRTT106p19 و HsNPM120. كما تم استخدام مقايسة مرافقة هيستون لتوصيف البروتينات وظيفيا على أنها مرافقة هيستون.

Protocol

1. كروماتوغرافيا استبعاد الحجم التحليلي لتوضيح الحالة قليلة القسيمات واستقرار مرافقي هيستون

  1. تحليل الحالة قليلة القسيمات لمرافقي هيستون
    1. موازنة عمود كروماتوغرافيا استبعاد الحجم التحليلي (SEC) سعة 24 مل مع حجم عمود 1.2 (CV)، أي 28.8 مل من المخزن المؤقت SEC المنزوع الغازات [20 mM من Tris-HCl (الرقم الهيدروجيني 7.5)، و300 من mM كلوريد الصوديوم، و1 mM من β-mercaptoethanol (β-ME)] عند 4 درجات مئوية (انظر جدول المواد).
      ملاحظة: يمكن تحديد نوع العمود وتكوين المخزن المؤقت ودرجة الحموضة العازلة بناء على البروتين محل الاهتمام. يجب ألا يتجاوز حجم حقن العينة 500 ميكرولتر لعمود 24 مل. أيضا ، يجب الحفاظ على ضغط العمود أقل من 5 ميجا باسكال.
    2. من محلول مخزون بروتين عالي التركيز ، قم بإعداد 500 ميكرولتر من عينة بروتين 0.5 مجم / مل في محلول SEC منزوع التفريغ وحقنه في العمود المتوازن مسبقا باستخدام حلقة حقن 500 ميكرولتر. اسمح بتشغيل الكروماتوغرافيا بالمضي قدما بمعدل تدفق متساوي يبلغ 0.2-0.3 مل / دقيقة مع المخزن المؤقت SEC عند 4 درجات مئوية.
    3. راقب ملف شطف البروتين عن طريق قياس الامتصاص بطول موجي يبلغ 280 نانومتر. عند التعامل مع البروتينات التي تفتقر إلى المخلفات العطرية ، قم بقياس الامتصاص عند 214 نانومتر.
    4. استخدم حجم شطف البروتين لحساب وزنه الجزيئي التقريبي بالكيلو دالتون باستخدام منحنى المعايرة القياسي21.
      ملاحظة: يتم تحضير منحنى المعايرة عن طريق رسم حجم الاحتفاظ ببروتينات الوزن الجزيئي المعروفة مقابل سجل الأوزان الجزيئية الخاصة بها (log Mr) ، والتي يتم استخلاصها باستخدام نفس العمود.
  2. تحليل الاستقرار الحراري لمرافقي هيستون
    1. خذ 500 ميكرولتر من 0.5 مجم / مل من عينة البروتين المحضرة في محلول SEC منزوع التفريغ (نفس المستخدم في 1.1.1) في أنابيب الطرد المركزي الدقيقة الفردية وقم بتسخين كل أنبوب إلى درجة حرارة معينة تتراوح بين 20 درجة مئوية و 90 درجة مئوية (20 درجة مئوية و 40 درجة مئوية و 60 درجة مئوية و 90 درجة مئوية) لمدة 10 دقائق في حمام مائي.
    2. بعد ذلك ، قم بالطرد المركزي للعينات المعالجة حراريا عند 16200 × جم لمدة 10 دقائق عند 4 درجات مئوية ، وجمع المادة الطافية باستخدام ماصة دقيقة ، وحقن كل عينة على حدة باستخدام حلقة حقن 500 ميكرولتر في العمود التحليلي ، متوازنة مسبقا مع المخزن المؤقت SEC عند 4 درجات مئوية.
    3. اسمح بتشغيل الكروماتوغرافيا بالمضي قدما بمعدل تدفق متساوي يبلغ 0.2-0.3 مل / دقيقة مع المخزن المؤقت SEC عند 4 درجات مئوية.
    4. راقب موضع وارتفاع قمم الشطف وابحث عن ظهور قمم إضافية للعينات المختلفة.
  3. تحليل الاستقرار الكيميائي لمرافقي هيستون
    1. لفحص استقرار الملح لمرافقي الهستون ، احتضان 500 ميكرولتر من عينة بروتين 0.5 مجم / مل محضرة في محلول تريس [20 مللي مول من Tris-HCl (درجة الحموضة 7.5) ، و 1 مللي مول من β-ME] مكملة بتركيزات متزايدة من كلوريد الصوديوم (300 مللي متر ، 600 مللي متر ، 1 م ، 1.5 م ، و 2 م) في أنابيب طرد مركزي دقيقة منفصلة لمدة 30 دقيقة عند 4 درجات مئوية. جهاز طرد مركزي للعينات عند 16200 × جم لمدة 10 دقائق عند 4 درجات مئوية والاحتفاظ بالطارد.
    2. بعد ذلك ، قم بتحميل عينات البروتين بتركيزات مختلفة من كلوريد الصوديوم بشكل فردي ، باستخدام حلقة حقن 500 ميكرولتر في العمود التحليلي المتوازن مسبقا ب 1.2 CV (28.8 مل) من المخزن المؤقت المعني الذي يحتوي على تركيزات متزايدة من كلوريد الصوديوم عند 4 درجات مئوية.
    3. اسمح بتشغيل الكروماتوغرافيا بالمضي قدما بمعدل تدفق متساوي من 0.2-0.3 مل / دقيقة مع 1 CV (24 مل) من المخزن المؤقت المعني عند 4 درجات مئوية.
    4. راقب موضع وارتفاع قمم الشطف وابحث عن ظهور قمم إضافية للعينات المختلفة.
    5. وبالمثل ، لتحليل استقرار اليوريا ، احتضان 500 ميكرولتر من عينة بروتين 0.5 مجم / مل محضرة في محلول تريس [20 مللي مول من Tris-HCl (درجة الحموضة 7.5) ، و 1 مللي مول من β-ME] تستكمل بتركيزات اليوريا المتزايدة (1 م ، 2 م ، 3 م ، 4 م ، و 5 م) في أنابيب طرد مركزي دقيقة منفصلة لمدة 16 ساعة في درجة حرارة الغرفة. قم بالطرد المركزي للعينات عند 16200 × جم لمدة 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة واحتفظ بالطارد.
    6. بعد ذلك ، قم بتحميل عينات البروتين المعالجة باليوريا بشكل فردي باستخدام حلقة حقن 500 ميكرولتر في العمود التحليلي المتوازن مسبقا ب 1.2 CV (28.8 مل) من المخزن المؤقت المقابل الذي يحتوي على تركيزات مختلفة من اليوريا في درجة حرارة الغرفة.
    7. اسمح بتشغيل الكروماتوغرافيا بالمضي قدما بمعدل تدفق متساوي يبلغ 0.2-0.3 مل / دقيقة مع 1 CV (24 مل) من المخزن المؤقت المعني في درجة حرارة الغرفة.
      تنبيه: لا تقم بإجراء التجارب باستخدام مخزن مؤقت يحتوي على اليوريا عند درجة حرارة منخفضة لأن اليوريا تميل إلى التبلور وإتلاف العمود.
    8. راقب موضع وارتفاع قمم الشطف وابحث عن ظهور قمم إضافية للعينات المختلفة.

2. مقايسات منسدلة قائمة على تدرج الملح لفهم نوع التفاعلات التي تساهم في التكوين المعقد بين أوليغومرات هيستون ومرافقة هيستون

  1. لكل تفاعل من مقايسة السحب لأسفل ، ماصة 40 ميكرولتر من راتنج Ni-NTA في عمود دوران وتغسل بالماء المقطر المزدوج المعقم. بعد ذلك ، قم بموازنة الراتنج مع 100 CV (4 مل) من محلول التوازن [20 mM من Tris-HCl (الرقم الهيدروجيني 7.5) ، 300 mM من NaCl ، 10 mM من imidazole ، 10 μg / mL من BSA ، و 1 mM من β-ME] (انظر جدول المواد).
    ملاحظة: يمكن أيضا إجراء السحب لأسفل في أنبوب طرد مركزي دقيق سعة 1.5 مل.
  2. قم بإعداد العينة عن طريق خلط 5 ميكرومتر من مرافقة هيستون الموسومة بعلامة His-taged مع 20 ميكرومتر من هيستون H2A / H2B dimer أو H3 / H4 tetramer في مخزن التوازن المؤقت. احتضان العينة على الجليد لمدة 1 ساعة.
    ملاحظة: يتم تحضير ثنائي H2A / H2B ورباعي H3 / H4 من الهستونات البشرية المؤتلفة21 ، ويتم تأكيد سلامة oligomers بناء على الكتل الجزيئية المقدرة بواسطة الطرد المركزي التحليلي الفائق (AUC). تم استخدام نفس أوليغومرات هيستون لجميع التجارب المذكورة أدناه.
  3. قم بتحميل العينات في أعمدة دوران منفصلة متوازنة مسبقا براتنج Ni-NTA من الخطوة 2.1 ، كل منها مسمى لتركيز ملح معين ، واحتفظ بالأعمدة لمدة 30 دقيقة عند 4 درجات مئوية. أجهزة الطرد المركزي الأعمدة في 1000 × ز لمدة 1 دقيقة.
  4. بعد ذلك ، اغسل الأعمدة ب 100 CV (4 مل) من محلول الغسيل [20 mM من Tris-HCl (درجة الحموضة 7.5) ، و 50 mM من الإيميدازول ، و 0.2٪ من Tween-20 ، و 1 mM من β-ME] تحتوي على تركيزات ملح مختلفة (أي 300 mM ، 500 mM ، 600 mM ، 700 mM ، 800 mM ، 900 mM و 1 M NaCl). اغسل كل عمود بمخزن مؤقت يحتوي على تركيز ملح معين.
  5. بعد خطوة غسل الملح ، قم بإخراج البروتين من الأعمدة المختلفة باستخدام 100 ميكرولتر من محلول الشطف [20 مللي متر من Tris-HCl (درجة الحموضة 7.5) ، 300 مللي متر من كلوريد الصوديوم ، 300 مللي متر من إيميدازول ، و 1 مللي متر من β-ME].
  6. بعد ذلك ، قم بإخضاع العينات المستخلصة إلى 18٪ SDS-PAGE22 وتصور الجل بعد تلطيخه باستخدام Coomassie Brilliant Blue R250 (انظر جدول المواد). بدلا من ذلك ، يمكنك تحميل الراتنج مباشرة على هلام SDS-PAGE بدلا من استخلاص البروتين المرتبط من راتنج Ni-NTA.
    ملاحظة: يمكن تعديل تركيبات الموازنة والغسيل والشطف المؤقت ودرجة الحموضة اعتمادا على البروتين محل الاهتمام.

3. مقايسة منسدلة تنافسية لتحديد تفضيل مرافق هيستون ل H2A / H2B أو H3 / H4

  1. تحضير عمود الدوران كما هو موضح في الخطوة 2.1
  2. احتضان 5 ميكرومتر من مرافقة هيستون مع 20 ميكرومتر من ثنائي H2A / H2B في 300 ميكرولتر من مخزن التوازن المؤقت (محضر في الخطوة 2.1) لمدة 30 دقيقة على الجليد.
    ملاحظة: يمكن اختيار نسبة أوليغومر هيستون إلى هيستون تشابيرون في التفاعل بناء على بيانات القياس المتكافئ المعروفة ؛ استخدم هيستون الزائد بخمسة أضعاف في حالة عدم توفر معلومات.
  3. قم بالطرد المركزي لمركب histone chaperone-H2A / H2B عند 16200 × جم لمدة 5 دقائق عند 4 درجات مئوية لإزالة أي راسب. بعد ذلك ، قم بتحميل العينة على عمود الدوران المتوازن مسبقا مع مخزن التوازن المؤقت (المعد في الخطوة 2.1) واحتضانها لمدة 30 دقيقة عند 4 درجات مئوية.
  4. اغسل العمود ب 100 CV (4 مل) من محلول الغسيل [20 ملي مول من Tris-HCl (الرقم الهيدروجيني 7.5) ، و 300 مللي متر من كلوريد الصوديوم ، و 50 ملي متر من الإيميدازول ، و 0.2٪ من Tween-20 ، و 1 ملي متر من β-ME] لإزالة ديمر H2A / H2B الزائد. بعد ذلك ، امزج مركب هيستون chaperone-H2A / H2B مع 20-60 ميكرومتر من رباعي H3 / H4 واحتضانه لمدة 30 دقيقة على الجليد.
  5. أعد غسل العمود ب 100 CV (4 مل) من مخزن الغسيل المؤقت (معد في الخطوة 3.4) لإزالة أي رباعي H3 / H4 غير منضم وتخفيف العينة باستخدام مخزن الشطف المؤقت (معد في الخطوة 2.5). قم بإخضاع العينات المستخلصة إلى 18٪ SDS-PAGE وتصورها بعد تلطيخها باستخدام Coomassie Brilliant Blue R250.
    ملاحظة: يمكن عكس الفحص حيث ، أولا ، يمكن خلط رباعي H3 / H4 مع المرافق ، ويسمح للمجمع بالارتباط بخرز Ni-NTA ، ثم يتم تحضين المركب بتركيزات متفاوتة من H2A / H2B dimer.

4. تجارب الطرد المركزي التحليلي - سرعة الترسيب (AUC-SV) لتحليل القياس المتكافئ بين مرافقي الهستون والهستونات

  1. تحضير العينة للجامعة الأمريكية بالقاهرة
    1. قم بتحليل هيستون H2A / H2B dimer المعاد تشكيله ، ورباعي H3 / H4 ، ومرافقة هيستون بشكل منفصل من خلال أنبوب غسيل الكلى المقطوع 7 كيلو دالتون 23 ، مقابل مخزن غسيل الكلى [20 mM من Tris (درجة الحموضة 7.5) ، 300 mM من كلوريد الصوديوم ، و 1 mM من β-ME] (انظر جدول المواد). لتقليل خطأ الخلفية بسبب عدم تطابق المخزن المؤقت ، قم بإجراء غسيل الكلى على نطاق واسع ضد المخزن المؤقت لغسيل الكلى ، ويفضل ثلاث مرات خلال فترة 24 ساعة.
      ملاحظة: يجب أن يكون للOD 280 الأولي لعينات البروتين قيمة أعلى بمقدار ضعفين إلى ثلاثة أضعاف لتحقيق OD280 النهائي من 0.3-0.5. يتم ذلك بشكل أساسي لإبطال آثار التخفيف.
    2. قم بتنقية H2A / H2B dimer و H3 / H4 tetramer ومرافقة هيستون بشكل فردي باستخدام المخزن المؤقت لغسيل الكلى ، باستخدام كروماتوغرافيا استبعاد الحجم التحليلي (كما هو مذكور في الخطوة 1). احفظ المخزن المؤقت من المدى لإعداد المزيد من التخفيفات لاحقا واستخدامها كمرجع في خلية AUC.
  2. تحميل عينة للجامعة الأمريكية بالقاهرة
    1. امزج البروتينات المنقاة في حجم نهائي قدره 450 ميكرولتر باستخدام محلول غسيل الكلى من الخطوة 4.1.1 للوصول إلىOD 280 من 0.3-0.6. امزج مرافقة هيستون مع H2A / H2B dimer أو رباعي H3 / H4 لتشكيل معقد في أنابيب تفاعل منفصلة. احتضان مخاليط البروتين لمدة 2-3 ساعات.
      ملاحظة: بدلا من ذلك ، يمكن الحصول على بيانات الترسيب باستخدام نظام المسح الضوئي المتداخل في جهاز الطرد المركزي التحليلي الفائق. بشكل منفصل ، لخلط البروتينات النقية ، قم بإصلاح تركيز هيستون تشابيرون واحتضانه بتركيزات متزايدة من أوليغومرات هيستون للحصول على القياس المتكافئ الدقيق.
    2. قم بتجميع الخلية بقطعة مركزية مزدوجة القطاع ونوافذ كوارتز لتجربة AUC-SV باستخدام كاشف امتصاص لجهاز الطرد المركزي التحليلي الفائق كما هو موضح سابقا بالتفصيل24.
    3. املأ 400 ميكرولتر من محلول العينة و 420 ميكرولتر من محلول غسيل الكلى في القطاعين (العينة والقطاعات المرجعية ، على التوالي) للخلية.
      ملاحظة: يتم استخدام حجم أكبر من المخزن المؤقت في القطاع المرجعي للحفاظ على الغضروف المفصلي المرجعي فوق الغضروف المفصلي للعينة. ومع ذلك ، أثناء استخدام نظام التداخل البصري ، املأ القطاعين بحجم متساو.
    4. قم بوزن الخلايا وموازنتها بدقة وتحميلها في دوار من التيتانيوم بأربعة أماكن (انظر جدول المواد). قم بمحاذاة الخلايا باستخدام العلامات المتوفرة في الجزء السفلي من الخلايا والدوار. قم بتحميل الدوار في جهاز الطرد المركزي ، وأغلق الغطاء واتركه يحدث فراغا حتى ينخفض الضغط إلى أقل من 15 ميكرون من الزئبق وتستقر درجة حرارة الدوار إلى 20 درجة مئوية (عادة ما يستغرق 2-2.5 ساعة).
      ملاحظة: تتضمن معلمات تشغيل AUC درجة الحرارة التجريبية وسرعة الدوار والفاصل الزمني بين عمليات المسح وعدد عمليات المسح التي سيتم جمعها. في حالة تجارب SV ، يتم إعطاء الفاصل الزمني للمسح وفقا للكتلة الجزيئية للبروتين. تتطلب البروتينات الأصغر فترات زمنية أكبر بين عمليات الفحص. يتم ضبط سرعة الدوار أيضا وفقا للكتلة الجزيئية المتوقعة للبروتين ، ويتم إجراء التجربة عند 20 درجة مئوية. تتم مراقبة بيانات الامتصاص عند 280 نانومتر.
    5. للحصول على القياس المتكافئ الدقيق ، حافظ على تركيز هيستون تشابيرون ثابتا واحتضان بتركيزات متزايدة من أوليغومرات هيستون لتحقيق التشبع.
  3. تحليل بيانات الجامعة الأمريكية بالقاهرة
    1. قم بإجراء تحليل البيانات كما هو موضح سابقا25. باختصار ، احسب الكثافة واللزوجة لمكونات المخزن المؤقت باستخدام برنامج SEDNTERP26 (انظر جدول المواد). وبالمثل ، احسب الحجم النوعي الجزئي للبروتين بناء على تركيبة الأحماض الأمينية ، باستخدام SEDNTERP أيضا.
    2. قم بتحميل البيانات من جهاز AUC إلى برنامج SEDFIT27 وحدد الغضروف المفصلي (الخط الأحمر) وأسفل الخلية (الخط الأزرق) وحدود تحليل البيانات (الخطوط الخضراء). اختر توزيع C (s) المستمر كنموذج.
    3. بعد ذلك ، قم بتعيين الدقة القصوى حتى 100 ؛ ضبط معامل الترسيب (S) ، S دقيقة: 0 و S كحد أقصى: 10-15 ؛ اضبط نسبة الاحتكاك على 1.2 في البداية واختر التعويم لاشتقاق النسبة من البيانات ؛ ضبط مستوى الثقة (نسبة F ؛ التي تحدد حجم التنظيم) إلى 0.68 لتنظيم 1 سيغما ؛ قم بتعيين قيم الحجم النوعي الجزئي وكثافة المخزن المؤقت ولزوجة المخزن المؤقت كما تم الحصول عليها من SEDNTERP.
    4. اضغط على RUN للسماح للبرنامج بحل معادلة لام27. اضبط المعلمات إذا كان هناك عدم تطابق كبير في البيانات. بعد ضبط المعلمات ، اضغط على FIT لتحسين جميع المعلمات. قم بتقييم جودة الملاءمة بناء على قيمة انحراف الجذر والمتوسط التربيعي (RMSD) ، والتي يجب أن تكون أقل من 0.01 وحدة إشارة.
    5. قم بتقدير الكتل الجزيئية للقمم عن طريق تحديد الخيار: إظهار الذروة "Mw in c (s)" في وظيفة العرض لشريط الأدوات الرئيسي ، والتي ستوفر معلومات حول "s" للجزيء / المجمع.

5. مقايسة البلازميد فائقة اللف لتأكيد وظيفة مرافقة هيستون

  1. تفاعل تجميع النيوكليوسوم
    1. امزج 2 ميكرومتر من رباعي H3 / H4 و 4 ميكرومتر من ثنائي H2A / H2B مع تركيزات متزايدة من مرافقة هيستون (1-6 ميكرومتر) في مخزن تجميع [20 مللي متر من Tris HCl (درجة الحموضة 7.5) ، 1 مللي متر من DTT ، 1 مللي متر من MgCl2 ، 0.1 مجم / مل من BSA ، و 100 مللي متر من كلوريد الصوديوم] إلى حجم نهائي قدره 50 ميكرولتر. احتضان الخليط عند 4 درجات مئوية لمدة 30 دقيقة.
    2. في نفس الوقت ، في تفاعل منفصل ، قم بمعالجة 500 نانوغرام من بلازميد pUC19 ذو اللف الفائق السالب مع 1 ميكروغرام من إنزيم topoisomerase I (انظر جدول المواد) في مخزن التجميع المؤقت في حجم نهائي قدره 50 ميكرولتر واحتضان عند 30 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة.
      ملاحظة: يعمل Topoisomerase I على إرخاء الحمض النووي البلازميد المزدوج الملتف عن طريق توليد شق مفرد تقطعت به السبل. يمكن استخدام إنزيم توبويزوميراز I من أصل حقيقي النواة ، مثل توبويزوميراز الأول من جنين القمح المتاح تجاريا أو ذبابة الفاكهة المعبر عنها بشكل مؤتلف ذبابة الفاكهة ميلانوجاستر توبويزوميراز I.
    3. بعد ذلك ، ادمج رباعي H3 / H4 ، و H2A / H2B dimer ، وخليط histone chaperone (من الخطوة 5.1.1) ، وخليط تفاعل الحمض النووي البلازميد المريح (من الخطوة 5.1.2) ، واحتضان أكثر عند 30 درجة مئوية لمدة 90 دقيقة.
      ملاحظة: قم بإعداد تفاعلين للتحكم للفحص ؛ أحدهما يحتوي على مرافقة هيستون والحمض النووي البلازميد المريح (ولكن ليس الهستون) والآخر يحتوي على أوليغومرات هيستون والحمض النووي البلازميد المريح (ولكن ليس مرافقة هيستون).
    4. أوقف تفاعل التجميع بإضافة 100 ميكرولتر من المخزن المؤقت 2x (40 مللي متر من EDTA ، و 2٪ من SDS ، و 0.4 مجم / مل من البروتيناز K) واحتضان عند 37 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة.
      ملاحظة: إيقاف المخزن المؤقت يزيل البروتين من الحمض النووي البلازميد عن طريق تمسخ وتحلل البروتين من هستونات مرتبطة.
  2. استخراج الفينول كلوروفورم وترسيب الإيثانول
    1. أضف حجما متساويا من الفينول المشبع بالتريس في الأنبوب الذي يحتوي على خليط التفاعل من الخطوة 5.1.4 واخلطه جيدا ، متبوعا بالطرد المركزي عند 16200 × جم لمدة 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة.
    2. اجمع برفق المرحلة المائية العليا التي تحتوي على الحمض النووي البلازميد مع ماصة دقيقة واخلطها مع حجم متساو من الكلوروفورم. دوامة الخليط وأجهزة الطرد المركزي في 16200 × غرام لمدة 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة.
      ملاحظة: يمكن تضمين كحول الأيزو أميل في هذه الخطوة لتجنب وجود واجهة غامضة بين المرحلتين المائية والعضوية.
    3. بعد ذلك ، اجمع المرحلة المائية العليا ، وأضف 1/10 حجم 3 م أسيتات الصوديوم (درجة الحموضة 5.5) و 2.5 حجم من الإيثانول المثلج (انظر جدول المواد). امزج المحلول جيدا عن طريق قلب الأنبوب 3-4 مرات واحتفظ بالمزيج في مجمد بدرجة حرارة -20 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة لترسيب كامل للحمض النووي البلازميد.
    4. قم بالطرد المركزي للعينة من الخطوة 5.2.3 بسرعة 16200 × جم لمدة 10 دقائق وتخلص من المادة الطافية برفق. أبق الأنابيب مفتوحة في درجة حرارة الغرفة حتى تتبخر كميات ضئيلة من الإيثانول ، تاركة الحمض النووي البلازميد المترسب في الأنبوب.
  3. أداء الكهربائي هلام agarose لمراقبة تأثير supercoiling البلازميد.
    1. قم بإذابة الحمض النووي البلازميد المترسب من الخطوة 5.2.4 في ماء مقطر مزدوج معقم.
    2. قم بتحليل العينات على هلام أغاروز 1٪ في 1x Tris-acetate-EDTA (TAE) عازلة (40 مللي متر من Tris ، و 20 mM من حمض الخليك ، و 1 mM من EDTA) (انظر جدول المواد).
    3. قم بتلطيخ الجل بتركيز 0.2-0.5 ميكروغرام / مل من بروميد الإيثيديوم وراقبه تحت الأشعة فوق البنفسجية لتصور نطاقات الحمض النووي على الجل.

النتائج

تعرض مجال نيوكليوبلازمين N-terminal المؤتلف للبروتين FKBP53 من Arabidopsis thaliana ل SEC التحليلي. تم رسم حجم ذروة الشطف مقابل المنحنى القياسي لتحديد حالته قليلة القسيمة. كشفت نتائج SEC التحليلية أن المجال موجود كمحلول خماسي ، بكتلة جزيئية تقريبية تبلغ 58 كيلو دالتون (الشكل 1 أ ، ب

Discussion

يوضح هذا العمل ويتحقق من صحة مجموعة شاملة من البروتوكولات للتوصيف البيوكيميائي والبيوفيزيائي لمرافق هيستون المفترض. هنا ، تم استخدام بروتينات عائلة NAP المعبر عنها والمنقاة ، AtNRP1 و AtNRP2 ، ومجال بلازما النواة N-terminal ل AtFKBP53 لإظهار البروتوكولات. يمكن استخدام نفس المجموعة من التجارب لتحديد الس?...

Disclosures

ولم يعلن عن أي تضارب في المصالح.

Acknowledgements

المنح الخارجية لديليب فاسوديفان من مجلس أبحاث العلوم والهندسة ، حكومة الهند [CRG / 2018 / 000695 / PS] وإدارة التكنولوجيا الحيوية ، وزارة العلوم والتكنولوجيا ، حكومة الهند [BT / INF / 22 / SP33046 / 2019] ، بالإضافة إلى الدعم الداخلي من معهد علوم الحياة ، بوبانسوار معترف بها إلى حد كبير. نشكر السيدة سوديشنا سين والسيدة أنابورنا ساهو على مساعدتهما في إعداد الهيستون. كما نعرب عن تقديرنا للمناقشات مع زملائنا الدكتور تشينمايي موهاباترا والسيد ماناس كومار جاغديف والدكتور شيخ نوساد حسين.

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
Acetic acid (glacial)SigmaA6283
AcrylamideMP Biomedicals814326
AgaroseMP Biomedicals193983
AKTA Pure 25M FPLCCytiva29018226Instrument for protein purification
Ammonium persulfate (APS)SigmaA3678
An-60Ti rotorBeckman Coulter361964Rotor for analytical ultracentrifugation
Bovine serum albumin (BSA)SigmaA7030
ChloroformSigmaC2432
Coomassie brilliant blue R 250Sigma1.15444
Dialysis tubing (7 kDa cut-off)Thermo Fisher68700For dialysing protein samples
Dithiothreitol (DTT)MP Biomedicals100597
DNA Loading DyeNew England BiolabsB7025S
EDTA disodium saltMP Biomedicals194822
Electronic balanceShimadzuATX224R
EthanolSigmaE7023
Ethidium bromide (EtBr)SigmaE8751
Gel Doc SystemBio-Rad12009077For imaging gels after staining
Horizontal gel electrophoresis apparatusBio-Rad1704405Instrument for agarose gel electrophoresis
Hydrochloric acid (HCl)Sigma320331
ImidazoleMP Biomedicals102033
Magnesium chloride (MgCl2)SigmaM8266
MicropipettesEppendorfZ683779For pipetting of micro-volumes
Mini-PROTEAN electrophoresis systemBio-Rad1658000Instrument for SDS-PAGE
N,N-methylene-bis-acrylamideMP Biomedicals800172
Nano dropThermo FisherND-2000For measurement of protein and DNA concentrations
Ni-NTA agaroseInvitrogenR901-15Resin beads for pull-down assay
Optima AUC analytical ultracentrifugeBeckman CoulterB86437Instrument for analytical ultracentrifugation
pH MeterMettler ToledoMT30130863
PhenolSigmaP4557
Plasmid isolation kitQiagen27104
Proteinase KSigma-Aldrich1.07393
pUC19Thermo FisherSD0061Plasmid for supercoiling assay
Refrigerated high-speed centrifugeThermo Fisher75002402
SDS-PAGE protein markerBio-Rad1610317
SEDFITFree software program for analytical ultracentrifugation data analysis
SEDNTERPFree software program to estimate viscosity and density of buffer and partial specific volume of a protein
SigmaPrep Spin ColumnsSigmaSC1000For pull-down assay
Sodium acetateSigmaS2889
Sodium chloride (NaCl)MerckS9888
Sodium dodecyl sulfate (SDS)MP Biomedicals102918
Superdex 200 Increase 10/300 GLCytiva28990944Column for analytical size-exclusion chromatography
Superdex 75 Increase 10/300 GLCytiva29148721Column for analytical size-exclusion chromatography
TEMEDSigma1.10732
Topoisomerase IInspiralisWGT102Enzyme used in plasmid supercoiling assay
Tris baseMerckT1503
Tween-20SigmaP1379
UreaMP Biomedicals191450
Water bathNüveNB 5For heat treatment of protein samples
β-mercaptoethanol (β-ME)SigmaM6250

References

  1. Hübner, M. R., Eckersley-Maslin, M. A., Spector, D. L. Chromatin organization and transcriptional regulation. Current Opinion in Genetics and Development. 23 (2), 89-95 (2013).
  2. Lai, W. K. M., Pugh, B. F. Understanding nucleosome dynamics and their links to gene expression and DNA replication. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 18 (9), 548-562 (2017).
  3. Kim, U. J., Han, M., Kayne, P., Grunstein, M. Effects of histone H4 depletion on the cell cycle and transcription of Saccharomyces cerevisiae. EMBO Journal. 7 (7), 2211-2219 (1988).
  4. Prado, F., Aguilera, A. Partial depletion of histone H4 increases homologous recombination-mediated genetic instability. Molecular and Cellular Biology. 25 (4), 1526-1536 (2005).
  5. Meeks-Wagner, D., Hartwell, L. H. Normal stoichiometry of histone dimer sets is necessary for high fidelity of mitotic chromosome transmission. Cell. 44 (1), 43-52 (1986).
  6. Groth, A., et al. Human Asf1 regulates the flow of S phase histones during replicational stress. Molecular Cell. 17 (2), 301-311 (2005).
  7. Laskey, R. A., Honda, B. M., Mills, A. D., Finch, J. T. Nucleosomes are assembled by an acidic protein which binds histones and transfers them to DNA. Nature. 275 (5679), 416-420 (1978).
  8. Das, C., Tyler, J. K., Churchill, M. E. A. The histone shuffle: histone chaperones in an energetic dance. Trends in Biochemical Sciences. 35 (9), 476-489 (2010).
  9. Akey, C. W., Luger, K. Histone chaperones and nucleosome assembly. Current Opinion in Structural Biology. 13 (1), 6-14 (2003).
  10. De Koning, L., Corpet, A., Haber, J. E., Almouzni, G. Histone chaperones: An escort network regulating histone traffic. Nature Structural and Molecular Biology. 14 (11), 997-1007 (2007).
  11. Eitoku, M., Sato, L., Senda, T., Horikoshi, M. Histone chaperones: 30 years from isolation to elucidation of the mechanisms of nucleosome assembly and disassembly. Cellular and Molecular Life Sciences. 65 (3), 414-444 (2008).
  12. Quivy, J. P., Grandi, P., Almouzni, G. Dimerization of the largest subunit of chromatin assembly factor 1: importance in vitro and during Xenopus early development. EMBO Journal. 20 (8), 2015-2027 (2001).
  13. Ray-Gallet, D., et al. HIRA is critical for a nucleosome assembly pathway independent of DNA synthesis. Molecular Cell. 9 (5), 1091-1100 (2002).
  14. Frehlick, L. J., Eirín-López, J. M., Ausió, J. New insights into the nucleophosmin/nucleoplasmin family of nuclear chaperones. Bioessays. 29 (1), 49-59 (2007).
  15. Ito, T., Bulger, M., Kobayashi, R., Kadonaga, J. T. Drosophila NAP-1 is a core histone chaperone that functions in ATP-facilitated assembly of regularly spaced nucleosomal arrays. Molecular and Cellular Biology. 16 (6), 3112-3124 (1996).
  16. Elsässer, S. J., D'Arcy, S. Towards a mechanism for histone chaperones. Biochimica et Biophysica Acta. 1819 (3-4), 211-221 (2013).
  17. Rodríguez-Campos, A., Koop, R., Faraudo, S., Beato, M. Transcriptionally competent chromatin assembled with exogenous histones in a yeast whole cell extract. Nucleic Acids Research. 32 (13), 111 (2004).
  18. Levenstein, M. E., Kadonaga, J. T. Biochemical analysis of chromatin containing recombinant Drosophila core histones. Journal of Biological Chemistry. 277 (10), 8749-8754 (2002).
  19. Huang, S., et al. Rtt106p is a histone chaperone involved in heterochromatin-mediated silencing. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 102 (38), 13410-13415 (2005).
  20. Swaminathan, V., Kishore, A. H., Febitha, K. K., Kundu, T. K. Human histone chaperone nucleophosmin enhances acetylation-dependent chromatin transcription. Molecular and Cellular Biology. 25 (17), 7534-7545 (2005).
  21. Singh, A. K., Datta, A., Jobichen, C., Luan, S., Vasudevan, D. AtFKBP53: A chimeric histone chaperone with functional nucleoplasmin and PPIase domains. Nucleic Acids Research. 48 (3), 1531-1550 (2020).
  22. Scofield, B. T. K. H. . Protein Electrophoresis. , (2012).
  23. Andrew, S. M., Titus, J. A., Zumstein, L. Dialysis and concentration of protein solutions. Current Protocols in Toxicology, Appendix 3. , 1-5 (2002).
  24. Balbo, A., Zhao, H., Brown, P. H., Schuck, P. Assembly, loading, and alignment of an analytical ultracentrifuge sample cell. Journal of Visualized Experiments. (33), e1530 (2009).
  25. Padavannil, A., Brautigam, C. A., Chook, Y. M. Molecular size analysis of recombinant importin-histone complexes using analytical ultracentrifugation. Bio-protocol. 10 (10), 3625 (2019).
  26. Zhao, H., Brautigam, C. A., Ghirlando, R., Schuck, P. Overview of current methods in sedimentation velocity and sedimentation equilibrium analytical ultracentrifugation. Current Protocols in Protein Science. , (2013).
  27. Schuck, P. Size-distribution analysis of macromolecules by sedimentation velocity ultracentrifugation and Lamm equation modelling. Biophysical Journal. 78 (3), 1606-1619 (2000).
  28. Kumar, A., Kumar Singh, A., Chandrakant Bob de, R., Vasudevan, D. Structural characterization of Arabidopsis thaliana NAP1-related protein 2 (AtNRP2) and comparison with its homolog AtNRP1. Molecules. 24 (12), 2258 (2019).
  29. Liu, W. H., Roemer, S. C., Port, A. M., Churchill, M. E. A. CAF-1-induced oligomerization of histones H3/H4 and mutually exclusive interactions with Asf1 guide H3/H4 transitions among histone chaperones and DNA. Nucleic Acids Research. 45 (16), 9809 (2017).
  30. Bowman, A., et al. The histone chaperones Vps75 and Nap1 form ring-like, tetrameric structures in solution. Nucleic Acids Research. 42 (9), 6038-6051 (2014).
  31. Newman, E. R., et al. Large multimeric assemblies of nucleosome assembly protein and histones revealed by small-angle X-ray scattering and electron microscopy. Journal of Biological Chemistry. 287 (32), 26657-26665 (2012).
  32. Edlich-Muth, C., et al. The pentameric nucleoplasmin fold is present in Drosophila FKBP39 and a large number of chromatin-related proteins. Journal of Molecular Biology. 427 (10), 1949-1963 (2015).
  33. Franco, A., et al. Structural insights into the ability of nucleoplasmin to assemble and chaperone histone octamers for DNA deposition. Scientific Reports. 9 (1), 9487 (2019).
  34. Xiao, H., Jackson, V., Lei, M. The FK506-binding protein, Fpr4, is an acidic histone chaperone. FEBS Letters. 580 (18), 4357-4364 (2006).
  35. Graziano, G. Role of hydrophobic effect in the salt-induced dimerization of bovine beta-lactoglobulin at pH 3. Biopolymers. 91 (12), 1182-1188 (2009).
  36. Burgess, R. J., Zhang, Z. Histone chaperones in nucleosome assembly and human disease. Nature Structural and Molecular Biology. 20 (1), 14-22 (2013).
  37. Donham, D. C., Scorgie, J. K., Churchill, M. E. The activity of the histone chaperone yeast Asf1 in the assembly and disassembly of histone H3/H4-DNA complexes. Nucleic Acids Research. 39 (13), 5449-5458 (2011).
  38. Avvakumov, N., Nourani, A., Côté, J. Histone chaperones: Modulators of chromatin marks. Molecular Cell. 41 (5), 502-514 (2011).
  39. Ransom, M., Dennehey, B. K., Tyler, J. K. Chaperoning histones during DNA replication and repair. Cell. 140 (2), 183-195 (2010).
  40. Chu, X., et al. Importance of electrostatic interactions in the association of intrinsically disordered histone chaperone Chz1 and histone H2A.Z-H2B. PLoS Computational Biology. 8 (7), 1002608 (2012).
  41. Heidarsson, P. O., et al. Disordered proteins enable histone chaperoning on the nucleosome. bioRxiv. , (2020).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

178 NAP

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved