نموذج جراحي لفشل القلب مع الكسر القذفي المحفوظ في الخنازير الصغيرة التبتية

Summary

يصف هذا البروتوكول إجراء خطوة بخطوة لإنشاء نموذج صغير لفشل القلب مع جزء طرد محفوظ باستخدام انقباض الأبهر النازل. كما يتم عرض طرق تقييم مورفولوجيا القلب والأنسجة ووظيفة نموذج المرض هذا.

Abstract

يتم تصنيف أكثر من نصف حالات قصور القلب (HF) على أنها قصور القلب مع الكسر القذفي المحفوظ (HFpEF) في جميع أنحاء العالم. النماذج الحيوانية الكبيرة محدودة للتحقيق في الآليات الأساسية ل HFpEF وتحديد الأهداف العلاجية المحتملة. يقدم هذا العمل وصفا مفصلا للإجراء الجراحي لتضيق الأبهر الهابط (DAC) في الخنازير الصغيرة التبتية لإنشاء نموذج حيواني كبير ل HFpEF. استخدم هذا النموذج انقباضا يتم التحكم فيه بدقة للشريان الأورطي الهابط للحث على الضغط الزائد المزمن في البطين الأيسر. تم استخدام تخطيط صدى القلب لتقييم التغيرات المورفولوجية والوظيفية في القلب. بعد 12 أسبوعا من إجهاد DAC ، كان الحاجز البطيني ضخما ، ولكن تم تقليل سمك الجدار الخلفي بشكل كبير ، مصحوبا بتمدد البطين الأيسر. ومع ذلك ، تم الحفاظ على جزء طرد الجهد المنخفض للقلوب النموذجية عند >50٪ خلال فترة 12 أسبوعا. علاوة على ذلك ، أظهر نموذج DAC تلفا في القلب ، بما في ذلك التليف والالتهاب وتضخم خلايا عضلة القلب. كانت مستويات علامات قصور القلب مرتفعة بشكل ملحوظ في مجموعة DAC. هذا HFpEF الناجم عن DAC في الخنازير الصغيرة هو أداة قوية للتحقيق في الآليات الجزيئية لهذا المرض وللاختبارات قبل السريرية.

Introduction

يمثل قصور القلب مع الكسر القذفي المحفوظ (HFpEF) أكثر من نصف حالات قصور القلب وأصبح مشكلة صحية عامة في جميع أنحاء العالم¹. أشارت الملاحظات السريرية إلى العديد من السمات الحاسمة ل HFpEF: (1) الخلل الانبساطي البطيني ، مصحوبا بزيادة تصلب الانقباضي ، (2) جزء طرد طبيعي أثناء الراحة مع ضعف أداء التمرين ، و (3) إعادة تشكيل القلب². تشمل الآليات المقترحة عدم التنظيم الهرموني ، والتهاب الأوعية الدموية الدقيقة الجهازية ، واضطرابات التمثيل الغذائي ، والتشوهات في بروتينات المصفوفة الساركومية^{وخارج الخلية 3}. ومع ذلك ، فقد أظهرت الدراسات التجريبية أن قصور القلب مع انخفاض الكسر القذفي (HFrEF) يسبب هذه التعديلات. استكشفت الدراسات السريرية الآثار العلاجية لمثبطات مستقبلات الأنجيوتنسين والأدوية لعلاج HFrEF في HFpEF ^4,5. ومع ذلك ، هناك حاجة إلى نهج علاجية فريدة ل HFpEF. بالمقارنة مع فهم الأعراض السريرية ، فإن التغيرات في علم الأمراض والكيمياء الحيوية والبيولوجيا الجزيئية ل HFpEF لا تزال غير محددة بشكل جيد.

تم تطوير نماذج حيوانية من HFpEF لاستكشاف الآليات وعلامات التشخيص والأساليب العلاجية. يمكن أن تصاب المختبر ، بما في ذلك الخنازير والجرذان والفئران ، ب HFpEF ، وتم اختيار عوامل الخطر المتنوعة ، بما في ذلك ارتفاع ضغط الدم والسكري والشيخوخة ، كعوامل تحريض ^6,7. على سبيل المثال ، أسيتات الديوكسي كورتيكوستيرون وحدها أو مجتمعة مع نظام غذائي عالي الدهون / السكر يحفز HFpEF في الخنازير ^8,9. الحمل الزائد للضغط البطيني هو تقنية أخرى تستخدم لتطوير HFpEF في النماذج الحيوانية الكبيرة والصغيرة¹⁰. بالإضافة إلى ذلك ، تم اعتماد قيم قطع EF محددة لتعريف HFpEF عبر القارات في السنوات الأخيرة ، كما هو موضح في إرشادات الجمعية الأوروبية لأمراض القلب ، ومؤسسة الكلية الأمريكية لأمراض القلب / جمعية القلب^{الأمريكية 11} ، وجمعية الدورة الدموية اليابانية / جمعية قصور القلب اليابانية¹². وبالتالي ، قد تصبح العديد من النماذج التي تم إنشاؤها مسبقا مناسبة لدراسات HFpEF إذا تم اعتماد المعايير السريرية. على سبيل المثال ، ادعى Youselfi et al. أن سلالة الفئران المعدلة وراثيا ، Col4a3-/- ، كانت نموذجا فعالا ل HFpEF. طورت هذه السلالة أعراضا قلبية نموذجية ل HFpEF ، مثل الخلل الانبساطي ، وضعف الميتوكوندريا ، وإعادة تشكيل القلب¹³. استخدمت دراسة سابقة نظاما غذائيا عالي الطاقة للحث على إعادة تشكيل القلب باستخدام نطاق متوسط من EF في المسنة¹⁴ ، والتي تتميز باضطراب التمثيل الغذائي والتليف وانخفاض أكتوميوسين MgATPase في عضلة القلب. يعد انقباض الأبهر المستعرض للفأر (TAC) أحد أكثر النماذج استخداما لتقليد اعتلال عضلة القلب البطيني الناجم عن ارتفاع ضغط الدم. يتطور البطين الأيسر من تضخم متحد المركز مع زيادة EF إلى إعادة تشكيل متوسعة مع انخفاض EF^15,16. تشير الأنماط الظاهرية الانتقالية بين هاتين المرحلتين النموذجيتين إلى أنه يمكن استخدام تقنية انقباض الأبهر لدراسة HFpEF.

تم نشر السمات المرضية والإشارات الخلوية وملامح mRNA لنموذج HFpEF الخنازير^{سابقا 17}. هنا ، يتم تقديم بروتوكول خطوة بخطوة لإنشاء هذا النموذج وطرق تقييم الأنماط الظاهرية لهذا النموذج. الإجراء موضح في الشكل 1. باختصار ، تم وضع الخطة الجراحية بشكل مشترك من قبل الباحث الرئيسي والجراحين وفنيي المختبرات وموظفي رعاية. خضعت الخنازير الصغيرة لفحوصات صحية ، بما في ذلك الاختبارات الكيميائية الحيوية وتخطيط صدى القلب. بعد الجراحة ، تم إجراء إجراءات مضادة للالتهابات ومسكنات. تم استخدام تخطيط صدى القلب والفحص النسيجي والمؤشرات الحيوية لتقييم الأنماط الظاهرية.

Protocol

تمت الموافقة على جميع الدراسات على من قبل اللجنة المؤسسية لرعاية واستخدام التابعة لمعهد مراقبة المختبر في قوانغدونغ (الموافقة رقم. IACUC2017009). تم إجراء جميع التجارب على وفقا لدليل رعاية واستخدام المختبر (الطبعة 8 ، 2011 ، الأكاديميات الوطنية ، الولايات المتحدة الأمريكية). تم إيواء في منشأة معتمدة من AAALAC في معهد مراقبة مختبر قوانغدونغ (ترخيص رقم. SYXK (YUE) 2016-0122 ، الصين). تم استخدام ستة ذكور من الخنازير الصغيرة التبتية (ن = 3 لكل من المجموعة الوهمية ومجموعة DAC ، 25-30 كجم في الوزن) لتطوير نموذج HFpEF.

1. إعداد والأدوات

1. تأقلم مع المنشأة لمدة 14 يوما قبل الجراحة.
2. إجراء الفحوصات الصحية ، بما في ذلك الاختبارات الكيميائية الحيوية وتخطيط صدى القلب ، قبل الجراحة. استبعاد التي تعاني من تشوهات قلبية في البنية (تمدد البطين أو تضخمه) والوظيفة (EF <50٪) وفقا ل T / CALAS85-2020 المختبر - إرشادات للتقييم الصحي للأعضاء الرئيسية ، مثل القلب والكبد والكلى والدماغ لحيوانات المختبر الكبيرة (الجمعية الصينية لعلوم المختبر ، الصين).
3. صيام لأكثر من 12 ساعة قبل التخدير عن طريق عدم التغذية في يوم الجراحة.
4. تحضير غرفة الجراحة والأجهزة (الشكل 2). تحقق من محطة التنفس الصناعي ، وأجهزة المراقبة البيطرية والمرضى ، ونظام الموجات فوق الصوتية البيطرية ، والشافطة ، والأجهزة الجراحية الأخرى. الأوتوكلاف المقص ، الملقط ، المبعدات ، مقابض المشرط ، رأس الشافطة ، الإبر الجراحية ، إلخ (انظر جدول المواد).

2. التخدير والتنبيب الرغامي وقنية الوريد

1. وزن وحساب الأدوية المخدرة. قم بتخدير الخنازير الصغيرة ب 1 ملغم/كغ من حقن الزوليتيل (تيلتامين وزولازيبام للحقن) و0.5 مغ/كغ من حقن زيلازين هيدروكلوريد (انظر جدول المواد).
2. قم بتقييد ووضع الخنازير الصغيرة في وضع الراقد الجانبي الأيمن على طاولة جراحة التشغيل. قم بتشغيل نظام التدفئة للحفاظ على درجة حرارة جسم.
3. إجراء تخطيط صدى القلب (الخطوة 5) وجمع 2 مل من عينات الدم.
4. تنبيب الخنازير الصغيرة بأنبوب رغامي متصل بمحطة تهوية للتخدير البيطري (الشكل 3 أ) (انظر جدول المواد).
5. ابدأ التهوية عند 8 مل / كجم من حجم المد والجزر و 30 نفسا / دقيقة. الحفاظ على مع 1.5 ٪ -2.5 ٪ من isoflurane أثناء العملية الجراحية.
6. إنشاء قنية في الوريد باستخدام قسطرة وريدية محيطية (26 جم) (انظر جدول المواد) من وريد الأذن (عادة وريد الأذن الهامشي ، الشكل 3 ب).
7. قم بتوصيل بجهاز مراقبة بيطري.

3. الإجراء الجراحي

1. حلق المنطقة الصدرية اليسرى. ضع 0.7٪ من اليود و 75٪ كحول لتحضير الجلد بشكل معقم من لوح الكتف إلى الحجاب الحاجز (الشكل 3C).
2. ضع ستائر معقمة على منطقة الجراحة.
3. تطبيق البروبوفول (5 ملغ/كغ) (انظر جدول المواد) عن طريق الحقن الوريدي للحفاظ على التخدير العام.
4. ضع علامة على الشق (~ 15 سم طولا) على طول الفضاء الوربي الرابع قبل شق الجلد باستخدام الكي الكهربائي.
5. افتح الصدر باستخدام مزيج من الكي والتشريح الحاد للعضلات والأنسجة الضامة. استخدم شفاطا لإزالة الدم أثناء العملية.
6. استخدم ضاما ضلعا لنشر الضلوع (الشكل 3 د).
7. حدد موقع جزء الشريان الأورطي الهابط الصدري وحدد موقع الانقباض (الشكل 3E). استخدم غرزتين جراحيتين 3-0 للالتفاف حول المقطع مرتين (الشكل 3F). ضع ثلاث طبقات من الشاش الطبي بين الخيط والشريان الأورطي لتجنب تلف الأنسجة عن طريق الغرز.
8. قم بإعداد وحدات قياس الضغط لتحديد درجة الانقباض (الشكل 3F-H).
   ملاحظة: تشتمل الوحدة على قسطرة تثقب جدار الوعاء الدموي وأنبوب التوصيل ومحول الضغط ومراقبة المريض.
9. شد الخيط الجراحي المحيط بالجزء النازل من الشريان الأورطي تدريجيا لتحقيق درجة الانقباض المطلوبة. اسمح لقراءات الضغط بالاستقرار لمدة 20 دقيقة وشد العقد الجراحية بشكل دائم.
10. استخدم أنبوب تصريف صدري لتفريغ الهواء والسوائل الزائدة في تجويف الصدر.
11. أغلق جدار الصدر في طبقات ، وأعد تقريب الأضلاع والعضلات المقسمة بخيوط قابلة للامتصاص.
12. تحقق من وجود أي نزيف وتأكد من الإرقاء الجيد.
13. ضع زجاجة من البنزيل بنسلين (800000 وحدة) (انظر جدول المواد) على منطقة العملية بعد الجراحة.
14. مراقبة وجود وميض العين وحركة الأطراف للحيوان. افصل جهاز التنفس الصناعي ولكن اترك الأنبوب الرغامي. مراقبة وجود التنفس التلقائي.
15. أعد إلى غرفة السكن الخاصة به واتركه يستيقظ تلقائيا.

4. رعاية ما بعد الجراحة

1. تطبيق البنزيل بنسلين يوميا لمدة 1 أسبوع (20000 وحدة / كغ).
2. تطبيق 1 ملغ / كغ من فلونيكسين ميغلومين (انظر جدول المواد) يوميا لمدة أسبوع واحد.
   ملاحظة: يجب إعطاء المسكنات الأفيونية ومضادات الالتهاب غير الستيروئيدية أثناء الجراحة وبعدها.

5. تخطيط صدى القلب عبر الصدر

1. قم بتخدير ب 1 ملغم / كغم من الزوليتيل.
2. ضع في وحدة ضبط النفس المتنقلة مع غطاء قماش.
   ملاحظة: تحتوي وحدة التقييد المتنقلة (انظر جدول المواد) على أربع فتحات مصممة لتمديد الأطراف الأمامية والأطراف الخلفية للحيوان.
3. حلق الصدر الأيسر للحيوان.
4. ضع الأصابع على يسار وسط الصدر لتشعر بالنبض القمي. ضع الجل بالموجات فوق الصوتية على المنطقة المحيطة.
5. ضع محول الصفيف المرحلي لنظام الموجات فوق الصوتية (3-8 هرتز) في الفضاء الوربي الثالث. حرك محول الطاقة نحو اتجاه أمامي أو خلفي واضبط زاوية الشق.
6. تحديد الأذينين والبطينين والشريان الأورطي. سجل صور المحور الطويل للوضع B والوضع M.
   ملاحظة: تمثل صورة الوضع B المقطع العرضي للبطين الأيسر على مستوى العضلات الحليمية، وتظهر صورة الوضع M حركة البطين الأيسر بمرور الوقت.
7. أدر رأس محول الطاقة 90 درجة في اتجاه عقارب الساعة للحصول على عرض المحور القصير شبه القصي. تحديد البطين الأيسر والبطين الأيمن والعضلة الحليمية. سجل صور الوضع B والوضع M.
8. استخدم محطة العمل التي توفرها الشركة المصنعة لنظام الموجات فوق الصوتية لتقييم بنية القلب ووظيفته.

النتائج

تخطيط صدى القلب
تم تقييم بنية القلب ووظيفته في الأسابيع 0 و 2 و 4 و 6 و 8 و 10 و 12. يتم عرض تسجيلات الوضع B والوضع M لمنظر المحور القصير parasternal في الشكل 4A. تضمن قياس تخطيط صدى القلب سمك الحاجز البطيني (VST) وسمك الجدار الخلفي (PWT) والبعد الداخلي للبطين الأيسر (LVID). زاد VST في نها...

Discussion

استخدمت هذه الدراسة تقنيات DAC لتطوير نموذج HFpEF للخنازير الصغيرة التبتية. يتم تقديم بروتوكول تحضير والأدوات خطوة بخطوة هنا ، بما في ذلك التخدير والتنبيب الرغامي وقنية الوريد والإجراءات الجراحية ورعاية ما بعد الجراحة. كما يتم تقديم تقنيات التسجيل لصور القلب ب و الوضع M للقلب. بعد DAC ، خضع الق?...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Absorbable surgical suture	Putong Jinhua Medical Co. Ltd, China	4-0
Aesthesia ventilator station	Shenzhen Mindray Bio-Medical Electronics Co., Ltd, China	WATO EX-35vet
Aspirator	Shanghai Baojia Medical Apparatus Co., Ltd, China	YX930D
Benzylpenicillin	Sichuan Pharmaceutical. INC, China	H5021738
Disposal endotracheal tube with cuff	Shenzhen Verybio Co., Ltd, China	20 cm, ID 0.9
Disposal transducer	Guangdong Baihe Medical Technology Co., Ltd, China
Dissection blade	Shanghai Medical Instruments (Group) Co., Ltd, China
Electrocautery	Shanghai Hutong Medical Instruments (Group) Co., Ltd, China	GD350-B
Enzyme-linked immunosorbent assay ELISA kit	Cusabio Biotech Co., Ltd, China	CSB-E08594r
Eosin	Sigma-Aldrich Corp.	E4009
Flunixin meglumine	Shanghai Tongren Pharmaceutical Co., Ltd., China	Shouyaozi(2012)-090242103
Forceps	Shanghai Medical Instruments (Group) Co., Ltd.,China
Hematoxylin	Sigma-Aldrich Corp.	H3136
Isoflurane	RWD Life Science Co., Ltd, China	Veteasy for animals
Laryngoscope	Taixing Simeite Medical Apparatus and Instruments Limited Co., Ltd, China	For adults
LED surgical lights	Mingtai Medical Group, China	ZF700
Microplate reader	Thermo Fisher Scientific, USA	Multiskan FC
Microscope	Leica, Germany	DM2500
Mobile restraint unit	Customized	N/A	A mobile restraint unit, made by metal frame and wheels, with a canvas cover
Oxygen	Local suppliers, Guangzhou, China
Paraformaldehyde	Sigma-Aldrich Corp.	V900894
Patient monitor	Shenzhen Mindray Bio-Medical Electronics Company, China	Beneview T5
Peripheral Intravenous (IV) Catheter	Shenzhen Yima Pet Industry Development Co., Ltd., China	26G X 16 mm
Propofol	Guangdong Jiabo Phamaceutical Co., Ltd.	H20051842
Rib retractor	Shanghai Medical Instruments (Group) Co., Ltd.,China
Ruler	Deli Manufacturing Company, China
Scalpel handles	Shanghai Medical Instruments (Group) Co., Ltd.,China
Scissors (g)	Shanghai Medical Instruments (Group) Co., Ltd.,China
Suture	Medtronic-Coviden Corp.	3-0, 4-0
Ultrasonic gel	Tianjin Xiyuansi Production Institute, China	TM-100
Veterinary monitor	Shenzhen Mindray Bio-Medical Electronics Company, China	ePM12M Vet
Veterinary ultrasound system	Esatoe, Italy	MyLab30	Equiped with phased array transducer (3-8 Hz)
Xylazine hydrochloride injection	Shenda Animal Phamarceutical Co., Ltd., China	Shouyaozi(2016)-07003
Zoletil injection	Virbac, France	Zoletil 50	Tiletamine and zolazepam for injection