משלוח תוך-חינוכי והדמיה של רנטגן של פתרון אבלטיבי מבוסס אתנול למניעה וטיפול מקומי בסרטן השד במודלים של עכבר

Summary

שיטה של הזרקה תוך-יצרנית של ריאגנטים לפתרון אבלטיבי מבוסס אתנול לעץ דביק החלב של העכבר להדמיית ויוו ומניעת סרטן השד מתוארת. הזרקה ישירות לתוך פתח הפטמה מאפשרת מיקוד תאי אפיתל החלב עם נזק מינימלי לרקמות משניות.

Abstract

סרטן השד הוא הסרטן הנפוץ ביותר והגורם השני המוביל למוות הקשור לסרטן לנשים בארה"ב. עבור נשים בסיכון גבוה, כריתת שד מניעתית היא אסטרטגיית המניעה העיקרית היעילה ביותר. כריתת שד מניעתית היא הליך כירורגי אגרסיבי שמסיר לחלוטין את תאי האפיתל החלביים שמהם מתעורר סרטן השד יחד עם הרקמה שמסביב. אנו מבקשים לפתח הליך תוך דלקתי זעיר פולשני כחלופה לכריתת שד מניעתית כדי לנטרל באופן מקומי את תאי האפיתל החלביים לפני שהם יכולים להיות ממאירים. אנחנו ואחרים פיתחנו הליך לידה תוך-דלקתי כדי להגיע ולטפל בתאי האפיתל האלה במודלים מכרסמים של סרטן השד. בעוד שלבלוטת החלב של העכבר עם עץ דביק יחיד שאינו anastomosed שנפתח בפטמה יש ארכיטקטורה הרבה פחות מורכבת ומיוסרת מאשר השד האנושי, מודלים עכבר המושרה כימית מהונדס גנטית של סרטן השד הם בעלי ערך כדי לייצר מחקרים הוכחת הרעיון של אסטרטגיות מניעה חדשות. כאן, אנו מתארים הליך לאספקה תוך רחמית של פתרון אבלטיבי מבוסס אתנול המכיל מיקרו-CT / רנטגן טנטלום מבוסס סוכן ניגודיות בתוך עץ דביק החלב העכבר למטרה הטיפולית של מניעה ראשונית של סרטן השד. משלוח תוך-יצרני של ריאגנטים מימיים (למשל, תרכובות ציטוטוקסיות, siRNAs, AdCre) תואר בעבר במודלים של עכבר. לכן, אנו ממקדים את תיאור הפרוטוקול שלנו על שינויים מתודולוגיים ושיקולים ניסיוניים ייחודיים לייעול המסירה של אתנול, למזעור תופעות לוואי מקומיות ומערכתיות של ניהול אתנול, ועל הדמיה in vivo של מילוי עץ דביק באמצעות הדמיית מיקרו-CT / פלואורוסקופיה. הדמיה של עץ הרקיע מיד לאחר הזרקת פתרון המכיל ניגודיות מאפשרת אישור של מילוי מלא או תוצאות לא מוצלחות כגון מילוי חסר או מילוי יתר. הליך זה יכול להיות מיושם עבור משלוח והדמיה של תרכובות אבלטיביות אחרות שמטרתן למנוע היווצרות גידול או טיפול מקומי גידולים בשלב מוקדם נגיש באמצעות עץ דביק.

Introduction

סרטן השד היא מחלה נפוצה שעלולה להיות קטלנית עם מעט אפשרויות זמינות ^{למניעה1}. ההתערבות היעילה ביותר היא כריתת שד מניעתית; עם זאת, רק אנשים בסיכון גבוה בוחרים לעבור הליך זה כפי שהוא ניתוח עם השלכות משנות חיים ^{גדולות2}. ההליך מסיר לחלוטין את תאי האפיתל החלביים שמהם מתעורר סרטן השד יחד עם הרקמה שמסביב. זה יכול לגרום ללחץ פיזי, פסיכולוגי וחברתי עבור הפרט, ולעתים קרובות להניא אנשים מלהמשיך עם הליך כירורגי זה כקו הראשון שלהם של התערבות ראשונית.

הוכחנו כי משלוח של פתרון אבלטיבי המכיל 70% אתנול (EtOH) ישירות לתוך עץ דביק יעיל בהריגת תאי אפיתל החלב עם נזק מוגבל לרקמות משניות ובמניעת גידולי שד במודלים של ^{עכברים3}. EtOH שימש זמן רב קלינית כסוכן אבלטיבי או sclerosing לטיפול מקומי. הזרקת EtOH מלעורית משמשת כסוכן אבלטיבי עבור גידולי כבד בלתי ניתנים לפענוח, neoplasms כליות בלוטת יותרת הכליה, וגידולים ציסטיים בלבלב4,5,6; עבור צליאק פלקסוס נוירוליזה כדי להפחית את ^הכאב7; ולטיפול בשד פסאודו-אוניוריזמים8. הזרקת EtOH תוך וסקולרית משמשת כסוכן sclerosing כדי למנוע נפיחות ועיוות ממומים arteriovenous (AVM), ולטיפול קוסמטי של ורידים עכביש דליות9,10,11,12,13. כמו כריתת שד מניעתית, הצלחת המניעה עם משלוח מקומי של פתרון אבלטיבי תלויה ביכולת להסיר לחלוטין את כל תאי האפיתל החלביים שמהם הסרטן עלול להתעורר. זה דורש אישור כי החומר אבלטיבי מילא בהצלחה את העץ דביק, ובכך ליצור קשר עם כל תאי אפיתל החלב ישירות. אמצעים קליניים להזרקת חומרים בתוך בלוטות החלב ולהדמייתם על ידי פלואורוסקופיה מונחית תמונה או ductography זמינים ^{בקלות14,15}; לכן, ניתן יהיה גם לספק ולאשר משלוח מוצלח כאשר הליך זה עשוי להצדיק הערכה בניסויים קליניים.

הדגמת ההיתכנות של גישה מונחית תמונה זו בחיות מעבדה היא צעד מפתח בביסוס היעילות והיתכנות התרגומית של אבלציה תוך-חינוכית (ID) כאמצעי מניעה לסרטן השד. במעבדה שלנו, פיתחנו שיטה להזרקה מוצלחת של כל בלוטות החלב בעכברים עם פתרון אבלטיבי המכיל חומר ניגודיות במהלך זריקות שבועיות כדי להבטיח שהחיה לא תיכנע למנת יתר של EtOH (איור 1, איור 2, התייחסות מס' ^3,16). הליך זה מציב מחט 34 G בתוך פתח הפטמה של עכבר מרדים איזופלוריין כדי להזריק את פתרון הבדיקה. כמה שיפורים מרכזיים של ההליך כוללים שימוש מזרקים gastight עבור נוזלים וגזים, הזרקת כמויות גבוהות יותר לכל עצים ^{דביקים17}, וטיפול אנטי דלקתי מורחב. הטיפול הפרה-קליני של 5 מ"ג/ק"ג של carprofen, NSAID, מ 2 d לפני עד 7 d לאחר הליך הזיהוי עולה בקנה אחד עם זה של טיפול sclerosing קליני עבור AVM. בדרך כלל, לאחר הרדמה מערכתית, החולים מקבלים תרופות אנטי דלקתיות, כגון NSAIDs, במשך יומיים לאחר ההליך שניתן להאריך כדי להקל על כל דלקת מקומית או ^כאב12. שיכרון אלכוהול הוא הקלה משמעותית על ידי הזרקה תוך פריטטונית של פתרון סוכרוז 5% בעכברים. עם מתן פתרון סוכרוז זה, עכברים יכולים להיות מוזרקים בבטחה עם עד 160 μL של 70% EtOH (עד ארבעה עצים דביקים; כ 0.4 g / dL של תוכן EtOH בדם); בעלי חיים התאוששו באופן מלא בתוך 4 שעות לאחר זריקות מזהה. להזרקה של יותר מארבע בלוטות בעכברים ו/או ריכוזי EtOH גבוהים יותר, אנו מבצעים מפגשים רציפים כדי לאפשר מספיק זמן התאוששות. שיכרון אלכוהול אצל נשים יהיה דאגה פחותה בשל השיעור הנמוך יותר של כמות אלכוהול למשקל הגוף. בהתחשב במספר העצים הדביקים בשד ^{האדם14,15}, כ -16, והנפח המשוער למלא כל צינור עץ ^18,19, עד 32 מ"ל של 70% EtOH יינתן. כמות זו תהיה נמוכה בהרבה מ 50 מ"ל של 95% EtOH מנוהל בהליכים קליניים ^{אחרים4,9}. ניהול תוך ורידי של תמיסת תיאמין וגלוקוז יכול לשמש כדי למזער עוד יותר את ההשפעות של שיכרון EtOH, במיוחד במקרים שבהם נפח כולל גדול יותר של EtOH ייתכן שיהיה צורך להזריק ו/או לנשים שיש להם סובלנות נמוכה יותר לצריכת אלכוהול (למשל, וריאנטים אלליים באלכוהול או אלדהיד דהידרוגנאז).

הדמיה באמצעות מיקרו-CT/פלואורוסקופיה מאפשרת לנו לאשר מילוי דביק מוצלח של כל בלוטה (איור 1, איור 2, איור 3). זה יכול להיות מוקלט לניתוח עתידי, או להעריך באותו הרגע באמצעות הדמיה פלואורוסקופיה בזמן אמת, כפי שנעשה ביישום קליני, כדי להגביל את נטל הקרינה הכולל שהוטל על החיה. כדי לשפר עוד יותר תכונות ספציפיות של פתרון אבלטיבי זה עבור משלוח מונחה תמונה בזמן אמת ב vivo, השווינו בעבר ניגוד המכיל יוד שאושר על ידי ה-FDA לתחמוצת טנטלום (_TaOx) המכילה חלקיקים מסונתזים על ידי מעבדת שפירו ^3,16. _TaOx הראתה ביצועים מעולים כסוכן ניגודיות מיקרו-CT להדמיית המילוי הראשוני של עץ ההדבקה (איור 2, איור 3). _TaOx יכול לשמש ניגוד התייחסות לביצוע הערכה שיטתית יותר אורך של סוכני ניגודיות מאגר דם אחרים מבוססי חלקיקים (למשל, יוד-, ביסמוט, או המכיל זהב) ותאימות של _TaOx עם ריכוזים שונים של תאית אתיל כמו סוכן ^gelling20,21.

Protocol

כל הניסויים המתוארים כאן נערכו תחת פרוטוקולים שאושרו על ידי הוועדה המוסדית לטיפול בבעלי חיים ושימוש באוניברסיטת מישיגן.

1. טיפול אנטי דלקתי מורחב

1. ודא כי עכברים המקבלים פתרונות הזרקה המכילים EtOH או גירויים פוטנציאליים אחרים מסופקים עם טיפול אנטי דלקתי מיומיים לפני ההזרקה ל 7 ימים לאחר ההזרקה. השיטה המועדפת של מינון היא משלוח אוראלי באמצעות ג'ל סוכרלוז המכיל carprofen בריכוז מתאים.
2. הכן carprofen עם הריכוז הנדרש. לניסוי זה, פתרון עבודה של 2 מ"ג / מ"ל (פתרון המלאי הוא 50 מ"ג / מ"ל) הוכן על ידי דילול PBS סטרילי להזריק 0.5 מ"ל כדי להשיג מנה סופית של 1 מ"ג לכוס. הוסף 1% v / v צבע מזון כחול סטרילי (BFD) במקום שבריר של PBS של הנפח הכולל הדרוש לדילול כדי לדמיין טוב יותר ערבוב מלא של התרופה לתוך ג'ל סוכרלוז.
3. הכן לתוספת carprofen לפי המלצת היצרן. אלא אם כן מומלץ אחרת, מניחים את הכוס באמבט מים של 60 מעלות צלזיוס למשך 15 דקות. הסר את הכוסות ולייבש אותם כדי למזער את האפשרות של זיהום.
   1. יש להשתמש ב-70% EtOH או במחיקת EtOH לניקוי פני הכוס ולאפשר לייבוש. השתמש מזרק כדי להזריק את הכמות הדרושה של פתרון carprofen דרך המכסה. לניסוי זה, 500 μL מוזרק. לכסות את אתר ההזרקה עם מדבקה לנער במרץ במשך 15 s.
   2. מערבולת את הכוס במשך 15 שניות, ולאחר מכן לאחסן לשימוש מאוחר יותר לאחר אימות חזותי ערבוב מלא. בדוק את הכוסות עבור ערבוב הומוגני על ידי חיפוש גושים כחולים כהים. אפשר לכוסות להגיע לטמפרטורת החדר לפני המעבר למקרר לאחסון עד חודש.
      הערה: כוסות אלה ניתן גם לאחסן בטמפרטורת החדר פעם מינון, במידת הצורך, אבל יש לדאוג לשים לב הדרכה יעילות סמים מהיצרן. היכרויות המדבקה מסייע במעקב אחר תאריך ההזרקה מבלי להסתכן בעט או סמן חד המנקב את המכסה.
4. כאשר אתם מוכנים לשימוש, נגבו את החלק החיצוני של הכוס עם 70% EtOH. מקלפים את המכסה ומניחים את הכוס בכלוב עם העכברים. החלף את הכוסות כל יומיים או כאשר הן ריקות. אחת צריכה להספיק לעד חמישה עכברים למשך 1-2 ימים.

2. הכנה לפני הניתוח

הערה: שלב זה יתרחש 2-3 ימים לפני הזריקה.

1. מרדים את העכבר באמצעות מאדה איזופלוריין (2%-3% איזופלוריין, 1.5 ליטר / דקה של חמצן) ולהחיל חומר סיכה לעיניים. לשמור על הרדמה ב 1%-3% איזופלוריין לפי הצורך לאורך כל ההליך עם חרוט האף תוך ניטור זהיר של קצב הנשימה של החיה.
2. החל את חומר הסיכה לעיניים של העין על עיני העכבר בעודו בקונוס האף ולאחר מכן מקם את העכבר על גבו. השתמש אפליקטור קצה כותנה כדי להחיל קרם depilatory ללא מרשם על אזור הפטמה (האזור של בלוטת החלב כי יוזרק). לשפשף את הקרם לתוך האזור במשך 10-30 שניות עם המוליך כדי לעזור לשחרר את הפרווה במהירות.
   הערה: אין להשאיר את הקרם על החיה יותר מהנדרש ולהסיר לחלוטין כדי למנוע שריפת העור.
3. לאחר 10-30 s של היישום, להשתמש במים חמים על גזה כדי להסיר לחלוטין את השמנת ולשחרר את הפרווה מן החיה. בצע לפחות שתיים עד ארבע שטיפות של האזור עם גזה טרייה להסרת קרם לפני הייבוש עם גזה יבשה ונקייה לאחר השטיפה הסופית. בדוק את האזור של הסרת פרווה כדי לאשר ראות טובה וגישה לפטמות. יש לחזור על הפעולה עם מריחת קרם דפילטורי במידת הצורך.
4. מניחים את העכבר בכלוב התאוששות נקי ויבש נפרד על כרית חימום כדי להתאושש מהרדמה. שים לב לעכבר עד שהוא התאושש לחלוטין מהרדמה ולהחזיר אותו לכלוב הבית.
5. ספק לעכברים אחת של תמיסת ג'ל סוכרלוז המכילה קרפרופן (1 מג/כוס) עבור מינון מראש של הסוכן האנטי דלקתי לאחר ההחלמה. אחת יכולה לספק עד חמישה עכברים עם carprofen עד 2 ימים. יש לבדוק את הכוס מדי יום ולהחליף לפי הצורך, או כל יומיים אם לא נצרך במלואו.

3. הזרקה תוך דלקתית

הערה: שלב זה יתרחש 2-3 ימים לאחר הכנה לפני הניתוח.

1. הכן פתרון מלאי של תחמוצת טנטלום (_TaOx) בגודל 333.3 מ"מ ממנת יתר של תחמוצת טנטלום (TaOx) מפורמולה של אבקה שנרכשה כמתואר ^ב-16 באמצעות תמיסת מלח חוצצת פוספט (PBS). יש להשתמש בחום עדין אם האבקה אינה מתמוססת במלואה לתוך התמיסה.
2. הפוך פתרון הדמיה ablative על ידי ערבוב שלושה חלקים מניות _TaOx עם שבעה חלקים 100% EtOH עבור פתרון סופי 70% EtOH 100mM _TaOx . הוסף 1% v / v צבע מזון כחול לפתרון הסופי עבור הדמיה בסיוע במהלך ההזרקה. הכן אמצעי אחסון המבוסס על הצורך בניסוי.
   הערה: זוגות בלוטות 1 ו -5 יכולים להכיל עד 30 μL של הפתרון בעוד כל הזוגות האחרים ניתן להזריק עם עד 50 μL ב 9 שבועות או עכברי FVB מבוגרים יותר.
3. מרדים את העכבר עם איזופלוריין כמו בהכנה טרום ניתוחית ולהזיז את העכבר לחרוט האף פעם אחת מורדם לחלוטין. החל חומר סיכה בעיניים לפני הנחת החיה על גבו עבור הזריקה. אבטח את העכבר מתחת לסטריאוסקופ באמצעות סרט הדבקה, במידת הצורך.
4. הכן את המזרק עם הנפח הרצוי של פתרון הזרקה. טען 21-51 μL של פתרון ההזרקה לתוך מזרק 50 μL עם מחט 34 G מחובר. טען 1 μL נוסף של הפתרון כדי להסביר את הדליפה הפוטנציאלית של נפח זה לאחר המחט מוסר מהפטמה.
   הערה: אמצעי אחסון לעיל מיועדים להליכים הטיפוסיים המוצגים כאן. אפשר להזריק כל נפח הרצוי עם ההבנה כי רוב הבלוטות יהיו overfilled אם הולך מעל 30 μL או 50 μL בזוגות בלוטות 1 ו 5, או 2-4, בהתאמה. זה מועיל למלא את המחט עם נפח נוסף של פתרון ההזרקה כדי לבדוק את הזרימה החופשית של הפתרון מיד לפני ההזרקה. אם הזרקת יותר מבלוטת חלב אחת, יש למלא מראש מזרקים מרובים כדי לחסוך זמן. עם זאת, לא להשאיר את הפתרון במזרק במשך זמן רב.
5. הכן את הפטמות להזרקה על ידי הסרת כל עור מת המכסה את פתיחת הפטמה עם מלקחיים מחודדים עדינים.
6. החזק את הפטמה בעדינות עם פינצטה. עם השיפוע של המחט גלוי, להכניס את המחט לתוך פתיחת הפטמה עד השיפוע מכוסה במלואו עם הדרכה בעזרת הדרכה של מלקחיים טיפים עדינים. ייתכן שיהיה צורך למשוך את הפטמה על המחט במקום לדחוף את המחט לתוך הפטמה (טבלה 1).
7. לאחר שיפוע המחט מוקף לחלוטין על ידי הפטמה והוא בצינור הראשי, להתחיל להזריק את הפתרון בקצב קבוע של כ 40 μL / min. הימנע הזרקה מהר מדי כדי להבטיח כי עץ דביק אינו פגום. שמור את המחט בפטמה במשך 30 שניות לאחר הנפח מוזרק לחלוטין לפני הסרת המחט עם סיוע באמצעות מלקחיים. הדבר נעשה כדי למנוע את התמיסה שנשפכת מהפטמה (איור 2).
   1. להעריך את האזור עבור כל סימנים של הזרקה לא מוצלחת. מראה כיפה עשוי להצביע על הזרקת כרית שומן או טראומה לאזור.
   2. המשך להזריק את בלוטות החלב הנותרות.
8. בעוד החיה עדיין מורדמת, להזריק 200-250 μL של 5% תמיסת סוכרוז (עד 10 מ"ל /ק"ג) תוך-אפריטונית כדי למזער את ההשפעות הפוטנציאליות של שיכרון אלכוהול.

4. הדמיית מיקרו-CT

1. לאחר הזרקת כל הבלוטות הרצויות, להעביר את החיה במהירות למערכת micro-CT ולהמשיך לשמור על הרדמה באמצעות מאדה איזופלוריין משולב. ניתן להדביק את החיה כדי לתקנן את מיקום ההדמיה. לדוגמה, הדבקת כל רגל אחורית בתנוחה מורחבת מסייעת לשמור על עצמות הרגליים של החיה רחוק יותר מהבלוטות התחתונות של עניין בתמונה המתקבלת.
   הערה: ניתן לדמיין את בעלי החיים באמצעות פרמטרי סריקה שונים להדמיה של עץ הרקיע אם יש להקפיד לקבוע מינון מתאים לכל החיים המקובל של קרינה עבור החיה והמינונים המצטברים אינם עולים על רמה זו. ניתן ליצור תמונות סטילס וסרטונים פלואורוסקופיים מבלי לבצע סריקות כדי להפחית עוד יותר את החשיפה לקרינה (איור 2).
2. מקם את העכבר בשדה התצוגה המתאים באמצעות פונקציית התצוגה המקדימה של פלואורוסקופיה.
3. בצע הדמיית _TaOx של עץ דביק העכבר עם רזולוציה טובה והזדמנות לסריקות רכישה סטנדרטיות חוזרות ונשנות (2 דקות). השתמש בפרמטרי הסריקה הבאים: 90 kVp/88 μA; שדה ראייה (FOV), 36 מ"מ; מספר פרוסות, 512; עובי פרוסה, 72 מיקרומטר; רזולוציית ווקסל, 72 ^{מיקרומטר3}.
   1. קבל סריקות ארוכות יותר (4 או 14 דקות) ברזולוציה גבוהה לקבלת רזולוציה טובה עוד יותר בבעלי חיים. אלה מקובלים כהליכים סופניים לפני המתת חסד. אלה, עם זאת, אינם מקובלים על בעלי חיים להיות נסרקים לאורך באמצעות אותם פרמטרים כפי שהוא יגרום למחלת קרינה.
4. לאחר השלמת פרוטוקול ההדמיה, יש להוציא את החיה מהרדמה ולעבור לכלוב התאוששות נפרד ונקי ויבש על כרית חימום. התבונן בחיה עד התאושש באופן מלא, ולאחר מכן להחזיר אותו לכלוב הבית. שמור את בעלי החיים מוזרק עם פתרון אבלטיבי על carprofen עד 7 ימים לאחר הזרקה.
5. בצעו עיבודים מהירים של תמונות סרוקות בתוך תוכנת המיקרו-CT (מערכת מובנית) כדי להעריך טוב יותר דליפות ניגודיות או חוסר מילוי (איור 2) ללא ניתוח רשמי.
6. בצע ניתוח תמונה רשמי נוסף לפרסום או ניתוח מפורט של סריקות המאפשרות פילוח של תחום העניין במידת הצורך (איור 3).
   הערה: ההבדל העיקרי בין שיטות אלה יהיה היכולת לסלף רק את עץ הרקיע (ביצוע רשמי) לעומת הצורך לסלף את התמונה כולה (ביצוע מהיר). מדידות ותמונות אחרות עשויות להיווצר באמצעות חבילות התוכנה כדי להדגים בצורה הטובה ביותר את ההצלחה של מילוי עץ דביק.

5. ניתוח תמונה

1. בצע עיבוד של עץ דביק מוזרק באמצעות חבילת תוכנה מיוחדת. כדי לעשות זאת, לפלח את כרית שומן החלב עם עיבוד תמונה נוספת.
   1. כדי לפלח את כרית השומן (תא כהה יותר בהשוואה לחלל הצפק, שרירי הירך והעור) שבתוכו כלול עץ העניין הדביק, בחר באפשרות Spline Trace מהתפריט הידני. עקוב אחר קו המתאר של כרית השומן בכל פרוסת נתונים שלישית.
   2. לחצו על האפשרות 'הפץ עצמים ' מהתפריט החצי אוטומטי כדי לחבר את כל הפרוסות שאחריהן עוקבים ולא נענו לעצם אחד.
2. בחר באפשרות עוצמת סף מהתפריט החצי אוטומטי כדי להזין את טווח ה- HU הרצוי (300-3,000 HU הוא נקודת התחלה טובה), ולאחר מכן לחץ על לחצן עיבוד סף כדי ליצור עיבוד המציג רק את הניגודיות (TaOx) בתוך עץ הרקיע ומבטל רקמות רכות.
3. החלף את הלחצן 'תצוגה ' ל'עיבוד כראשי' כדי להציג רק את הביצוע התלת-ממדי ללא מבנים מקיפים.
   הערה: תכונות תוכנה נוספות מאפשרות לבצע מדידות של הביצוע התלת-ממדי (כלומר, אורך, נפח וכו ').

תוצאות

לעכברים הנשיים יש חמישה זוגות של בלוטות חלב עם עץ דביק יחיד שנפתח בפתח ^הפטמה22. בקצה עץ הרקיע המתפתח נמצאים ניצני הקצה המסוף (TEBs), מבנים מתרבים המכוונים צמיחה והסתעפות. לאחר גיל ההתבגרות כאשר שלב ההארכה הושלם, TEBs לסגת ולהיות בלתי מובחנים מבחינה פונקציונלית ואנטומית מצינורות מסוף או ניצנים מכתשיים23. יחידות לובולריות דביקות סופניות משרתות פונקציה דומה בבני אדם כמו TEBs בעכברים והם האתרים שמהם מתעורר בעיקר סרטן ^השד24,25. אנחנו יכולים להזריק עד 50 μL של פתרון EtOH של 70% כדי למלא את כל העץ הדביק של בלוטות החלב של בית החזה והבטן של FVB/N בן 9 שבועות, NSG וזני עכבר אחרים (איור 1, איור 2, איור 3, ראו הפניות3,16). בניסוי טיפוסי, אנו יכולים להזריק עד שמונה בלוטות חלב עם פתרון אבלטיבי של 70% EtOH ו- 100 mM _TaOx בשני הליכי זיהוי רצופים המופרדים על ידי 7 ימים כדי לאפשר התאוששות בעלי חיים (איור 2). בעלי חיים מצולמים על ידי מיקרו-CT מיד לאחר הזרקת המזהה האחרונה כדי להעריך מסירה מוצלחת של הפתרון לעץ הדביק כולו (איור 2). מניסיוננו, הפטמות של בלוטות מפשעתיות מתאימות להזרקה בכ -60% מבעלי החיים, והפטמות של בלוטות הצוואר בכ -40%. כאשר הדבר מתאים, אנו יכולים להזריק עד 30 μL של פתרון EtOH של 70% כדי למלא את כל עץ הרקיע של בלוטות החלב הצוואריות והמשפתיות (איור 2). זני FVB ו- NSG מציגים בדרך כלל פטמות מתאימות יותר להזרקה מאשר זני C57BL / 6J או זני רקע גנטיים מעורבים. פרוטוקול הכתמה כפולה של הרכבה שלמה או מיקרוסקופיה קונפוקלית תלת-ממדית הם שיטות אורתוגונליות טובות המאשרות באיזו מידה מלא עץ הרקיע (איור 3). ניתוחים אלה בקורלציה רקמות תואמים וניתן לבצע אותם לאחר הדמיית vivo. המגבלה הברורה של שיטות אורתוגונליות אלה היא שהן דורשות סיום בעלי חיים לאיסוף וניתוח רקמות; עם זאת, בשלב אופטימיזציה של ניסוח ablative חדש, הם מספקים אימות עצמאי.

איור 1: זרימת עבודה של פרוצדורה תוך-חינוכית וניתוח תמונה. שלבי המפתח של הליך הזיהוי מסומנים. אנא עיינו בסרטון לקבלת פרטים נוספים. לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

איור 2: קנוניולציה מוצלחת ואספקה של פתרון אבלטיבי לבלוטות החלב מרובות. (A) שינוי פטמות מייצג בזני עכבר FVB ו- NSG. פטמות ארוכות קלות יותר לחיבור מאשר פטמות קצרות, ואילו פטמות קצרות מדי או שריד לא ניתן לחתוך. לאחר cannulated, גודל הפטמה אינו משפיע על משלוח תוך דלקתי מוצלח. (B) ניתוח אנטומי גס של צבע כחול בתמיסה אבלטיבית מספק ראיות ex vivo של מילוי עץ דביק והצלחה משלוח. (ג,ד) פלואורוסקופיה בזמן אמת ורכישת פוסט-תמונה עיבוד מיקרו-CT 3D מספקים ראיות vivo להצלחה באספקה. (D) הזרקה מוצלחת של בלוטות הבטן והמפשעה, ושלוש מתוך ארבע בלוטות בית החזה (הזרקת כרית שומן בבלוטה #2). סרגלי קנה מידה תואמים ל- 1 מ"מ בתמונות בהגדלה שונה. לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

איור 3: הדגמת vivo ו - ex vivo של מילוי עץ דביק. 70% EtOH / 100 mM _TaOx חלקיקים / אוונס כחול פתרון הוזרק תוך רחמי לתוך בלוטת החלב הבטן של העכבר ומיד דמיין על ידי מיקרו-CT ומעובד עבור כתמי הרכבה שלמים כפולים. עץ דביק שוחזר באמצעות חבילת תוכנה לניתוח תמונה. התמיסה ממלאת לחלוטין את עץ הרקיע מוכתם בכרמיין אלום. בלוטה נפרדת הייתה מחוסנת עבור E-Cadherin (Cdh1), פינה באמצעות בנזיל אלכוהול:בנזיל בנזואט ותמונה על ידי מיקרוסקופיה קונפוקלית ^{כמתואר26}. עץ ההדבקה שוחזר באמצעות תוכנת ניתוח תמונה. עיבוד פסאודו-צביעה של תמונה קונפוקלית (כלומר, רקע שחור ללבן, אות סמן ירוק למגנטה) הושג עם פונקציית היפוך התמונה של תוכנת עריכת התמונה. סרגלי קנה מידה תואמים ל- 1 מ"מ בתמונות בהגדלה שונה. נתון זה שונה מהפניה מס' ³. לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

בעיה	מראה		תמיסה
פטמה קצרה (איור 2)	לפטמה יש פרופיל נמוך – קשה לתפוס		לפעמים קל יותר להחזיק את העור ליד הפטמה ולמקד את מרכז הפטמה עם המחט. סביר להניח שהמחט תצלול מתחת לעור. משיכה למעלה לאט עשויה לחשוף את הפטמה להיות מעט מעל קצה המחט ולתת מקום לתפוס ולמשוך אותו שאר הדרך אל המחט. היזהר מאוד בעת צלילה מתחת לעור על זווית המחט. קל לקבל בשוגג זריקת כרית שומן על ידי דקירה בזווית הלא נכונה.
פטמה שמנה	הרבה יותר גדול מאשר פטמות אחרות עם עור מת קלוף קטן – ניתן לראות בקלות ללא היקף		קל מאוד לקבל זריקת כרית שומן על הפטמות האלה. להיות זהיר מאוד על זווית המחט בעת החדרת לתוך הפטמה.
הזרקת כרית שומן (איור 2)	נפוח סביב הפטמה ואולי בפטמה עצמה – הכי קל לראות אם הצבע מתווסף לפתרון הזרקה		אם הפטמה מתנפחת עם כמה הראשונים ul מוזרק, להסיר מחט, ולנסות להכניס שוב עם טיפול נוסף נלקח של זווית. התחל הזרקה שוב ולצפות נפיחות נוספת. אם הנפיחות נמשכת, לנטוש את הניסיון. נדיר מאוד להזריק בהצלחה פטמה שהחלה כהזרקת כרית שומן.
פצעים/גלדים	פצע פתוח או גלעד ליד אתר הזרקה של פתרון EtOH		החל משחה אנטיביוטית משולשת כדי לפתוח פצעים אבל להשאיר פצעים scabbed לבד. החלת משחה על גלדים יכולה להגביר את הסבירות שבעלי חיים יטרידו את הגלד ויסירו אותו. יש לבדוק כל 1-2 ימים עד להחלמתו בהתאם לחומרת הפצע. Carprofen צריך להינתן עד נרפא גם אם מעבר לחלון רגיל.

טבלה 1: פתרון בעיות ועצות מועילות.

Discussion

כריתת שד מניעתית היא כיום ההתערבות היעילה ביותר לסרטן השד, אך יש לה כמה השפעות שליליות חמורות. אבלציה מקומית של תאי אפיתל החלב עם פתרון מבוסס EtOH היא טיפול אלטרנטיבי מבטיח כפי שהדגמנו במחקר הוכחת רעיון על מודל עכבר FVB-Tg-C3(1)-TAg אגרסיבי של סרטן ^השד3. הזרקת זהות של פתרון אבלטיבי זה מאפשרת מיקוד של תאי האפיתל החלביים שמהם מתעורר סרטן השד עם נזק משני מוגבל. הוספת חומר ניגודיות לרנטגן לפתרון האבלטיבי מאפשרת הבנה משופרת של יעילות הפתרון במניעה, שכן אנו יכולים לראות אם כל עץ דביק מתמלא בהצלחה לאחר ההזרקה (איור 2B). צפייה בלוטות מוזרקות על ידי פלואורוסקופיה מיד לאחר הזרקה מראות מה צפוי להיעשות במרפאה כדי לאשר מילוי מוצלח של עץ דביק. אישור חזותי של אספקת פתרונות יודיע בצורה הטובה ביותר אם כל חלקי העץ הושגו בזמן אמת. זה יכול לאפשר הזרקה נוספת להתבצע כדי להשלים מילוי בזמן או בהפעלה עתידית. חשוב מאוד שהפתרון האבלטיבי יגיע לכל חלקי העץ הדביק כדי להבטיח שניתן יהיה לגשת לכל תאי האפיתל להרג (איור 3). השארת תאי אפיתל חיים בתוך העץ תאפשר את האפשרות כי סרטן השד עדיין יכול להתעורר. ניצול ניגודיות זריקות מזהה להצלחת התמונה של הזריקה יכול להיות גם שימושי עבור ניסוחים אחרים. טבלה 1 מספקת עצות לפתרון בעיות ועצות מועילות. מחקרים אחרים תיארו פרוטוקולי משלוח מזהה עבור חלקיקים ויראליים (למשל, AdCre, CRISPR מדריך RNAs), הורמונים, תרכובות ציטוטוקסיות, siRNAs ו/או סוכני פילוח בעכברים3,16,27,28,29,30,31,32,33,34,35,36,37 ³⁸, חולדות24,32,39,40,41, וארנבות 42,43,44,45,46,47. מחקרים קליניים עצמאיים דיווחו על קנוניולציה מוצלחת של עד שמונה צינורות לכל שד עבור משלוח מקומי של כימותרפיה40,48,49^. הדמיית מילוי מלא בעת מתן פתרונות אחרים המיועדים למניעה או המיועדים לטיפול תהיה כדאית מסיבות דומות. הידיעה כי הפתרון הגיע לכל הענפים והקצוות הסופיים של העץ תהיה אינפורמטיבית בהערכת מניעה או טיפול מוצלחים.

איננו מודעים לשיטות הדמיה תוך-דלקתיות אחרות ^{בעכברים3,34} או במודלים אחרים של בעלי ^חיים47 המאפשרים רזולוציה גבוהה של חלקיקי _TaOx. ראוי לציין, _TaOx בעץ דביק murine ביצועים טובים יותר סוכני ניגודיות שאושרו על ידי ה-FDA עבור ductography ^{אבחון3,16}. כפי שאנו ממשיכים להעריך את ההליך ablative מזהה על יכולתו למנוע סרטן השד, נוכל לקבוע בצורה מדויקת יותר מאיזה סרטן בלוטות עולה בעזרת נתונים נוספים שניתנו באמצעות הדמיה לאחר מסירת זהות. לדוגמה, ניתן לקבוע אם בלוטה שהתמלאה רק באופן חלקי היא סבירה יותר מאשר בלוטה שאינה מוזרקת כדי לגרום להיווצרות גידול, אשר מטפל בפרופיל הבטיחות וחשש של זריקות לא מוצלחות על אישה בסיכון גבוה. טכניקה זו יש כמה מגבלות. זוהי טכניקת עכבר מאתגרת יחסית הדורשת מיומנות ומיומנות של המפעיל כדי לתפעל בהצלחה cannulate כל צינור. כל זריקה בודדת היא אירוע עצמאי ולכן הזרקה לא מוצלחת על בלוטה אחת או יותר עלולה לסכן את פרשנות התוצאה. בהתחשב בגודל של בלוטת החלב murine ושבריריות של הפטמה, פלואורוסקופיה או טכניקת הנחיית תמונה דומה אינו זמין ליידע בזמן אמת מתי להפסיק עירוי. הנחיית תמונה בזמן אמת זו תהיה דרישה ליישום קליני של אספקה מקומית של פתרון אבלטיבי.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
AnalyzeDirect v12.0	Caliper	n/a	For micro-CT image processing
Carprieve, Carprofen 50 mg/mL	Allivet	50647	For anti-inflammatory treatment
Evans blue	Sigma	E2129-50G	For injection visualization
Hot water bath	Toolots	Yidu_HH-S2	For preparing carprofen cups
Imaris	Bitplane	n/a	For confocal image processing
MediGel Sucralose Cups	ClearH2O	74-02-5022	For delivery of carprofen
Model 1705 RN Syringe, 50μL	Hamilton	7655-01	For intraductal injection
Photoshop 2021	Adobe	n/a	For image processing
Quantum GX2 microCT Imaging System	Perkin Elmer	CLS149276	For micro-CT image acquisition
Small Hub RN Needle, 34 gauge, custom (12° bevel angle, 0.375 in, point style 4)	Hamilton	207434	For intraductal injection
Stereo Microscope SZM Series	AmScope	SM-4TPZ-144	For intraductal injection
Sterile blue food dye	McCormick	930641	For injection visualization
Sterile phosphate buffered saline (PBS)	ThermoFisher	14190250	For solution preparation
Stickers	DOT Scientific	DOTSCI-C50	For preparing carprofen cups
Sucrose	Calbiochem	8550-5KG	For intraductal injection
Syringes	Fisher	14-826-79	For preparing carprofen cups
Vortex	VWR	10153-834	For preparing carprofen cups
Warming pump/pad(s)	Braintree Scientific	HTP-1500 120V; AP-R 26E	For intraductal injection/preoperative preparation