Modelo Cirúrgico de Insuficiência Cardíaca com Fração de Ejeção Preservada em Miniporcos Tibetanos

Resumo

O presente protocolo descreve um procedimento passo a passo para estabelecer um modelo miniporco de insuficiência cardíaca com fração de ejeção preservada usando constrição da aorta descendente. Os métodos para avaliação da morfologia, histologia e função cardíaca desse modelo de doença também são apresentados.

Resumo

Mais da metade dos casos de insuficiência cardíaca (IC) são classificados como insuficiência cardíaca com fração de ejeção preservada (ICFEP) em todo o mundo. Modelos animais de grande porte são limitados para investigar os mecanismos fundamentais da ICFEP e identificar potenciais alvos terapêuticos. Este trabalho fornece uma descrição detalhada do procedimento cirúrgico de constrição da aorta descendente (DAC) em miniporcos tibetanos para estabelecer um modelo animal de grande porte de ICFEP. Esse modelo utilizou uma constrição precisamente controlada da aorta descendente para induzir sobrecarga pressórica crônica no ventrículo esquerdo. O ecocardiograma foi utilizado para avaliar as alterações morfológicas e funcionais do coração. Após 12 semanas de estresse na DAC, o septo ventricular estava hipertrófico, mas a espessura da parede posterior estava significativamente reduzida, acompanhada de dilatação do ventrículo esquerdo. Entretanto, a fração de ejeção do VE dos corações modelo foi mantida em >50% durante o período de 12 semanas. Além disso, o modelo DAC exibiu dano cardíaco, incluindo fibrose, inflamação e hipertrofia de cardiomiócitos. Os marcadores de insuficiência cardíaca estavam significativamente elevados no grupo DAC. Esta ICFEP induzida por DAC em miniporcos é uma ferramenta poderosa para investigar mecanismos moleculares desta doença e para testes pré-clínicos.

Introdução

A insuficiência cardíaca com fração de ejeção preservada (ICFEP) é responsável por mais da metade dos casos de insuficiência cardíaca e tornou-se um problema de saúde pública mundial¹. Observações clínicas indicaram várias características críticas da ICFEP: (1) disfunção diastólica ventricular, acompanhada de aumento da rigidez sistólica, (2) fração de ejeção normal em repouso com prejuízo no desempenho do exercício e (3) remodelação cardíaca². Os mecanismos propostos incluem desregulação hormonal, inflamação microvascular sistêmica, distúrbios metabólicos e anormalidades nas proteínas do sarcomérico e da matriz extracelular³. Entretanto, estudos experimentais têm demonstrado que a insuficiência cardíaca com fração de ejeção reduzida (ICDS) causa essas alterações. Estudos clínicos têm explorado os efeitos terapêuticos dos inibidores dos receptores da angiotensina e de fármacos no tratamento da ICDS na ICFEP ^4,5. No entanto, abordagens terapêuticas únicas para ICFEP são necessárias. Em comparação com a compreensão dos sintomas clínicos, as alterações na patologia, bioquímica e biologia molecular da ICFEP permanecem pouco definidas.

Modelos animais de ICFEP têm sido desenvolvidos para explorar mecanismos, marcadores diagnósticos e abordagens terapêuticas. Animais de laboratório, incluindo porcos, cães, ratos e camundongos, podem desenvolver ICFEP, e diversos fatores de risco, incluindo hipertensão, diabetes mellitus e envelhecimento, foram selecionados como fatores de indução ^6,7. Por exemplo, acetato de deoxicorticosterona, isolado ou combinado com dieta rica em gordura/açúcar, induz ICFEP em suínos ^8,9. A sobrecarga de pressão ventricular é outra técnica utilizada para o desenvolvimento da ICFEP em modelos de animais de grande e pequeno porte¹⁰. Além disso, valores de corte específicos de FE para definir ICFEP têm sido adotados em todos os continentes nos últimos anos, como visto nas diretrizes da Sociedade Europeia de Cardiologia, American College of Cardiology Foundation/American Heart Association¹¹, Japanese Circulation Society/Japanese Heart Failure Society¹². Assim, muitos modelos previamente estabelecidos podem se tornar apropriados para estudos de ICFEP se os critérios clínicos forem adotados. Por exemplo, Youselfi et al., afirmaram que uma linhagem de camundongos geneticamente modificada, Col4a3-/-, era um modelo eficaz de HFpEF. Essa cepa desenvolveu sintomas cardíacos típicos da ICFEP, como disfunção diastólica, disfunção mitocondrial e remodelamento cardíaco¹³. Um estudo anterior utilizou uma dieta de alta energia para induzir remodelação cardíaca com uma faixa média de FE em macacos idosos¹⁴, caracterizada por distúrbio metabólico, fibrose e redução da actomiosina MgATPase no miocárdio. A constrição aórtica transversa (TAC) de camundongos é um dos modelos mais utilizados para mimetizar a cardiomiopatia ventricular induzida por hipertensão. O ventrículo esquerdo evolui de hipertrofia concêntrica com aumento da FE para remodelamento dilatado com redução da FE^15,16. Os fenótipos transicionais entre esses dois estágios típicos sugerem que a técnica de constrição aórtica pode ser usada para estudar a ICFEP.

As características patológicas, a sinalização celular e os perfis de RNAm de um modelo suíno de ICFEP foram previamente publicados¹⁷. Aqui, um protocolo passo-a-passo é apresentado para estabelecer esse modelo e as abordagens para avaliar os fenótipos desse modelo. O procedimento está ilustrado na Figura 1. Resumidamente, o plano cirúrgico foi feito em conjunto pelo pesquisador principal, cirurgiões, técnicos de laboratório e equipe de cuidados com os animais. Os miniporcos foram submetidos a exames de saúde, incluindo exames bioquímicos e ecocardiografia. Após a cirurgia, foram realizados procedimentos anti-inflamatórios e analgésicos. Ecocardiografia, exame histológico e biomarcadores foram utilizados para avaliar os fenótipos.

Protocolo

Todos os estudos em animais foram aprovados pelo Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais do Instituto de Monitoramento de Animais de Laboratório de Guangdong (aprovação nº. IACUC2017009). Todos os experimentos com animais foram realizados seguindo o Guide for the Care and Use of Laboratory Animals (8th Ed., 2011, The National Academies, EUA). Os animais foram alojados em uma instalação credenciada pela AAALAC no Instituto de Monitoramento de Animais de Laboratório de Guangdong (licença nº. SYXK (YUE) 2016-0122, China). Seis miniporcos tibetanos machos (n = 3 cada para o grupo sham e grupo DAC, 25-30 kg de peso) foram usados para desenvolver o modelo de HFpEF.

1. Preparação de animais e instrumentos

1. Aclimatar os animais ao local por 14 dias antes da cirurgia.
2. Realizar exames de saúde, incluindo exames bioquímicos e ecocardiografia, antes da cirurgia. Excluir os animais com anormalidades cardíacas na estrutura (dilatação ou hipertrofia ventricular) e função (FE <50%) de acordo com o T/CALAS85-2020 Animais de laboratório - Diretrizes para a avaliação da saúde dos principais órgãos, como coração, fígado, rim e cérebro de grandes animais de laboratório (Associação Chinesa de Ciências Animais de Laboratório, China).
3. Jejuar os animais por mais de 12 h antes da anestesia, não se alimentando no dia da cirurgia.
4. Preparar a sala cirúrgica e os dispositivos (Figura 2). Verifique a estação de ventilação de anestesia, monitores veterinários e de pacientes, sistema de ultrassom veterinário, aspirador e outros dispositivos cirúrgicos. Autoclave a tesoura, pinça, afastadores, cabos de bisturi, cabeça do aspirador, agulhas cirúrgicas, etc. (ver Tabela de Materiais).

2. Sedação, intubação traqueal e canulação venosa

1. Pesar os animais e calcular os fármacos anestésicos. Sedar os miniporcos com 1 mg/kg de injeção de zoletil (tiletamina e zolazepam injetáveis) e 0,5 mg/kg de injeção de cloridrato de xilazina (ver Tabela de Materiais).
2. Conter e colocar os miniporcos na posição lateral direita sobre a mesa cirúrgica. Ligue o sistema de aquecimento para manter a temperatura corporal dos animais.
3. Realizar o ecocardiograma (passo 5) e coletar 2 mL de amostras de sangue.
4. Intubar os miniporcos com um tubo endotraqueal conectado a uma estação de ventilação de anestesia veterinária (Figura 3A) (ver Tabela de Materiais).
5. Iniciar a ventilação a 8 mL/kg de volume corrente e 30 ciclos/min. Manter os animais com 1,5%-2,5% de isoflurano durante o procedimento cirúrgico.
6. Estabelecer canulação intravenosa usando um cateter intravenoso periférico (26 G) (ver Tabela de Materiais) a partir de uma veia da orelha (geralmente a veia marginal da orelha, Figura 3B).
7. Conecte o animal a um monitor veterinário.

3. Procedimento cirúrgico

1. Faça a barba na região torácica esquerda. Aplicar 0,7% de iodo e álcool a 75% para preparar assepticamente a pele da escápula ao diafragma (Figura 3C).
2. Coloque campos estéreis sobre a área cirúrgica.
3. Administrar propofol (5 mg/kg) (ver Tabela de Materiais) por injeção intravenosa para manter a anestesia geral.
4. Marque a incisão (~15 cm de comprimento) ao longo do 4º espaço intercostal antes da incisão da pele com eletrocautério.
5. Abra o tórax usando uma combinação de cautério e dissecção romba do músculo e do tecido conjuntivo. Use um aspirador para remover o sangue durante a operação.
6. Use um afastador de costelas para espalhar as costelas (Figura 3D).
7. Localizar o segmento da aorta descendente torácica e determinar o local da constrição (Figura 3E). Utilizar duas suturas cirúrgicas 3-0 para contornar o segmento duas vezes (Figura 3F). Coloque três camadas de gaze médica entre a sutura e a aorta para evitar danos teciduais por suturas.
8. Configure unidades de medida de pressão para determinar o grau de constrição (Figura 3F-H).
   NOTA: A unidade inclui um cateter que punciona a parede do vaso, tubo de conexão, transdutor de pressão e um monitor do paciente.
9. Apertar a sutura cirúrgica ao redor do segmento da aorta descendente gradualmente para atingir o grau de constrição desejado. Deixe as leituras de pressão estabilizarem por 20 min e aperte permanentemente os nós cirúrgicos.
10. Use um dreno torácico de drenagem para evacuar o ar e o excesso de líquidos na cavidade torácica.
11. Fechar a parede torácica em planos, reaproximar as costelas e dividir os músculos com pontos absorvíveis.
12. Verifique se há algum sangramento e garanta uma boa hemostasia.
13. Aplicar um frasco de benzilpenicilina (800.000 unidades) (ver Tabela de Materiais) na área de operação pós-cirurgia.
14. Monitorar a presença de piscar os olhos e o movimento dos membros do animal. Desconecte o ventilador, mas deixe o tubo endotraqueal. Monitorar a presença de respiração espontânea.
15. Devolva o animal ao seu alojamento e deixe-o acordar automaticamente.

4. Cuidados pós-cirúrgicos

1. Aplicar benzilpenicilina diariamente por 1 semana (20.000 U/kg).
2. Aplicar 1 mg/kg de flunixina meglumina (ver Tabela de Materiais) diariamente durante 1 semana.
   NOTA: Analgésicos opioides e AINEs devem ser administrados no intra e pós-operatório.

5. Ecocardiografia transtorácica

1. Sedar o animal com 1 mg/kg de zoletil.
2. Coloque o animal em uma unidade de retenção móvel com uma tampa de lona.
   NOTA: A unidade de retenção móvel (ver Tabela de Materiais) tem quatro aberturas projetadas para estender os membros anteriores e posteriores do animal.
3. Faça a barba no peito esquerdo do animal.
4. Coloque os dedos no centro esquerdo do tórax para sentir o pulso apical. Aplique o gel ultra-sônico na área circundante.
5. Coloque o transdutor phased array do sistema de ultrassom (3-8 Hz) no terceiro espaço intercostal. Mova o transdutor para uma direção anterior ou posterior e ajuste o ângulo da incisura.
6. Identificar os átrios, ventrículos e aorta. Grave as imagens paraesternais de eixo longo dos modos B e M.
   NOTA: A imagem modo-B representa a secção transversal do ventrículo esquerdo ao nível do músculo papilar, e a imagem modo-M mostra o movimento do ventrículo esquerdo ao longo do tempo.
7. Gire a cabeça do transdutor 90° no sentido horário para obter a visão paraesternal de eixo curto. Identificar o ventrículo esquerdo, o ventrículo direito e o músculo papilar. Grave as imagens dos modos B e M.
8. Use a estação de trabalho fornecida pelo fabricante do sistema de ultrassom para avaliar a estrutura e a função cardíaca.

Resultados

Ecocardiografia
A estrutura e a função cardíaca foram avaliadas nas semanas 0, 2, 4, 6, 8, 10 e 12. Os registros em modo B e modo M da visão paraesternal de eixo curto são exibidos na Figura 4A. A medida ecocardiográfica incluiu espessura do septo ventricular (VST), espessura da parede posterior (PWT) e dimensão interna do ventrículo esquerdo (LVID). O TEV no final da diástole aumentou nos corações DAC, enquanto o PWT no final da diástole aumentou e depois dim...

Discussão

Este estudo utilizou técnicas de DAC para desenvolver um modelo de HFpEF para miniporcos tibetanos. Um protocolo passo a passo de preparo de animais e instrumentos é apresentado aqui, incluindo sedação, intubação traqueal, canulação venosa, procedimento cirúrgico e cuidados pós-cirúrgicos. As técnicas de registro das imagens ecocardiográficas do coração modo B e modo M também são apresentadas. Após a DAC, o coração sofreu hipertrofia ventricular esquerda durante as semanas 4 e 6 e dilatação após a ...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Absorbable surgical suture	Putong Jinhua Medical Co. Ltd, China	4-0
Aesthesia ventilator station	Shenzhen Mindray Bio-Medical Electronics Co., Ltd, China	WATO EX-35vet
Aspirator	Shanghai Baojia Medical Apparatus Co., Ltd, China	YX930D
Benzylpenicillin	Sichuan Pharmaceutical. INC, China	H5021738
Disposal endotracheal tube with cuff	Shenzhen Verybio Co., Ltd, China	20 cm, ID 0.9
Disposal transducer	Guangdong Baihe Medical Technology Co., Ltd, China
Dissection blade	Shanghai Medical Instruments (Group) Co., Ltd, China
Electrocautery	Shanghai Hutong Medical Instruments (Group) Co., Ltd, China	GD350-B
Enzyme-linked immunosorbent assay ELISA kit	Cusabio Biotech Co., Ltd, China	CSB-E08594r
Eosin	Sigma-Aldrich Corp.	E4009
Flunixin meglumine	Shanghai Tongren Pharmaceutical Co., Ltd., China	Shouyaozi(2012)-090242103
Forceps	Shanghai Medical Instruments (Group) Co., Ltd.,China
Hematoxylin	Sigma-Aldrich Corp.	H3136
Isoflurane	RWD Life Science Co., Ltd, China	Veteasy for animals
Laryngoscope	Taixing Simeite Medical Apparatus and Instruments Limited Co., Ltd, China	For adults
LED surgical lights	Mingtai Medical Group, China	ZF700
Microplate reader	Thermo Fisher Scientific, USA	Multiskan FC
Microscope	Leica, Germany	DM2500
Mobile restraint unit	Customized	N/A	A mobile restraint unit, made by metal frame and wheels, with a canvas cover
Oxygen	Local suppliers, Guangzhou, China
Paraformaldehyde	Sigma-Aldrich Corp.	V900894
Patient monitor	Shenzhen Mindray Bio-Medical Electronics Company, China	Beneview T5
Peripheral Intravenous (IV) Catheter	Shenzhen Yima Pet Industry Development Co., Ltd., China	26G X 16 mm
Propofol	Guangdong Jiabo Phamaceutical Co., Ltd.	H20051842
Rib retractor	Shanghai Medical Instruments (Group) Co., Ltd.,China
Ruler	Deli Manufacturing Company, China
Scalpel handles	Shanghai Medical Instruments (Group) Co., Ltd.,China
Scissors (g)	Shanghai Medical Instruments (Group) Co., Ltd.,China
Suture	Medtronic-Coviden Corp.	3-0, 4-0
Ultrasonic gel	Tianjin Xiyuansi Production Institute, China	TM-100
Veterinary monitor	Shenzhen Mindray Bio-Medical Electronics Company, China	ePM12M Vet
Veterinary ultrasound system	Esatoe, Italy	MyLab30	Equiped with phased array transducer (3-8 Hz)
Xylazine hydrochloride injection	Shenda Animal Phamarceutical Co., Ltd., China	Shouyaozi(2016)-07003
Zoletil injection	Virbac, France	Zoletil 50	Tiletamine and zolazepam for injection