JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • תוצאות
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

פרוטוקול זה מתאר סוללה של שיטות הכוללות כרומטוגרפיה אנליטית של אי-הכללת גודל כדי לחקור אוליגומריזציה ויציבות של מלווה היסטון, בדיקת משיכה למטה כדי לפענח אינטראקציות של מלווה היסטון-היסטון, AUC כדי לנתח את הסטויכיומטריה של קומפלקסי החלבונים, ומבחן מלווה היסטון כדי לאפיין באופן פונקציונלי מלווה היסטון במבחנה.

Abstract

חלבוני היסטון נקשרים לדנ"א ויוצרים את הכרומטין האאוקריוטי. היחידה הבסיסית של הכרומטין היא נוקלאוזום, המורכב מאוקטמר היסטון המורכב משני עותקים של ליבת ההיסטונים H2A, H2B, H3 ו-H4, העטופים על ידי הדנ"א. האוקטמר מורכב משני עותקים של דימר H2A/H2B ועותק יחיד של טטרמר H3/H4. היסטונים הליבה הטעונים מאוד נוטים לאינטראקציות לא ספציפיות עם מספר חלבונים בציטופלסמה התאית ובגרעין. מלווים של היסטון יוצרים קבוצה מגוונת של חלבונים שמעבירים היסטונים מהציטופלסמה אל תוך הגרעין ומסייעים לתצהיר שלהם על הדנ"א, ובכך מסייעים לתהליך הרכבת הנוקלאוזום. חלק ממלווים היסטון הם ספציפיים עבור H2A / H2B או H3 / H4, וחלקם מתפקדים כמלווים עבור שניהם. פרוטוקול זה מתאר כיצד טכניקות מעבדה במבחנה כגון מבחני משיכה כלפי מטה, כרומטוגרפיה אנליטית של אי הכללת גודל, אולטרה-צנטריפוגה אנליטית ובדיקת מלווה היסטון יכולות לשמש במקביל כדי לאשר אם חלבון נתון מתפקד כמלווה היסטון.

Introduction

נוקלאוזומים המורכבים מחלבוני דנ"א והיסטון יוצרים את היחידה המבנית של הכרומטין ומווסתים מספר אירועים תאיים קריטיים. נוקלאוזומים ממוקמים מחדש באופן דינמי ומעוצבים מחדש כדי להנגיש את הדנ"א לתהליכים שונים כגון שכפול, שעתוק ותרגום 1,2. אבנים שהן בסיסיות מאוד נוטות לתקשר עם חלבונים חומציים בסביבה התאית או לעבור צבירה, ובכך מובילות לפגמים תאיים שונים 3,4,5. קבוצה של חלבונים ייעודיים הנקראים מלווים היסטון מסייעים בהעברת היסטונים מהציטופלסמה אל הגרעין ומונעיםאירועי צבירה של היסטון-DNA 6,7. ביסודו של דבר, רוב המלווים של היסטון מאחסנים ומעבירים היסטונים לדנ"א בעוצמה יונית פיזיולוגית, ובכך מסייעים להיווצרות נוקלאוזומים 8,9. לחלק מהמלווים של היסטון יש העדפה ברורה לאוליגומרים של היסטון H2A/H2B או H3/H410.

מלווים של היסטון מאופיינים על סמך יכולתם להרכיב נוקלאוזומים התלויים או בלתי תלויים בסינתזת DNA11. לדוגמה, גורם הרכבת הכרומטין-1 (CAF-1) תלוי בעוד מווסת היסטון A (HIRA) אינו תלוי בסינתזת DNA12,13. באופן דומה, משפחת הנוקלאופלסמין של מלווים היסטון מעורבת בפירוק כרומטין זרע ובהרכבת נוקלאוזום14. בני משפחת חלבון הרכבת הנוקלאוזומים (NAP) מאפשרים היווצרות מבנים דמויי נוקלאוזומים במבחנה ומעורבים בהסתרת היסטונים בין ציטופלסמה לגרעין15. נוקלאופלסמינים וחלבונים ממשפחת NAP הם שניהם מלווים פונקציונליים של היסטון, אך אינם חולקים תכונות מבניות כלשהן. למעשה, אין תכונה מבנית אחת המאפשרת סיווג של חלבון כמלווה היסטון16. השימוש במבחנים פונקציונליים וביופיזיים יחד עם מחקרים מבניים פועלים בצורה הטובה ביותר באפיון מלווים של היסטון.

עבודה זו מתארת שיטות ביוכימיות וביופיזיות לאפיון חלבון כמלווה היסטון המסייע להרכבת נוקלאוזומים. ראשית, כרומטוגרפיה אנליטית של אי הכללת גודל בוצעה כדי לנתח את המצב האוליגומרי והיציבות של מלווים היסטון. לאחר מכן, בוצעה בדיקה נשלפת כדי לקבוע את הכוחות המניעים ואת האופי התחרותי של אינטראקציות histone chaperone-histone. עם זאת, לא ניתן היה לחשב במדויק את הפרמטרים ההידרודינמיים של אינטראקציות אלה באמצעות כרומטוגרפיה אנליטית של אי הכללת גודל בגלל צורת החלבון והקומפלקסים שלו המשפיעים על נדידתם דרך העמודה. לכן, נעשה שימוש באולטרה-צנטריפוגציה אנליטית, המספקת תכונות מקרומולקולריות בתמיסה הכוללות משקל מולקולרי מדויק, סטויכיומטריה של אינטראקציה וצורת המולקולות הביולוגיות. מחקרים קודמים עשו שימוש נרחב במבחן מלווה היסטון במבחנה כדי לאפיין באופן פונקציונלי מלווים היסטון כגון yScS11617, DmACF 18, ScRTT106p19, HsNPM120. מבחן הליווי של היסטון שימש גם לאפיון פונקציונלי של החלבונים כמלווים היסטון.

Protocol

1. כרומטוגרפיה אנליטית של אי הכללת גודל כדי להבהיר את המצב האוליגומרי והיציבות של מלווים היסטון

  1. ניתוח הסטטוס האוליגומרי של מלווים היסטון
    1. שיווי משקל של כרומטוגרפיה של 24 מ"ל בגודל אנליטי (SEC) עם נפח עמודה של 1.2 טורים (CV), כלומר, 28.8 מ"ל של מאגר SEC נטול גזים [20 mM של Tris-HCl (pH 7.5), 300 mM NaCl, ו-1 mM של β-מרקפטואתנול (β-ME)] ב-4 °C (ראה טבלת חומרים).
      הערה: ניתן לבחור את סוג העמודה, הרכב המאגר ורמת החומציות של המאגר בהתבסס על החלבון המעניין. נפח ההזרקה לדוגמה לא יעלה על 500 μL עבור עמודה של 24 מ"ל. כמו כן, לחץ העמודה צריך להישמר מתחת ל -5 MPa.
    2. מתמיסת מלאי חלבונים בריכוז גבוה יותר, הכינו דגימת חלבון של 500 μL של 0.5 מ"ג/מ"ל במאגר SEC נטול גזים והזריקו אותה לעמודה שלפני שיווי המשקל באמצעות לולאת הזרקה של 500 μL. אפשר לריצת הכרומטוגרפיה להתקדם בקצב זרימה איזוקרטי של 0.2-0.3 מ"ל/דקה עם מאגר SEC ב-4 מעלות צלזיוס.
    3. עקוב אחר פרופיל האלוציה של החלבון על ידי מדידת ספיגה באורך גל של 280 ננומטר. כאשר מתמודדים עם חלבונים חסרי שאריות ארומטיות, יש למדוד את הספיגה ב-214 ננומטר.
    4. השתמש בנפח ה-elution של החלבון כדי לחשב את המשקל המולקולרי המשוער שלו ב-kDa באמצעות עקומת הכיול הסטנדרטית21.
      הערה: עקומת הכיול נערכת על ידי התוויית נפח השימור של חלבוני משקל מולקולרי ידועים כנגד יומן המשקלים המולקולריים שלהם (log Mr), המותאמים באמצעות אותה עמודה.
  2. ניתוח היציבות התרמית של מלווים היסטון
    1. קח 500 μL של 0.5 מ"ג / מ"ל של דגימת החלבון שהוכנה במאגר SEC degassed (זהה לזה המשמש 1.1.1) בצינורות microcentrifuge בודדים וחמם כל צינור לטמפרטורה מסוימת הנעה בין 20 °C ל 90 °C (20 °C, 40 °C, 60 °C, ו 90 °C) במשך 10 דקות באמבט מים.
    2. לאחר מכן, צנטריפוגה של דגימות שטופלו בחום ב 16,200 x גרם במשך 10 דקות ב 4 מעלות צלזיוס, לאסוף את supernatant עם micropipette, ולהזריק כל דגימה בנפרד באמצעות לולאת הזרקה 500 μL לתוך העמודה האנליטית, שיווי משקל מראש עם חיץ SEC ב 4 °C (6 °F).
    3. אפשר לריצת הכרומטוגרפיה להתקדם בקצב זרימה איזוקרטי של 0.2-0.3 מ"ל/דקה עם מאגר SEC ב-4 מעלות צלזיוס.
    4. שימו לב למיקום ולגובה של פסגות האלוציות וחפשו את המראה של פסגות נוספות לדגימות השונות.
  3. ניתוח היציבות הכימית של מלווים היסטון
    1. כדי לבחון את יציבות המלח של מלווים בהיסטון, יש לדגום 500 μL של דגימת חלבון של 0.5 מ"ג/מ"ל שהוכנה במאגר Tris [20 mM של Tris-HCl (pH 7.5), ו-1 mM של β-ME] בתוספת ריכוזים הולכים וגדלים של NaCl (300 mM, 600 mM, 1 M, 1.5 M ו-2 M) בצינורות מיקרוצנטריפוגה נפרדים למשך 30 דקות ב-4 °C (4 °F). צנטריפוגה של הדגימות ב 16,200 x גרם במשך 10 דקות ב 4 מעלות צלזיוס ולשמור על supernatant.
    2. לאחר מכן, טען את דגימות החלבון בריכוזי NaCl שונים בנפרד, באמצעות לולאת הזרקה של 500 μL לתוך העמודה האנליטית שלפני שיווי משקל עם 1.2 CV (28.8 מ"ל) של המאגר המתאים המכיל ריכוזי NaCl הולכים וגדלים ב-4 מעלות צלזיוס.
    3. אפשר להכרומטוגרפיה להתקדם בקצב זרימה איזוקרטי של 0.2-0.3 מ"ל/דקה עם 1 CV (24 מ"ל) של המאגר המתאים ב-4 מעלות צלזיוס.
    4. שימו לב למיקום ולגובה של פסגות אלוטיון וחפשו את המראה של פסגות נוספות עבור הדגימות השונות.
    5. באופן דומה, לצורך ניתוח יציבות אוריאה, יש לדגום 500 μL של דגימת חלבון של 0.5 מ"ג/מ"ל שהוכנה במאגר Tris [20 mM של Tris-HCl (pH 7.5), ו-1 mM של β-ME] בתוספת ריכוזי אוריאה הולכים וגדלים (1 M, 2 M, 3 M, 4 M ו-5 M) בצינורות מיקרוצנטריפוגה נפרדים למשך 16 שעות בטמפרטורת החדר. צנטריפוגה של הדגימות ב 16,200 x גרם במשך 10 דקות בטמפרטורת החדר ולשמור על supernatant.
    6. לאחר מכן, טען את דגימות החלבון שטופלו באוריאה בנפרד באמצעות לולאת הזרקה של 500 μL לתוך העמודה האנליטית שלפני שיווי משקל עם 1.2 CV (28.8 מ"ל) של החיץ המתאים המכיל ריכוזי אוריאה שונים בטמפרטורת החדר.
    7. אפשר להכרומטוגרפיה להתקדם בקצב זרימה איזוקרטי של 0.2-0.3 מ"ל/דקה עם 1 CV (24 מ"ל) של המאגר המתאים בטמפרטורת החדר.
      אזהרה: אין לבצע את הניסויים עם חיץ המכיל אוריאה בטמפרטורה נמוכה יותר מכיוון שאוריאה נוטה להתגבש ולפגוע בעמודה.
    8. שימו לב למיקום ולגובה של פסגות האלוציות וחפשו את המראה של פסגות נוספות לדגימות השונות.

2. מבחני משיכה מבוססי שיפוע מלח כדי להבין את סוג האינטראקציות התורמות להיווצרות המורכבת בין אוליגומרים של היסטון לבין מלווה היסטון

  1. עבור כל תגובה של בדיקה נשלפת, פיפטה 40 μL של שרף Ni-NTA לתוך עמוד ספין ולשטוף עם מים סטריליים מזוקקים כפול. לאחר מכן, יש לאזן את השרף עם 100 CV (4 מ"ל) של מאגר שיווי משקל [20 mM של Tris-HCl (pH 7.5), 300 mM של NaCl, 10 mM של אימידזול, 10 מיקרוגרם/מ"ל של BSA ו-1 mM של β-ME] (ראו טבלת חומרים).
    הערה: ניתן לבצע משיכה כלפי מטה גם בצינור מיקרוצנטריפוגה של 1.5 מ"ל.
  2. הכן את הדגימה על-ידי ערבוב של 5 μM של מלווה היסטון המתויג שלו עם 20 μM של דימר H2A/H2B של היסטון או טטרמר H3/H4 במאגר שיווי המשקל. דגירה של הדגימה על הקרח למשך שעה אחת.
    הערה: דימר H2A/H2B וטטרמר H3/H4 מוכנים מהיסטונים אנושיים רקומביננטיים21, ותקינות האוליגומרים מאושרת על סמך המסות המולקולריות המשוערות על ידי אולטרה-צנטריפוגציה אנליטית (AUC). אותם אוליגומרים של היסטון שימשו לכל הניסויים המוזכרים להלן.
  3. טען את הדגימות לעמודות ספין נפרדות מראש עם שרף Ni-NTA משלב 2.1, שכל אחת מהן מסומנת לריכוז מלח מסוים, ושמור את העמודות למשך 30 דקות בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס. צנטריפוגה את העמודים ב 1000 x גרם במשך 1 דקה.
  4. לאחר מכן, יש לשטוף את העמודות עם 100 CV (4 מ"ל) של מאגר כביסה [20 mM של Tris-HCl (pH 7.5), 50 mM של imidazole, 0.2% של Tween-20, ו 1 mM של β-ME] המכיל ריכוזי מלח שונים (כלומר, 300 mM, 500 mM, 600 mM, 700 mM, 800 mM, 900 mM ו 1 M NaCl). לשטוף כל עמודה עם חיץ בעל ריכוז מלח מסוים.
  5. לאחר שלב שטיפת המלח, יש לחמוק מהחלבון מהעמודות השונות באמצעות 100 מיקרון ליטר של חיץ אלוציות [20 מ"מ של Tris-HCl (pH 7.5), 300 mM של NaCl, 300 mM של אימידזול ו-1 mM של β-ME].
  6. לאחר מכן, העבירו את הדגימות המלוטשות ל-18% SDS-PAGE22 ודמיינו את הג'ל לאחר צביעה עם Coomassie Brilliant Blue R250 (ראו טבלת חומרים). לחלופין, ניתן לטעון את השרף ישירות על ג'ל SDS-PAGE במקום לשאוב את החלבון הקשור משרף Ni-NTA.
    הערה: הרכבי חיץ שיווי משקל, שטיפה ו-elution עשויים להשתנות בהתאם לחלבון המעניין.

3. בדיקת משיכה תחרותית לזיהוי ההעדפה של מלווה היסטון עבור H2A / H2B או H3 / H4

  1. הכנת עמודת סיבוב כמתואר בשלב 2.1
  2. דגירה של 5 μM של מלווה היסטון עם 20 μM של דימר H2A/H2B ב-300 μL של חיץ שיווי משקל (מוכן בשלב 2.1) למשך 30 דקות על קרח.
    הערה: ניתן לבחור את היחס בין אוליגומר היסטון למלווה היסטון בתגובה על סמך נתוני סטויכיומטריה מחייבים ידועים; השתמש בעודף היסטון פי חמישה אם אין מידע זמין.
  3. צנטריפוגה של קומפלקס המלווה היסטון-H2A/H2B ב-16,200 x גרם למשך 5 דקות ב-4 מעלות צלזיוס כדי להסיר כל משקע. לאחר מכן, טען את הדגימה על עמודת הספין שלפני שיווי משקל עם מאגר שיווי משקל (מוכן בשלב 2.1) ודגרה במשך 30 דקות ב -4 מעלות צלזיוס.
  4. שטפו את העמודה עם 100 CV (4 מ"ל) של מאגר כביסה [20 mM של Tris-HCl (pH 7.5), 300 mM של NaCl, 50 mM של אימידזול, 0.2% של Tween-20, ו-1 mM של β-ME] כדי להסיר דימר H2A/H2B עודף. לאחר מכן, יש לערבב את קומפלקס ה-H2A/H2B של היסטון עם 20-60 מיקרומטר של טטרמר H3/H4 ולדגור במשך 30 דקות על קרח.
  5. שטפו מחדש את העמודה עם 100 CV (4 מ"ל) של מאגר כביסה (מוכן בשלב 3.4) כדי להסיר כל טטרמר H3/H4 לא מאוגד ולחמק את הדגימה באמצעות מאגר אלוציה (שהוכן בשלב 2.5). הכפיפו את הדוגמאות המותאמות ל-18% SDS-PAGE ודמיינו לאחר צביעה עם Coomassie Brilliant Blue R250.
    הערה: ניתן להפוך את הבדיקה כאשר, ראשית, ניתן לערבב טטרמר H3/H4 עם המלווה, את הקומפלקס מותר להיקשר לחרוזי Ni-NTA, ולאחר מכן את הקומפלקס להיות דגירה עם ריכוזים משתנים של דימר H2A / H2B.

4. ניסויים באולטרה-צנטריפוגציה אנליטית - מהירות שקיעה (AUC-SV) לניתוח הסטויכיומטריה המחייבת בין מלווים היסטון להיסטונים להיסטונים

  1. הכנה לדוגמה ל- AUC
    1. יש לבצע דיאליזה של הדימר H2A/H2B המחודש, טטרמר H3/H4, ואת מלווה היסטון בנפרד באמצעות צינור דיאליזה חתך של 7 kDa 23, כנגד חיץ דיאליזה [20 mM של Tris (pH 7.5), 300 mM של NaCl ו-1 mM של β-ME] (ראו טבלת חומרים). כדי למזער את שגיאת הרקע עקב אי התאמה של המאגר, בצע דיאליזה באופן נרחב כנגד מאגר הדיאליזה, רצוי שלוש פעמים במשך תקופה של 24 שעות.
      הערה: OD 280 הראשוני של דגימות החלבון צריך להיות בעל ערך גבוה פי שניים עד שלושה כדי להשיג OD280 סופי של 0.3-0.5. זה נעשה למעשה כדי לבטל את ההשפעות של דילול.
    2. טהרו את דימר H2A/H2B, טטרמר H3/H4, ואת מלווה היסטון בנפרד באמצעות חיץ הדיאליזה, באמצעות כרומטוגרפיה אנליטית של אי-הכללת גודל (כפי שצוין בשלב 1). שמור את המאגר מהריצה כדי להכין דילולים נוספים בהמשך ולהשתמש בו כהפניה בתא AUC.
  2. טעינה לדוגמה עבור AUC
    1. ערבבו את החלבונים המטוהרים בנפח סופי של 450 μL באמצעות מאגר דיאליזה משלב 4.1.1 כדי להגיע ל-OD280 של 0.3-0.6. ערבבו את מלווה היסטון עם דימר H2A/H2B או טטרמר H3/H4 להיווצרות מורכבת בצינורות תגובה נפרדים. דגרו על תערובות החלבון במשך 2-3 שעות.
      הערה: לחלופין, ניתן להשיג נתוני שקיעה באמצעות מערכת סריקה אופטית של הפרעות באולטרה-צנטריפוגה האנליטית. בנפרד, לערבוב חלבונים מטוהרים, לתקן את ריכוז מלווה היסטון לדגור אותו עם ריכוזים הולכים וגדלים של אוליגומרים היסטון כדי לקבל את הסטויכיומטריה המדויקת.
    2. הרכיבו את התא עם מרכז סקטור כפול וחלונות קוורץ לניסוי AUC-SV באמצעות גלאי ספיגה של האולטרה-צנטריפוגה האנליטית כפי שתואר קודם לכן בפירוט24.
    3. מלא 400 μL מתמיסת הדגימה ו- 420 μL של מאגר דיאליזה לשני המגזרים (מגזרי דגימה וייחוס, בהתאמה) של התא.
      הערה: נפח גדול יותר של חיץ משמש במגזר הייחוס כדי לשמור על מניסקוס הייחוס מעל המניסקוס של הדגימה. עם זאת, בעת שימוש במערכת הפרעות אופטיות, מלא את שני המגזרים בנפח שווה.
    4. שקלו ואיזנו במדויק את התאים וטענו אותם לרוטור טיטניום בעל ארבעה מקומות (ראו טבלת חומרים). יישר את התאים באמצעות הסימנים המופיעים בתחתית התאים והרוטור. טען את הרוטור בצנטריפוגה, סגור את המכסה ואפשר לפתח ואקום עד שהלחץ יורד לפחות מ -15 מיקרון של כספית וטמפרטורת הרוטור מתייצבת ל -20 מעלות צלזיוס (בדרך כלל לוקח 2-2.5 שעות).
      הערה: פרמטרי ההפעלה של AUC כוללים את טמפרטורת הניסוי, מהירות הרוטור, המרווח בין הסריקות ומספר הסריקות שיש לאסוף. במקרה של ניסויי SV, מרווח הסריקה ניתן בהתאם למסה המולקולרית של החלבון; חלבונים קטנים יותר דורשים מרווחי זמן גדולים יותר בין הסריקות. מהירות הרוטור נקבעת גם על פי המסה המולקולרית הצפויה של החלבון, והניסוי נערך בטמפרטורה של 20 מעלות צלזיוס. נתוני הספיגה מנוטרים ב-280 ננומטר.
    5. כדי להשיג את הסטויכיומטריה המדויקת, יש לשמור על ריכוז מלווה היסטון קבוע ולדגור עם ריכוזים הולכים וגדלים של אוליגומרים של היסטון כדי להגיע לרוויה.
  3. ניתוח נתוני AUC
    1. בצע את ניתוח הנתונים כפי שתואר קודםלכן 25. בקצרה, חשב את הצפיפות והצמיגות של רכיבי המאגר באמצעות התוכנית SEDNTERP26 (ראה טבלת חומרים). באופן דומה, חשב את הנפח הספציפי החלקי של החלבון בהתבסס על הרכב חומצות האמינו שלו, גם באמצעות SEDNTERP.
    2. טען את הנתונים ממכונת AUC לתוכנית SEDFIT27 והגדר את המניסקוס (קו אדום), תחתית התא (קו כחול) וגבולות ניתוח הנתונים (קווים ירוקים). בחר התפלגות C(s) רציפה כמודל.
    3. לאחר מכן, הגדר רזולוציה מקסימלית עד 100; מקדם שקיעה מוגדר (S), S מינימום: 0 ו- S מקסימום: 10-15; להגדיר יחס חיכוך ל 1.2 בתחילה ולבחור לצוף כדי לגזור את היחס מן הנתונים; לקבוע רמת ביטחון (יחס F; הקובע את גודל הרגולריזציה) ל-0.68 עבור רגולריזציה של סיגמא אחת; הגדר ערכי נפח ספציפיים, צפיפות מאגר וצמיגות מאגר כפי שהתקבלו מ- SEDNTERP.
    4. הקש RUN כדי לאפשר לתוכנה לפתור את משוואת לם27. התאם את הפרמטרים אם יש אי התאמה משמעותית של נתונים. לאחר התאמת הפרמטרים, הקש FIT כדי למקד את כל הפרמטרים. הערך את איכות ההתאמה בהתבסס על ערך הסטייה הממוצעת של השורש (RMSD), שאמור להיות קטן מ- 0.01 יחידות אות.
    5. הערך את המסות המולקולריות של הפסגות על ידי בחירה באפשרות: הצג שיא "Mw in c(s)" בפונקציית התצוגה של סרגל הכלים הראשי, אשר יספק מידע על 's' של המולקולה / קומפלקס.

5. בדיקת פלסמיד כדי לאשר את פונקציית הליווי של היסטון

  1. תגובת הרכבה של נוקלאוזומים
    1. יש לערבב 2 μM של טטרמר H3/H4 ו-4 μM של דימר H2A/H2B עם ריכוזים הולכים וגדלים של מלווה היסטון (1-6 μM) במאגר הרכבה [20 mM של Tris HCl (pH 7.5), 1 mM של DTT, 1 mM של MgCl2, 0.1 mg/mL של BSA ו-100 mM של NaCl] לנפח סופי של 50 μL. דגירה של התערובת ב-4 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות.
    2. בו-זמנית, בתגובה נפרדת, יש לטפל ב-500 ננוגרם של פלסמיד pUC19 בעל תקרה שלילית עם 1 מיקרוגרם של אנזים טופואיזומראז I (ראו טבלת חומרים) במאגר ההרכבה בנפח סופי של 50 μL ולדגור בטמפרטורה של 30 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות.
      הערה: Topoisomerase I מרגיע את הדנ"א הפלסמיד הדו-גדילי על-ידי יצירת ניק חד-גדילי. ניתן להשתמש באנזים טופואיזומרז I ממוצא אאוקריוטי, כגון נבט החיטה טופואיזומראז I הזמין באופן מסחרי או Drosophila melanogaster topoisomerase I המבוטא באופן רקומביננטי.
    3. לאחר מכן, שלבו את הטטרמר H3/H4, דימר H2A/H2B, תערובת מלווה היסטון (משלב 5.1.1), תערובת תגובת הדנ"א הפלסמיד הנינוחה (משלב 5.1.2), ודגרו הלאה בטמפרטורה של 30 מעלות צלזיוס למשך 90 דקות.
      הערה: הגדר שתי תגובות בקרה עבור הבדיקה; לאחד יש את מלווה היסטון ואת הדנ"א הפלסמיד הרגוע (אך לא את ההיסטונים) והשני שיש את אוליגומרים היסטון ואת הדנ"א הפלסמיד הרגוע (אך לא את מלווה היסטון).
    4. עצור את תגובת ההרכבה על ידי הוספת 100 μL של מאגר עצירה 2x (40 mM של EDTA, 2% של SDS, ו 0.4 מ"ג/מ"ל של פרוטאינאז K) ודגירה ב 37 °C במשך 30 דקות.
      הערה: הפסק את ה-buffer מבצע דה-פרוטאינפורמציה של הדנ"א הפלסמיד על-ידי דנטורציה ופרוטאוליזה של היסטונים מאוגדים.
  2. מיצוי פנול-כלורופורם ומשקעי אתנול
    1. הוסיפו נפח שווה של פנול רווי טריס בצינור המכיל את תערובת התגובה משלב 5.1.4 וערבבו היטב, ולאחר מכן צנטריפוגה ב-16,200 x גרם למשך 10 דקות בטמפרטורת החדר.
    2. אוספים בעדינות את השלב המיימי העליון בעל הדנ"א הפלסמיד עם מיקרופיפט ומערבבים עם נפח שווה של כלורופורם. מערבבים את התערובת והצנטריפוגה ב-16,200 x גרם למשך 10 דקות בטמפרטורת החדר.
      הערה: אלכוהול איזואמיל יכול להיכלל בשלב זה כדי למנוע ממשק מטושטש בין השלבים המימיים והאורגניים.
    3. לאחר מכן, אספו את השלב המיימי העליון, הוסיפו נפח 1/10 של 3 M נתרן אצטט (pH 5.5) ו-2.5 כרכים של אתנול קר כקרח (ראו טבלת חומרים). מערבבים היטב את התמיסה על ידי היפוך הצינור 3-4 פעמים ושומרים את התערובת במקפיא של -20 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות למשקעים מלאים של ה- DNA הפלסמיד.
    4. צנטריפוגה את הדגימה משלב 5.2.3 ב 16200 x גרם במשך 10 דקות ולהשליך בעדינות את supernatant. השאירו את הצינורות פתוחים בטמפרטורת החדר עד שאפילו כמויות זעירות של אתנול יתאדו, וישאירו את הדנ"א הפלסמיד המשופע בצינור.
  3. בצע את אלקטרופורזה ג'ל agarose כדי לבחון את אפקט supercoiling פלסמיד.
    1. ממיסים את הדנ"א הפלסמיד המואץ משלב 5.2.4 במים סטריליים מזוקקים כפול.
    2. פתור את הדגימות על ג'ל אגרוז של 1% בחיץ אחד של Tris-acetate-EDTA (TAE) (40 mM של Tris, 20 mM של חומצה אצטית ו-1 mM של EDTA) (ראה טבלת חומרים).
    3. הכתימו את הג'ל בריכוז של 0.2-0.5 מיקרוגרם/מ"ל של אתידיום ברומיד וצפו מתחת ל-UV כדי לדמיין את רצועות הדנ"א שעל הג'ל.

תוצאות

תחום הנוקלאופלסמין הרקומביננטי N-terminal של החלבון FKBP53 מאראבידופסיס תליאנה היה נתון ל- SEC אנליטי. נפח השיא של האלוציה הותווה כנגד העקומה הסטנדרטית כדי לזהות את מצבה האוליגומרי. תוצאות ה-SEC האנליטיות גילו שהתחום קיים כפנטמר בתמיסה, עם מסה מולקולרית משוערת של 58 kDa (איור 1A,B

Discussion

עבודה זו מדגימה ומאמתת מערך מקיף של פרוטוקולים לאפיון ביוכימי וביופיזי של מלווה היסטון פוטטיבי. כאן, חלבוני משפחת NAP המבוטאים באופן רקומביננטי ומטוהרים, AtNRP1 ו- AtNRP2, ותחום הנוקלאופלסמין N-terminal של AtFKBP53 שימשו להדגמת הפרוטוקולים. אותה קבוצה של ניסויים יכולה בהחלט לשמש כדי להגדיר את התכונות הפו...

Disclosures

לא הוכרז ניגוד עניינים.

Acknowledgements

המענקים החוץ-אקדמיים לדיליפ וסודוואן ממועצת המחקר למדע והנדסה, ממשלת הודו [CRG/2018/000695/PS] והמחלקה לביוטכנולוגיה, משרד המדע והטכנולוגיה, ממשלת הודו [BT/INF/22/SP33046/2019], כמו גם התמיכה התוך-מורלית מהמכון למדעי החיים, בובנשוואר מוכרים מאוד. אנו מודים לגב' סודשנה סן וגב' אנאפורנה סאהו על עזרתן בהכנת היסטון. גם הדיונים עם עמיתינו ד"ר צ'ינמאיי מוהפטרה, מר מנאס קומאר ג'אגדב וד"ר שייח' נוסאד חוסיין זוכים להכרה.

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
Acetic acid (glacial)SigmaA6283
AcrylamideMP Biomedicals814326
AgaroseMP Biomedicals193983
AKTA Pure 25M FPLCCytiva29018226Instrument for protein purification
Ammonium persulfate (APS)SigmaA3678
An-60Ti rotorBeckman Coulter361964Rotor for analytical ultracentrifugation
Bovine serum albumin (BSA)SigmaA7030
ChloroformSigmaC2432
Coomassie brilliant blue R 250Sigma1.15444
Dialysis tubing (7 kDa cut-off)Thermo Fisher68700For dialysing protein samples
Dithiothreitol (DTT)MP Biomedicals100597
DNA Loading DyeNew England BiolabsB7025S
EDTA disodium saltMP Biomedicals194822
Electronic balanceShimadzuATX224R
EthanolSigmaE7023
Ethidium bromide (EtBr)SigmaE8751
Gel Doc SystemBio-Rad12009077For imaging gels after staining
Horizontal gel electrophoresis apparatusBio-Rad1704405Instrument for agarose gel electrophoresis
Hydrochloric acid (HCl)Sigma320331
ImidazoleMP Biomedicals102033
Magnesium chloride (MgCl2)SigmaM8266
MicropipettesEppendorfZ683779For pipetting of micro-volumes
Mini-PROTEAN electrophoresis systemBio-Rad1658000Instrument for SDS-PAGE
N,N-methylene-bis-acrylamideMP Biomedicals800172
Nano dropThermo FisherND-2000For measurement of protein and DNA concentrations
Ni-NTA agaroseInvitrogenR901-15Resin beads for pull-down assay
Optima AUC analytical ultracentrifugeBeckman CoulterB86437Instrument for analytical ultracentrifugation
pH MeterMettler ToledoMT30130863
PhenolSigmaP4557
Plasmid isolation kitQiagen27104
Proteinase KSigma-Aldrich1.07393
pUC19Thermo FisherSD0061Plasmid for supercoiling assay
Refrigerated high-speed centrifugeThermo Fisher75002402
SDS-PAGE protein markerBio-Rad1610317
SEDFITFree software program for analytical ultracentrifugation data analysis
SEDNTERPFree software program to estimate viscosity and density of buffer and partial specific volume of a protein
SigmaPrep Spin ColumnsSigmaSC1000For pull-down assay
Sodium acetateSigmaS2889
Sodium chloride (NaCl)MerckS9888
Sodium dodecyl sulfate (SDS)MP Biomedicals102918
Superdex 200 Increase 10/300 GLCytiva28990944Column for analytical size-exclusion chromatography
Superdex 75 Increase 10/300 GLCytiva29148721Column for analytical size-exclusion chromatography
TEMEDSigma1.10732
Topoisomerase IInspiralisWGT102Enzyme used in plasmid supercoiling assay
Tris baseMerckT1503
Tween-20SigmaP1379
UreaMP Biomedicals191450
Water bathNüveNB 5For heat treatment of protein samples
β-mercaptoethanol (β-ME)SigmaM6250

References

  1. Hübner, M. R., Eckersley-Maslin, M. A., Spector, D. L. Chromatin organization and transcriptional regulation. Current Opinion in Genetics and Development. 23 (2), 89-95 (2013).
  2. Lai, W. K. M., Pugh, B. F. Understanding nucleosome dynamics and their links to gene expression and DNA replication. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 18 (9), 548-562 (2017).
  3. Kim, U. J., Han, M., Kayne, P., Grunstein, M. Effects of histone H4 depletion on the cell cycle and transcription of Saccharomyces cerevisiae. EMBO Journal. 7 (7), 2211-2219 (1988).
  4. Prado, F., Aguilera, A. Partial depletion of histone H4 increases homologous recombination-mediated genetic instability. Molecular and Cellular Biology. 25 (4), 1526-1536 (2005).
  5. Meeks-Wagner, D., Hartwell, L. H. Normal stoichiometry of histone dimer sets is necessary for high fidelity of mitotic chromosome transmission. Cell. 44 (1), 43-52 (1986).
  6. Groth, A., et al. Human Asf1 regulates the flow of S phase histones during replicational stress. Molecular Cell. 17 (2), 301-311 (2005).
  7. Laskey, R. A., Honda, B. M., Mills, A. D., Finch, J. T. Nucleosomes are assembled by an acidic protein which binds histones and transfers them to DNA. Nature. 275 (5679), 416-420 (1978).
  8. Das, C., Tyler, J. K., Churchill, M. E. A. The histone shuffle: histone chaperones in an energetic dance. Trends in Biochemical Sciences. 35 (9), 476-489 (2010).
  9. Akey, C. W., Luger, K. Histone chaperones and nucleosome assembly. Current Opinion in Structural Biology. 13 (1), 6-14 (2003).
  10. De Koning, L., Corpet, A., Haber, J. E., Almouzni, G. Histone chaperones: An escort network regulating histone traffic. Nature Structural and Molecular Biology. 14 (11), 997-1007 (2007).
  11. Eitoku, M., Sato, L., Senda, T., Horikoshi, M. Histone chaperones: 30 years from isolation to elucidation of the mechanisms of nucleosome assembly and disassembly. Cellular and Molecular Life Sciences. 65 (3), 414-444 (2008).
  12. Quivy, J. P., Grandi, P., Almouzni, G. Dimerization of the largest subunit of chromatin assembly factor 1: importance in vitro and during Xenopus early development. EMBO Journal. 20 (8), 2015-2027 (2001).
  13. Ray-Gallet, D., et al. HIRA is critical for a nucleosome assembly pathway independent of DNA synthesis. Molecular Cell. 9 (5), 1091-1100 (2002).
  14. Frehlick, L. J., Eirín-López, J. M., Ausió, J. New insights into the nucleophosmin/nucleoplasmin family of nuclear chaperones. Bioessays. 29 (1), 49-59 (2007).
  15. Ito, T., Bulger, M., Kobayashi, R., Kadonaga, J. T. Drosophila NAP-1 is a core histone chaperone that functions in ATP-facilitated assembly of regularly spaced nucleosomal arrays. Molecular and Cellular Biology. 16 (6), 3112-3124 (1996).
  16. Elsässer, S. J., D'Arcy, S. Towards a mechanism for histone chaperones. Biochimica et Biophysica Acta. 1819 (3-4), 211-221 (2013).
  17. Rodríguez-Campos, A., Koop, R., Faraudo, S., Beato, M. Transcriptionally competent chromatin assembled with exogenous histones in a yeast whole cell extract. Nucleic Acids Research. 32 (13), 111 (2004).
  18. Levenstein, M. E., Kadonaga, J. T. Biochemical analysis of chromatin containing recombinant Drosophila core histones. Journal of Biological Chemistry. 277 (10), 8749-8754 (2002).
  19. Huang, S., et al. Rtt106p is a histone chaperone involved in heterochromatin-mediated silencing. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 102 (38), 13410-13415 (2005).
  20. Swaminathan, V., Kishore, A. H., Febitha, K. K., Kundu, T. K. Human histone chaperone nucleophosmin enhances acetylation-dependent chromatin transcription. Molecular and Cellular Biology. 25 (17), 7534-7545 (2005).
  21. Singh, A. K., Datta, A., Jobichen, C., Luan, S., Vasudevan, D. AtFKBP53: A chimeric histone chaperone with functional nucleoplasmin and PPIase domains. Nucleic Acids Research. 48 (3), 1531-1550 (2020).
  22. Scofield, B. T. K. H. . Protein Electrophoresis. , (2012).
  23. Andrew, S. M., Titus, J. A., Zumstein, L. Dialysis and concentration of protein solutions. Current Protocols in Toxicology, Appendix 3. , 1-5 (2002).
  24. Balbo, A., Zhao, H., Brown, P. H., Schuck, P. Assembly, loading, and alignment of an analytical ultracentrifuge sample cell. Journal of Visualized Experiments. (33), e1530 (2009).
  25. Padavannil, A., Brautigam, C. A., Chook, Y. M. Molecular size analysis of recombinant importin-histone complexes using analytical ultracentrifugation. Bio-protocol. 10 (10), 3625 (2019).
  26. Zhao, H., Brautigam, C. A., Ghirlando, R., Schuck, P. Overview of current methods in sedimentation velocity and sedimentation equilibrium analytical ultracentrifugation. Current Protocols in Protein Science. , (2013).
  27. Schuck, P. Size-distribution analysis of macromolecules by sedimentation velocity ultracentrifugation and Lamm equation modelling. Biophysical Journal. 78 (3), 1606-1619 (2000).
  28. Kumar, A., Kumar Singh, A., Chandrakant Bob de, R., Vasudevan, D. Structural characterization of Arabidopsis thaliana NAP1-related protein 2 (AtNRP2) and comparison with its homolog AtNRP1. Molecules. 24 (12), 2258 (2019).
  29. Liu, W. H., Roemer, S. C., Port, A. M., Churchill, M. E. A. CAF-1-induced oligomerization of histones H3/H4 and mutually exclusive interactions with Asf1 guide H3/H4 transitions among histone chaperones and DNA. Nucleic Acids Research. 45 (16), 9809 (2017).
  30. Bowman, A., et al. The histone chaperones Vps75 and Nap1 form ring-like, tetrameric structures in solution. Nucleic Acids Research. 42 (9), 6038-6051 (2014).
  31. Newman, E. R., et al. Large multimeric assemblies of nucleosome assembly protein and histones revealed by small-angle X-ray scattering and electron microscopy. Journal of Biological Chemistry. 287 (32), 26657-26665 (2012).
  32. Edlich-Muth, C., et al. The pentameric nucleoplasmin fold is present in Drosophila FKBP39 and a large number of chromatin-related proteins. Journal of Molecular Biology. 427 (10), 1949-1963 (2015).
  33. Franco, A., et al. Structural insights into the ability of nucleoplasmin to assemble and chaperone histone octamers for DNA deposition. Scientific Reports. 9 (1), 9487 (2019).
  34. Xiao, H., Jackson, V., Lei, M. The FK506-binding protein, Fpr4, is an acidic histone chaperone. FEBS Letters. 580 (18), 4357-4364 (2006).
  35. Graziano, G. Role of hydrophobic effect in the salt-induced dimerization of bovine beta-lactoglobulin at pH 3. Biopolymers. 91 (12), 1182-1188 (2009).
  36. Burgess, R. J., Zhang, Z. Histone chaperones in nucleosome assembly and human disease. Nature Structural and Molecular Biology. 20 (1), 14-22 (2013).
  37. Donham, D. C., Scorgie, J. K., Churchill, M. E. The activity of the histone chaperone yeast Asf1 in the assembly and disassembly of histone H3/H4-DNA complexes. Nucleic Acids Research. 39 (13), 5449-5458 (2011).
  38. Avvakumov, N., Nourani, A., Côté, J. Histone chaperones: Modulators of chromatin marks. Molecular Cell. 41 (5), 502-514 (2011).
  39. Ransom, M., Dennehey, B. K., Tyler, J. K. Chaperoning histones during DNA replication and repair. Cell. 140 (2), 183-195 (2010).
  40. Chu, X., et al. Importance of electrostatic interactions in the association of intrinsically disordered histone chaperone Chz1 and histone H2A.Z-H2B. PLoS Computational Biology. 8 (7), 1002608 (2012).
  41. Heidarsson, P. O., et al. Disordered proteins enable histone chaperoning on the nucleosome. bioRxiv. , (2020).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

178NAP

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved