التسليم داخل القنوات وتصوير الأشعة السينية للحل الاستئصالي القائم على الإيثانول للوقاية والعلاج المحلي لسرطان الثدي في نماذج الفئران

Summary

يتم وصف طريقة الحقن داخل القنوات للكواشف لمحلول استئصالي قائم على الإيثانول لشجرة القنوات الثديية للفأر للتصوير في الجسم الحي والوقاية من سرطان الثدي. يسمح الحقن مباشرة في فتحة الحلمة باستهداف الخلايا الظهارية الثديية مع الحد الأدنى من تلف الأنسجة الجانبية.

Abstract

سرطان الثدي هو السرطان الأكثر انتشارا والسبب الرئيسي الثاني للوفاة المرتبطة بالسرطان للنساء في الولايات المتحدة الأمريكية. وبالنسبة للنساء المعرضات لمخاطر عالية، فإن استئصال الثدي الوقائي هو استراتيجية الوقاية الأولية الأكثر فعالية. استئصال الثدي الوقائي هو إجراء جراحي عدواني يزيل تماما الخلايا الظهارية الثديية التي ينشأ منها سرطان الثدي مع الأنسجة المحيطة. نحن نسعى إلى تطوير إجراء داخل القنوات بأقل قدر من التدخل الجراحي كبديل لاستئصال الثدي الوقائي لاستئصال الخلايا الظهارية الثديية محليا قبل أن تصبح خبيثة. لقد طورنا نحن وآخرون إجراء الولادة داخل القنوات للوصول إلى هذه الخلايا الظهارية وعلاجها في نماذج القوارض من سرطان الثدي. في حين أن الغدة الثديية للفأر ذات الفتحة القنوية غير المفاغرة عند الحلمة لها بنية أقل تعقيدا وملتوية بكثير من الثدي البشري ، فإن نماذج الفئران المستحثة كيميائيا والمهندسة وراثيا لسرطان الثدي ذات قيمة لإنتاج دراسات إثبات المفهوم لاستراتيجيات وقائية جديدة. هنا ، نصف إجراء للتوصيل داخل القنوات لمحلول استئصالي قائم على الإيثانول يحتوي على عامل تباين قائم على التنتالوم بالأشعة المقطعية الدقيقة / الأشعة السينية داخل شجرة القنوات الثديية للفأر لغرض علاجي للوقاية الأولية من سرطان الثدي. تم وصف التوصيل داخل القنوات للكواشف المائية (على سبيل المثال ، المركبات السامة للخلايا ، siRNAs ، AdCre) سابقا في نماذج الفئران. وبالتالي ، فإننا نركز وصف بروتوكولنا على التعديلات المنهجية والاعتبارات التجريبية الفريدة لتحسين توصيل الإيثانول ، ولتقليل الآثار الجانبية المحلية والنظامية لإدارة الإيثانول ، وللتصور في الجسم الحي لملء شجرة القنوات عن طريق التصوير المقطعي المحوسب / الفلوري. يسمح تصور شجرة الأقنية مباشرة بعد حقن محلول يحتوي على التباين بتأكيد الملء الكامل أو النتائج غير الناجحة مثل الملء الناقص أو الملء الزائد. يمكن تطبيق هذا الإجراء لتسليم وتصوير المركبات الاستئصالية الأخرى التي تهدف إما إلى منع تكوين الورم أو علاج الأورام في المراحل المبكرة محليا والتي يمكن الوصول إليها عبر شجرة الأقنية.

Introduction

سرطان الثدي مرض شائع وربما قاتل مع خيارات قليلة متاحة ^{للوقاية1}. التدخل الأكثر فعالية هو استئصال الثدي الوقائي. ومع ذلك ، يختار الأفراد المعرضون لخطر كبير فقط الخضوع لهذا الإجراء لأنه عملية جراحية ذات عواقب وخيمة تغير ^{الحياة2}. يزيل الإجراء تماما الخلايا الظهارية الثديية التي ينشأ منها سرطان الثدي مع الأنسجة المحيطة. هذا يمكن أن يؤدي إلى الإجهاد البدني والنفسي والاجتماعي للفرد ، وغالبا ما يثني الأفراد عن المضي قدما في هذا الإجراء الجراحي كخط أول للتدخل الأساسي.

لقد أثبتنا أن توصيل محلول استئصالي يحتوي على 70٪ من الإيثانول (EtOH) مباشرة إلى شجرة القنوات فعال في قتل الخلايا الظهارية الثديية مع تلف محدود للأنسجة الجانبية وفي منع أورام الثدي في نماذج الفئران ³. منذ فترة طويلة يستخدم EtOH سريريا كعامل استئصالي أو مصلب للعلاج المحلي. يستخدم حقن EtOH عن طريق الجلد كعامل استئصالي لأورام الكبد غير القابلة للاستئصال ، وأورام الكلى والغدة الكظرية ، وأورام البنكرياس الكيسية ^4,5,6 ؛ للتحلل العصبي الضفيرة الاضطرابات الهضمية للحد من ^الألم7; ولعلاج تمدد الأوعية الدموية الكاذب ^للثدي8. يستخدم حقن EtOH داخل الأوعية الدموية كعامل مصلب للقضاء على التورم والتشوه من التشوهات الشريانية الوريدية (AVM) ، وللعلاج التجميلي للأوردة العنكبوتية والدوالي9،¹⁰،^11،12،13. مثل استئصال الثدي الوقائي ، يعتمد نجاح الوقاية من خلال التسليم المحلي لمحلول استئصالي على القدرة على إزالة جميع الخلايا الظهارية الثديية التي يمكن أن ينشأ منها السرطان تماما. وهذا يتطلب تأكيدا على أن المادة الاستئصالية قد ملأت شجرة الأقنية بنجاح ، وبالتالي الاتصال بجميع الخلايا الظهارية الثديية مباشرة. الوسائل السريرية لحقن المواد داخل الغدد الثديية وتصورها عن طريق التنظير الفلوري الموجه بالصور أو التصوير اللاصق متاحة ^{بسهولة14,15}; لذلك ، سيكون من الممكن تقديم وتأكيد التسليم الناجح عندما يستدعي هذا الإجراء التقييم في التجارب السريرية.

إن إثبات جدوى هذا النهج الموجه بالصور في المختبر هو خطوة رئيسية في تحديد فعالية وجدوى الاستئصال داخل القنوات (ID) كإجراء وقائي لسرطان الثدي. في مختبرنا ، طورنا طريقة لحقن جميع الغدد الثديية بنجاح في الفئران بمحلول استئصالي يحتوي على عامل تباين على مدار الحقن الأسبوعية لضمان عدم استسلام الحيوان لجرعة زائدة من EtOH (الشكل 1 ، الشكل 2 ، المرجع رقم ^{3 ، 16}). يضع هذا الإجراء إبرة 34 جم داخل فتحة الحلمة لفأر مخدر متساوي الفلوران لحقن محلول الاختبار. وتشمل بعض التحسينات الرئيسية لهذا الإجراء استخدام المحاقن المانعة للغازات للسوائل والغازات، وحقن كميات أكبر لكل شجرة ^قنوية17، والعلاج المضاد للالتهابات الموسع. العلاج قبل السريري من 5 ملغ / كغ من كاربروفين ، وهو NSAID ، من 2 د قبل إلى 7 د بعد إجراء الهوية يتماشى مع العلاج بالتصلب السريري للتشوه الشرياني الوريدي. عادة ، بعد التخدير الجهازي ، يتلقى المرضى أدوية مضادة للالتهابات ، مثل مضادات الالتهاب غير الستيروئيدية ، لمدة يومين بعد الإجراء يمكن تمديدها للتخفيف من أي التهاب أو ألم موضعي ¹². يتم تخفيف تسمم الكحول بشكل كبير عن طريق الحقن داخل الصفاق لمحلول السكروز بنسبة 5٪ في الفئران. مع إعطاء محلول السكروز هذا ، يمكن حقن الفئران بأمان بما يصل إلى 160 ميكرولتر من 70٪ EtOH (ما يصل إلى أربع أشجار قنوية ؛ حوالي 0.4 جم / ديسيلتر من محتوى EtOH في الدم) ؛ الحيوانات تعافى تماما في غضون 4 ساعات بعد حقن الهوية. لحقن أكثر من أربع غدد في الفئران و / أو تركيزات EtOH أعلى ، نقوم بإجراء جلسات متسلسلة للسماح بوقت كاف للتعافي. التسمم بالكحول لدى النساء سيكون مصدر قلق أقل بسبب انخفاض نسبة كمية الكحول إلى وزن الجسم. بالنظر إلى عدد الأشجار القنية في صدر الإنسان14,15 ، حوالي 16 ، والحجم المقدر لملء كل قناة ^{شجرة18,19} ، سيتم إعطاء ما يصل إلى 32 مل من 70٪ EtOH. ستكون هذه الكمية أقل بكثير من 50 مل من 95٪ EtOH تدار في الإجراءات السريرية ^{الأخرى4,9}. يمكن استخدام الإعطاء الوريدي للثيامين ومحلول الجلوكوز لزيادة تقليل آثار تسمم EtOH ، خاصة في الحالات التي قد يلزم فيها حقن حجم إجمالي أكبر من EtOH و / أو للنساء اللواتي لديهن تحمل أقل لاستهلاك الكحول (على سبيل المثال ، المتغيرات الأليلية في الكحول أو نازعة هيدروجيناز الألدهيد).

يسمح لنا التصوير عن طريق التصوير المقطعي المحوسب / الفلوري بتأكيد الملء القنوي الناجح لكل غدة (الشكل 1 ، الشكل 2 ، الشكل 3). يمكن تسجيل ذلك للتحليل المستقبلي ، أو تقييمه في الوقت الحالي عن طريق التصوير بالفلور في الوقت الفعلي ، كما هو الحال في التطبيق السريري ، للحد من العبء الإشعاعي الإجمالي المفروض على الحيوان. لزيادة تحسين الميزات المحددة لهذا الحل الاستئصالي للتسليم الموجه بالصور في الوقت الفعلي في الجسم الحي ، قمنا سابقا بمقارنة التباين المحتوي على اليود المعتمد من إدارة الأغذية والعقاقير مع جسيمات نانوية تحتوي على أكسيد التنتالوم (TaOx) تم تصنيعها بواسطة مختبر Shapiro ^3,16. أظهر _TaOx أداء متفوقا كعامل تباين micro-CT لتصور الملء الأولي للشجرة القنية (الشكل 2 ، الشكل 3). يمكن استخدام TaOx كتباين مرجعي لإجراء تقييم أكثر منهجية وطولي لعوامل تباين تجمع الدم الأخرى القائمة على الجسيمات النانوية (على سبيل المثال ، اليود أو البزموت أو المحتوي على الذهب) وتوافق _TaOx مع تركيزات مختلفة من سليلوز الإيثيل كعامل تبلور ^20,21.

Protocol

أجريت جميع التجارب الموصوفة هنا بموجب بروتوكولات وافقت عليها لجنة رعاية واستخدام الحيوانات المؤسسية في جامعة ولاية ميشيغان.

1. العلاج الممتد المضاد للالتهابات

1. تأكد من أن الفئران التي تتلقى محاليل الحقن التي تحتوي على EtOH أو غيرها من المهيجات المحتملة يتم تزويدها بالعلاج المضاد للالتهابات من 2 أيام قبل الحقن إلى 7 أيام بعد الحقن. الطريقة المفضلة للجرعات هي التسليم عن طريق الفم من خلال كوب هلام السكرالوز الذي يحتوي على كاربروفين بتركيز مناسب.
2. تحضير كاربروفين مع التركيز المطلوب. بالنسبة لهذه التجربة ، تم تحضير محلول عملي من 2 ملغ / مل (محلول المخزون هو 50 ملغ / مل) عن طريق التخفيف في PBS المعقمة لحقن 0.5 مل لتحقيق جرعة نهائية من 1 ملغ لكل كوب. أضف 1٪ v / v صبغة طعام زرقاء معقمة (BFD) بدلا من جزء صغير من PBS من الحجم الإجمالي اللازم للتخفيف لتصور أفضل للخلط الكامل للدواء في هلام السكرالوز.
3. قم بإعداد كوب لإضافة كاربروفين وفقا لتوصية الشركة المصنعة. ما لم ينصح بخلاف ذلك ، ضع الكوب في حمام مائي 60 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة. قم بإزالة الأكواب وتجفيفها لتقليل احتمال التلوث.
   1. استخدم 70٪ EtOH أو منديل EtOH لتنظيف سطح غطاء الكوب واتركه حتى يجف. استخدم حقنة لحقن الكمية اللازمة من محلول كاربروفين من خلال الغطاء. لهذه التجربة ، يتم حقن 500 ميكرولتر. غطي موقع الحقن بملصق ورجيه بقوة لمدة 15 ثانية.
   2. دوامة الكوب لمدة 15 ثانية ، ثم تخزينها لاستخدامها في وقت لاحق بعد التحقق بصريا من الخلط الكامل. تحقق من الأكواب بحثا عن خلط متجانس من خلال البحث عن كتل زرقاء داكنة. اسمح للأكواب بالوصول إلى درجة حرارة الغرفة قبل الانتقال إلى الثلاجة للتخزين لمدة تصل إلى شهر واحد.
      ملاحظة: يمكن أيضا تخزين هذه الأكواب في درجة حرارة الغرفة بمجرد تناولها ، إذا لزم الأمر ، ولكن احرص على الانتباه إلى إرشادات فعالية الدواء من الشركة المصنعة. يساعد تأريخ الملصق في تتبع تاريخ الحقن دون المخاطرة بقلم أو علامة حادة تثقب الغطاء.
4. عندما تكون جاهزة للاستخدام ، امسح الجزء الخارجي من الكوب بنسبة 70٪ EtOH. قشر الغطاء ووضع الكوب في القفص مع الفئران. استبدل الأكواب كل يومين أو عندما تكون فارغة. يجب أن يكون كوب واحد كافيا لما يصل إلى خمسة فئران لمدة 1-2 أيام.

2. التحضير قبل الجراحة

ملاحظة: ستحدث هذه الخطوة قبل 2-3 أيام من الحقن.

1. تخدير الماوس باستخدام مبخر الايزوفلوران (2٪ -3٪ isoflurane ، 1.5 لتر / دقيقة من الأكسجين) وتطبيق مواد تشحيم العين. الحفاظ على التخدير بنسبة 1٪ -3٪ أيسوفلوران حسب الحاجة طوال العملية مع مخروط الأنف مع مراقبة معدل التنفس للحيوان بعناية.
2. ضع مادة تشحيم العين على عيون الماوس أثناء وجودك في مخروط الأنف ، ثم ضع الماوس على ظهره. استخدمي قضيب قطني مائل لتطبيق كريم مزيل الشعر بدون وصفة طبية على منطقة الحلمة (منطقة الغدة الثديية التي سيتم حقنها). افركي الكريم في المنطقة لمدة 10-30 ثانية باستخدام قضيب للمساعدة في تخفيف الفراء بسرعة.
   ملاحظة: لا تترك الكريم على الحيوان لفترة أطول من اللازم وقم بإزالته تماما لتجنب حرق الجلد.
3. بعد 10-30 ثانية من التطبيق ، استخدم الماء الدافئ على الشاش لإزالة الكريم تماما وتخفيف الفراء من الحيوان. قم بإجراء شطفين إلى أربعة على الأقل من المنطقة بشاش طازج لإزالة الكريم قبل التجفيف بشاش جاف نظيف بعد الشطف النهائي. تحقق من منطقة إزالة الفراء للتأكد من الرؤية الجيدة والوصول إلى الحلمات. كرر ذلك مع تطبيق كريم مزيل الشعر إذا لزم الأمر.
4. ضع الماوس في قفص استرداد نظيف وجاف منفصل على وسادة تدفئة للتعافي من التخدير. راقب الفأر حتى يتعافى تماما من التخدير وأعده إلى القفص المنزلي.
5. تزويد الفئران بكوب واحد من محلول هلام السكرالوز الذي يحتوي على كاربروفين (1 ملغ / كوب) للجرعات المسبقة من العامل المضاد للالتهابات بعد الشفاء. كوب واحد يمكن أن توفر ما يصل إلى خمسة فئران مع كاربروفين لمدة تصل إلى 2 أيام. تحقق من الكوب يوميا واستبدله حسب الحاجة ، أو كل يومين إذا لم يتم استهلاكه بالكامل.

3. الحقن داخل القنوات

ملاحظة: ستحدث هذه الخطوة بعد 2-3 أيام من التحضير قبل الجراحة.

1. قم بتحضير محلول مخزون أكسيد التنتالوم (_TaOx) سعة 333.3 مللي متر من تركيبة المسحوق المشتراة كما هو موضح في ¹⁶ باستخدام محلول ملحي مخزن بالفوسفات (PBS). استخدم دفئا لطيفا إذا لم يذوب المسحوق بالكامل في المحلول.
2. قم بعمل حل تصوير استئصالي عن طريق خلط ثلاثة أجزاء من مخزون TaOx مع سبعة أجزاء 100٪ EtOH للحصول على حل EtOH 100mM _TaOx النهائي بنسبة 70٪. أضف صبغة طعام زرقاء v/v بنسبة 1٪ إلى الحل النهائي للتصور بمساعدة أثناء الحقن. قم بإعداد مجلد بناء على الحاجة إلى التجربة.
   ملاحظة: يمكن لأزواج الغدد 1 و 5 استيعاب ما يصل إلى 30 ميكرولتر من المحلول بينما يمكن حقن جميع الأزواج الأخرى بما يصل إلى 50 ميكرولتر في عمر 9 أسابيع أو فئران FVB الأكبر سنا.
3. تخدير الفأر مع الايزوفلوران كما هو الحال في التحضير قبل الجراحة ونقل الماوس إلى مخروط الأنف مرة واحدة تخدير كامل. ضع مواد تشحيم العين قبل وضع الحيوان على ظهره للحقن. قم بتثبيت الماوس أسفل المجسم باستخدام الشريط، إذا لزم الأمر.
4. تحضير حقنة مع الحجم المطلوب من محلول الحقن. قم بتحميل 21-51 ميكرولتر من محلول الحقن في حقنة 50 ميكرولتر مع إبرة 34 جم مرفقة. قم بتحميل 1 ميكرولتر إضافي من المحلول لحساب التسرب المحتمل لهذا الحجم بعد إزالة الإبرة من الحلمة.
   ملاحظة: المجلدات أعلاه مخصصة للإجراءات النموذجية المعروضة هنا. يمكن للمرء حقن أي حجم مرغوب فيه مع فهم أن معظم الغدد سوف تكون ممتلئة بشكل زائد إذا تجاوزت 30 ميكرولتر أو 50 ميكرولتر في أزواج الغدد 1 و 5 ، أو 2-4 ، على التوالي. من المفيد ملء الإبرة بحجم إضافي من محلول الحقن لاختبار التدفق الحر للمحلول قبل الحقن مباشرة. في حالة حقن أكثر من غدة ثديية واحدة، املأ محاقن متعددة مسبقا لتوفير الوقت. ومع ذلك ، لا تترك الحل في المحقنة لفترة طويلة.
5. تحضير الحلمات للحقن عن طريق إزالة أي جلد ميت يغطي فتحة الحلمة بملقط مدبب ناعم.
6. امسك الحلمة بلطف باستخدام ملاقط. مع ظهور شطبة الإبرة ، أدخل الإبرة في فتحة الحلمة حتى يتم تغطية الشطبة بالكامل بمساعدة التوجيه من ملقط الرؤوس الدقيقة. قد يكون من الضروري سحب الحلمة إلى الإبرة بدلا من دفع الإبرة إلى الحلمة (الجدول 1).
7. بمجرد أن تكون مشطوفة الإبرة محاطة بالكامل بالحلمة وتكون في القناة الرئيسية ، ابدأ في حقن المحلول بمعدل ثابت يبلغ حوالي 40 ميكرولتر / دقيقة. تجنب الحقن بسرعة كبيرة لضمان عدم تلف شجرة الأقنية. احتفظ بالإبرة في الحلمة لمدة 30 ثانية بعد حقن الحجم بالكامل قبل إزالة الإبرة بمساعدة الملقط. يتم ذلك لتجنب تسرب المحلول من الحلمة (الشكل 2).
   1. تقييم المنطقة بحثا عن أي علامات على الحقن غير الناجح. قد يشير المظهر المقبب إلى حقن وسادة الدهون أو صدمة في المنطقة.
   2. المضي قدما في حقن الغدد الثديية المتبقية.
8. بينما لا يزال الحيوان مخدرا ، قم بحقن 200-250 ميكرولتر من محلول السكروز 5٪ (حتى 10 مل / كجم) داخل الصفاق لتقليل الآثار المحتملة للتسمم الكحولي.

4. التصوير المقطعي المحوسب الدقيق

1. بعد حقن جميع الغدد المطلوبة ، حرك الحيوان بسرعة إلى نظام التصوير المقطعي المحوسب الدقيق واستمر في الحفاظ على التخدير باستخدام مبخر الأيزوفلوران المدمج. قد يتم تسجيل الحيوان لتوحيد موضع التصوير. على سبيل المثال ، يساعد تسجيل كل ساق خلفية في وضع ممتد على إبقاء عظام ساق الحيوان بعيدا عن الغدد السفلية ذات الأهمية في الصورة الناتجة.
   ملاحظة: يمكن تصوير الحيوانات باستخدام معلمات مسح مختلفة لتصور شجرة الأقنية إذا تم الحرص على تحديد جرعة مناسبة مقبولة مدى الحياة من الإشعاع للحيوان ولا تتجاوز الجرعات التراكمية هذا المستوى. يمكن إنشاء صور ثابتة ومقاطع فيديو للتنظير الفلوري دون إجراء عمليات مسح لتقليل التعرض للإشعاع بشكل أكبر (الشكل 2).
2. ضع الماوس في مجال الرؤية المناسب باستخدام وظيفة معاينة التنظير الفلوري.
3. قم بإجراء تصوير _TaOx لشجرة قنوات الماوس بدقة جيدة وفرصة لفحوصات الاستحواذ القياسية المتكررة (2 دقيقة). استخدم معلمات الفحص التالية: 90 kVp/88 μA; مجال الرؤية (FOV) ، 36 مم ؛ عدد الشرائح ، 512 ؛ سمك الشريحة ، 72 ميكرومتر ؛ دقة فوكسل ، 72 ميكرومتر ³.
   1. احصل على عمليات مسح ضوئي أطول (4 أو 14 دقيقة) عالية الدقة للحصول على دقة أفضل في الحيوانات. هذه مقبولة كإجراءات نهائية قبل القتل الرحيم. ومع ذلك ، فإن هذه ليست مقبولة للحيوانات التي يتم مسحها ضوئيا طوليا باستخدام نفس المعلمات لأنها ستسبب مرض الإشعاع.
4. بعد الانتهاء من بروتوكول التصوير ، قم بإزالة الحيوان من التخدير ونقله إلى قفص استرداد نظيف وجاف منفصل على وسادة تدفئة. راقب الحيوان حتى يتعافى تماما ، ثم أعده إلى قفص المنزل. حافظ على حقن الحيوانات بمحلول استئصالي على كاربروفين حتى 7 أيام بعد الحقن.
5. قم بإجراء عمليات تسليم سريعة لأي صور ممسوحة ضوئيا داخل برنامج التصوير المقطعي المحوسب الصغير (النظام المدمج) لتقدير أي تسرب تباين أو نقص في الملء بشكل أفضل (الشكل 2) دون تحليل رسمي.
6. إجراء مزيد من التحليل الرسمي للصور للنشر أو التحليل التفصيلي للمسح الضوئي الذي يسمح بتجزئة منطقة الاهتمام إذا رغبت في ذلك (الشكل 3).
   ملاحظة: سيكون الفرق الأساسي بين هذه الطرق هو القدرة على الحد الأدنى فقط من شجرة القنوات (التسليم الرسمي) مقابل الحاجة إلى عتبة الصورة بأكملها (التسليم السريع). يمكن إنشاء قياسات وصور أخرى باستخدام حزم البرامج لإثبات نجاح ملء شجرة القنوات على أفضل وجه.

5. تحليل الصور

1. قم بإجراء عرض لشجرة القنوات المحقونة باستخدام حزمة برامج متخصصة. للقيام بذلك ، قم بتقسيم لوحة الدهون الثديية مع مزيد من معالجة الصور.
   1. لتقسيم وسادة الدهون (حجرة أغمق مقارنة بالتجويف البريتوني وعضلات الفخذ والجلد) التي تحتوي فيها شجرة الأقنية ذات الأهمية ، حدد خيار تتبع Spline من القائمة اليدوية. تتبع مخطط لوحة الدهون في كل شريحة بيانات ثالثة.
   2. انقر فوق خيار نشر الكائنات من القائمة شبه التلقائية لتوصيل جميع الشرائح التي تم تتبعها وغير المتعقبة في كائن واحد.
2. حدد خيار حجم العتبة من القائمة شبه التلقائية لإدخال نطاق HU المطلوب (300-3000 HU هي نقطة انطلاق جيدة) ، ثم انقر فوق الزر Threshold Rendition لإنشاء تسليم يعرض فقط التباين (TaOx) داخل شجرة القنوات ويزيل الأنسجة الرخوة.
3. قم بتبديل الزر " عرض " إلى "التسليم" كأساسي لعرض النسخة 3D فقط دون الهياكل المحيطة.
   ملاحظة: تسمح ميزات البرامج الإضافية بإجراء قياسات للتسليم 3D (أي الطول والحجم وما إلى ذلك).

النتائج

لدى إناث الفئران خمسة أزواج من الغدد الثديية مع شجرة قنوية واحدة تفتح عند فتحة ^{الحلمة22}. على أطراف شجرة القنوات النامية توجد براعم النهاية الطرفية (TEBs) ، وهي هياكل تكاثرية توجه النمو والتفرع. بعد البلوغ عند اكتمال مرحلة الاستطالة ، تتراجع TEBs وتصبح غير قابلة للتمييز وظيفيا وتشريحيا عن القنوات الطرفية أو البراعم السنخية ²³. تخدم الوحدات الفصيصية القنية الطرفية وظيفة مماثلة في البشر كما تفعل TEBs في الفئران وهي المواقع التي ينشأ منها سرطان الثدي في الغالب ^24,25. يمكننا حقن ما يصل إلى 50 ميكرولتر من محلول EtOH بنسبة 70٪ لملء الشجرة القنية بأكملها من الغدد الثديية الصدرية والبطنية من FVB / N ، NSG ، وسلالات الفئران الأخرى البالغة من العمر 9 أسابيع (الشكل 1 ، الشكل 2 ، الشكل 3 ، انظر ^{المراجع3,16}). في تجربة نموذجية ، يمكننا حقن ما يصل إلى ثماني غدد ثديية بمحلول استئصالي بنسبة 70٪ EtOH و 100 mM _TaOx في إجراءين متتاليين للهوية يفصل بينهما 7 أيام للسماح باستعادة الحيوانات (الشكل 2). يتم تصوير الحيوانات بواسطة التصوير المقطعي المحوسب الدقيق مباشرة بعد حقن المعرف الأخير لتقييم التسليم الناجح للمحلول إلى شجرة الأقنية بأكملها (الشكل 2). في تجربتنا ، حلمات الغدد الإربية مناسبة للحقن في حوالي 60 ٪ من الحيوانات ، وحلمات الغدد العنقية في حوالي 40 ٪. عندما يكون ذلك مناسبا ، يمكننا حقن ما يصل إلى 30 ميكرولتر من محلول EtOH بنسبة 70٪ لملء شجرة الأقنية بأكملها من الغدد الثديية العنقية والإربية (الشكل 2). تقدم سلالات FVB و NSG عموما حلمات أكثر ملاءمة للحقن من C57BL/6J أو سلالات الخلفية الجينية المختلطة. يعد بروتوكول التلطيخ المزدوج الكامل أو المجهر البؤري ثلاثي الأبعاد طرقا متعامدة جيدة لتأكيد مدى ملء شجرة الأقنية (الشكل 3). تتوافق هذه التحليلات المرتبطة بالأنسجة مع التصوير في الجسم الحي ويمكن إجراؤها بعد ذلك. القيد الواضح لهذه الطرق المتعامدة هو أنها تتطلب إنهاء الحيوانات لجمع الأنسجة وتحليلها. ومع ذلك ، في مرحلة التحسين لصياغة استئصالية جديدة ، فإنها توفر التحقق من صحة مستقلة.

الشكل 1: سير العمل في الإجراء داخل القنوات وتحليل الصور. يتم تمييز الخطوات الرئيسية لإجراء الهوية. يرجى مشاهدة الفيديو لمزيد من التفاصيل. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل 2: نجاح القنية وتسليم المحلول الاستئصالي للغدد الثديية المتعددة. (أ) تلون الحلمة التمثيلي في سلالات الماوس FVB و NSG. الحلمات الطويلة أسهل في التعليب من الحلمات القصيرة ، في حين لا يمكن تعليب الحلمات القصيرة جدا أو الأثرية. بمجرد تعبئتها ، لا يؤثر حجم الحلمة على الولادة الناجحة داخل القناة. (ب) يوفر التحليل التشريحي الإجمالي للصبغة الزرقاء في محلول استئصالي دليلا حيا على ملء شجرة الأقنية ونجاح التسليم. (ج، د) يوفر التنظير الفلوري في الوقت الفعلي وما بعد الحصول على الصورة 3D micro-CT التسليم في الجسم الحي دليلا على نجاح التسليم. (د) الحقن الناجح لكل من الغدد البطنية والأربية ، وثلاثة من أصل أربع غدد صدرية (حقن وسادة الدهون في الغدة رقم 2). تتوافق أشرطة المقياس مع 1 مم في الصور عند تكبير مختلف. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل 3: في الجسم الحي وخارج الجسم الحي مظاهرة لملء شجرة الأقنية. تم حقن 70٪ EtOH/100 mM _TaOx nanoparticles/Evans Blue بمحلول داخل القناة في الغدة الثديية البطنية للفأر وتم تصويره على الفور بواسطة التصوير المقطعي المحوسب الدقيق ومعالجته لتلطيخ التركيب الكامل المزدوج. أعيد بناء شجرة القنوات باستخدام حزمة برامج تحليل الصور. يملأ المحلول بالكامل شجرة الأقنية الملطخة بالشبة القرمزية. تم تلطيخ غدة منفصلة مناعيا ل E-Cadherin (Cdh1) ، وتم تطهيرها باستخدام كحول البنزيل: Benzyl Benzoate وتم تصويرها بواسطة الفحص المجهري البؤري كما هو ^موضح26. أعيد بناء شجرة القنوات باستخدام برنامج تحليل الصور. تم الحصول على عرض التلوين الزائف للصورة متحدة البؤرة (أي خلفية سوداء إلى بيضاء ، إشارة علامة خضراء إلى أرجواني) باستخدام وظيفة عكس الصورة لبرنامج تحرير الصور. تتوافق أشرطة المقياس مع 1 مم في الصور عند تكبير مختلف. وقد عدل هذا الرقم من المرجع رقم ³. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

أصدر	مظهر		حل
حلمة قصيرة (الشكل 2)	الحلمة لديها صورة منخفضة - يصعب الإمساك بها		في بعض الأحيان يكون من الأسهل حمل الجلد بالقرب من الحلمة واستهداف مركز الحلمة بالإبرة. من المرجح أن تغوص الإبرة تحت الجلد. قد يكشف السحب لأعلى ببطء أن الحلمة تكون فوق طرف الإبرة قليلا وتعطي مجالا للاستيلاء عليها وسحبها بقية الطريق إلى الإبرة. كن حذرا جدا عند الغوص تحت الجلد حول زاوية الإبرة. من السهل الحصول عن غير قصد على حقن وسادة الدهون عن طريق الطعن في الزاوية الخاطئة.
الحلمة الدهنية	أكبر بكثير من الحلمات الأخرى مع القليل من الجلد الميت القابل للتقشير - يمكن رؤيته بسهولة بدون نطاق		من السهل جدا الحصول على حقن وسادة الدهون على هذه الحلمات. كن حذرا جدا بشأن زاوية الإبرة عند إدخالها في الحلمة.
حقن وسادة الدهون (الشكل 2)	تورم حول الحلمة وربما في الحلمة نفسها - أسهل لمعرفة ما إذا كان يتم إضافة اللون إلى محلول الحقن		إذا كانت الحلمة منتفخة مع حقن أول عدد قليل من ul ، فقم بإزالة الإبرة ، وحاول إدخالها مرة أخرى مع توخي المزيد من العناية بالزاوية. ابدأ الحقن مرة أخرى وراقب المزيد من التورم. إذا استمر التورم ، فتخلى عن المحاولة. من النادر جدا حقن الحلمة بنجاح والتي بدأت كحقن وسادة الدهون.
الجروح / الجرب	فتح الجرح أو الجرب بالقرب من موقع حقن محلول EtOH		ضع مرهم مضاد حيوي ثلاثي على الجروح المفتوحة ولكن اترك الجروح المصابة بالجرب وحدها. تطبيق مرهم على الجلبة يمكن أن يزيد من احتمال الحيوان سوف يزعج الجرب وإزالته. تحقق كل 1-2 أيام حتى تلتئم اعتمادا على شدة الجرح. يجب إعطاء كاربروفين حتى يلتئم حتى لو كان خارج النافذة العادية.

الجدول 1: استكشاف الأخطاء وإصلاحها ونصائح مفيدة.

Discussion

استئصال الثدي الوقائي هو حاليا التدخل الأكثر فعالية لسرطان الثدي ، ولكن له بعض الآثار السلبية الخطيرة. يعد الاستئصال الموضعي للخلايا الظهارية الثديية باستخدام محلول قائم على EtOH علاجا بديلا واعدا كما أظهرنا في دراسة إثبات المفهوم حول نموذج الفأر FVB-Tg-C3(1)-TAg العدواني لسرطان الثدي ³. يسمح حقن الهوية لهذا الحل الاستئصالي باستهداف الخلايا الظهارية الثديية التي ينشأ منها سرطان الثدي مع أضرار جانبية محدودة. تسمح إضافة عامل تباين الأشعة السينية إلى المحلول الاستئصالي بتعزيز فهم فعالية المحلول عند الوقاية ، حيث يمكننا أن نرى ما إذا كانت كل شجرة قنوية يتم ملؤها بنجاح بعد الحقن (الشكل 2B). إن مشاهدة الغدد المحقونة عن طريق التنظير الفلوري مباشرة بعد الحقن تعكس ما سيتم القيام به على الأرجح في العيادة لتأكيد الملء الناجح لشجرة القنوات. من الأفضل أن يخبرك التأكيد المرئي لتسليم الحل ما إذا كان قد تم الوصول إلى جميع أجزاء الشجرة في الوقت الفعلي. هذا يمكن أن يسمح بإجراء المزيد من الحقن لإكمال الملء في الوقت أو في جلسة مستقبلية. من الأهمية بمكان أن يصل المحلول الاستئصالي إلى جميع أجزاء شجرة الأقنية لضمان إمكانية الوصول إلى جميع الخلايا الظهارية للقتل (الشكل 3). إن ترك الخلايا الظهارية الحية داخل الشجرة سيسمح بإمكانية ظهور سرطان الثدي. يمكن أن يكون استخدام التباين في حقن الهوية لنجاح صورة الحقن مفيدا أيضا للتركيبات الأخرى. يوفر الجدول 1 استكشاف الأخطاء وإصلاحها ونصائح مفيدة. وقد وصفت دراسات أخرى بروتوكولات توصيل الهوية للجسيمات الفيروسية (على سبيل المثال، AdCre، CRISPR دليل الحمض النووي الريبي)، والهرمونات، والمركبات السامة للخلايا، siRNAs و / أو عوامل الاستهداف في الفئران3،16،27،²⁸،^29،30،³¹،32،³³،34،³⁵،^36،37 ، ³⁸ ، الفئران 24،32،³⁹،40،⁴¹ ، والأرانب ⁴²،43،⁴⁴،⁴⁵،^46،47. أفادت دراسات سريرية مستقلة عن نجاح قنية ما يصل إلى ثماني قنوات لكل ثدي للتسليم المحلي للعلاج الكيميائي ⁴⁰،^48،49. إن تصور الملء الكامل عند تقديم حلول أخرى تهدف إلى الوقاية أو موجهة نحو العلاج سيكون مفيدا لأسباب مماثلة. إن معرفة أن الحل قد وصل إلى جميع فروع الشجرة ونهاياتها الطرفية ستكون مفيدة في تقييم الوقاية أو العلاج الناجحين.

نحن لسنا على علم بأي طرق تصوير أخرى داخل القنوات في الفئران33,34 أو النماذج الحيوانية ^{الأخرى47} التي توفر الدقة العالية للجسيمات _{النانوية} TaOx. تجدر الإشارة إلى أن _TaOx في شجرة القنوات الفئرانية يتفوق على عوامل التباين المعتمدة من إدارة الأغذية والعقاقير (FDA) لتصوير القنوات التشخيصية3,16. بينما نواصل تقييم الإجراء الاستئصالي للمعرف لقدرته على الوقاية من سرطان الثدي ، سنكون قادرين على تحديد سرطان الغدد الذي ينشأ منه بدقة أكبر بمساعدة البيانات المضافة المقدمة من خلال التصوير بعد تسليم الهوية. على سبيل المثال ، يمكن للمرء أن يحدد ما إذا كانت الغدة التي تم ملؤها جزئيا فقط أكثر عرضة من الغدة غير المحقونة لتؤدي إلى تكوين الورم ، والذي يعالج ملف تعريف السلامة والقلق من الحقن غير الناجحة على امرأة عالية الخطورة. هذه التقنية لها بعض القيود. هذه تقنية ماوس صعبة نسبيا تتطلب براعة وكفاءة المشغل للتعامل مع كل قناة وتنقيحها بنجاح. كل حقنة فردية هي حدث مستقل وبالتالي فإن الحقن غير الناجح على غدة واحدة أو أكثر قد يضر بتفسير النتيجة. نظرا لحجم الغدة الثديية الفئرانية وهشاشة الحلمة ، فإن التنظير الفلوري أو تقنية توجيه الصور المماثلة غير متوفرة للإبلاغ في الوقت الفعلي عن موعد إيقاف التسريب. سيكون توجيه الصور في الوقت الفعلي هذا شرطا للتنفيذ السريري للتسليم المحلي لحل استئصالي.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
AnalyzeDirect v12.0	Caliper	n/a	For micro-CT image processing
Carprieve, Carprofen 50 mg/mL	Allivet	50647	For anti-inflammatory treatment
Evans blue	Sigma	E2129-50G	For injection visualization
Hot water bath	Toolots	Yidu_HH-S2	For preparing carprofen cups
Imaris	Bitplane	n/a	For confocal image processing
MediGel Sucralose Cups	ClearH2O	74-02-5022	For delivery of carprofen
Model 1705 RN Syringe, 50μL	Hamilton	7655-01	For intraductal injection
Photoshop 2021	Adobe	n/a	For image processing
Quantum GX2 microCT Imaging System	Perkin Elmer	CLS149276	For micro-CT image acquisition
Small Hub RN Needle, 34 gauge, custom (12° bevel angle, 0.375 in, point style 4)	Hamilton	207434	For intraductal injection
Stereo Microscope SZM Series	AmScope	SM-4TPZ-144	For intraductal injection
Sterile blue food dye	McCormick	930641	For injection visualization
Sterile phosphate buffered saline (PBS)	ThermoFisher	14190250	For solution preparation
Stickers	DOT Scientific	DOTSCI-C50	For preparing carprofen cups
Sucrose	Calbiochem	8550-5KG	For intraductal injection
Syringes	Fisher	14-826-79	For preparing carprofen cups
Vortex	VWR	10153-834	For preparing carprofen cups
Warming pump/pad(s)	Braintree Scientific	HTP-1500 120V; AP-R 26E	For intraductal injection/preoperative preparation