JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • النتائج
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

تم العثور على العديد من التسلسلات الجديدة الشبيهة بالفيروسات في البعوض بسبب الاستخدام المكثف لتقنيات التسلسل. نحن نقدم إجراء فعالا لعزل الفيروسات وتضخيمها باستخدام الفقاريات وخطوط خلايا البعوض ، والتي قد تكون بمثابة أساس للدراسات المستقبلية حول الفيروسات المرتبطة بالبعوض ، بما في ذلك الفيروسات التي ينقلها البعوض والفيروسات الخاصة بالبعوض.

Abstract

مع التطبيق الواسع لتقنيات التسلسل ، تم اكتشاف العديد من التسلسلات الجديدة الشبيهة بالفيروسات في المفصليات ، بما في ذلك البعوض. الفئتان الرئيسيتان لهذه الفيروسات الجديدة المرتبطة بالبعوض هما "الفيروسات التي ينقلها البعوض (MBVs)" و "الفيروسات الخاصة بالبعوض (MSVs)". قد تكون هذه الفيروسات الجديدة مسببة للأمراض لكل من الفقاريات والبعوض ، أو يمكن أن تكون تكافلية مع البعوض. فيروسات الكيانات ضرورية لتأكيد الخصائص البيولوجية لهذه الفيروسات. وبالتالي ، تم وصف بروتوكول مفصل هنا لعزل الفيروس وتضخيمه من البعوض الذي تم جمعه ميدانيا. أولا ، تم تحضير عينات البعوض كطاف لمتجانسات البعوض. بعد الطرد المركزي مرتين ، تم بعد ذلك تلقيح المواد الطافية إما في خط خلايا البعوض C6 / 36 أو خط خلايا الفقاريات BHK-21 لتضخيم الفيروس. بعد 7 أيام ، تم جمع المواد الطافية كمواد طافية P1 وتخزينها عند -80 درجة مئوية. بعد ذلك ، تم تمرير طافات P1 مرتين أخريين في خلايا C6 / 36 أو BHK-21 أثناء فحص حالة الخلية يوميا. عندما تم اكتشاف التأثير الممرض الخلوي (CPE) على الخلايا ، تم جمع هذه المواد الطافية واستخدامها لتحديد الفيروسات. يعمل هذا البروتوكول كأساس للبحوث المستقبلية حول الفيروسات المرتبطة بالبعوض ، بما في ذلك MBVs و MSVs.

Introduction

البعوض هي مجموعة من ناقلات المفصليات المسببة للأمراض الهامة. هناك ما يقرب من 3500 نوع من البعوض في عائلة Culicidae1،2. أدى تطوير تقنيات التسلسل عالية الإنتاجية إلى اكتشاف العديد من التسلسلات الجديدة الشبيهة بالفيروسات في البعوض من أجزاء مختلفة من العالم3. بشكل عام ، يمكن تصنيف هذه الفيروسات المرتبطة بالبعوض إلى مجموعتين رئيسيتين: MBVs و MSVs.

MBVs هي مجموعة من الفيروسات المتنوعة التي تعد عوامل مسببة للعديد من الأمراض البشرية أو الحيوانية ، مثل فيروس الحمى الصفراء (YFV) وفيروس حمى الضنك (DENV) وفيروس التهاب الدماغ الياباني (JEV) وفيروس غرب النيل (WNV) وفيروس حمى الوادي المتصدع (RVFV)4. لقد هددت الصحة العامة بشكل خطير من خلال التسبب في مراضة ووفيات شديدة لكل من البشر والحيوانات في جميع أنحاء العالم. تحافظ MBVs بشكل طبيعي على دورة حياة بين مضيفين متنوعين من خلال الانتقال من بعوضة مصابة إلى مضيف ساذج ، وكذلك من مضيف مصاب بالفيروس وإلى بعوضة تتغذى5. لذلك ، يمكن لهذه الفيروسات أن تصيب كلا من خطوط خلايا البعوض وخطوط خلايا الفقاريات في المختبر1.

MSVs ، والتي تشمل فيروس Yichang (YCN) ، وفيروس Culex flavivirus (CxFV) ، وفيروس Chaoyang (CHAOV) ، هي مجموعة فرعية من الفيروسات الخاصة بالحشرات1،6،7. في السنوات الأخيرة ، كان هناك ارتفاع في اكتشاف MSVs الجديدة ، وقد وجد أن بعض هذه MSVs لها تأثير على انتقال MBVs. على سبيل المثال ، يمكن ل CxFV ، الذي يمكن أن يكون عدوى مستمرة في Culex pipiens، قمع تكرار WNV في مرحلة مبكرة8. وقد وجد أن فيروسا فلافيا آخر خاصا بالحشرات، وهو فيروس عامل الالتحام الخلوي (CFAV)، يمنع انتشار فيروس حمى الضنك وفيروس زيكا في بعوضة الزاعجة المصرية 9. وبالتالي ، فإن هذا البروتوكول هو نهج مفيد لعزل الفيروسات المرتبطة بالبعوض ويمكن أن يساعد في مزيد من البحوث في توزيع مسببات الأمراض المتعلقة بالبعوض ومكافحة الأمراض التي ينقلها البعوض.

Protocol

1. أخذ عينات البعوض والفرز

  1. اصطياد البعوض البالغ من خلال الفخاخ الخفيفة MXA-02 أو مصائد بعوض ثاني أكسيد الكربون في الحقل.
  2. قتل البعوض الذي تم جمعه عن طريق غمس النيتروجين السائل10،11. نقلهم إلى المختبر بواسطة النظام اللوجستي لسلسلة التبريد12.
    ملاحظة: تم استخدام الثلج الجاف بشكل أساسي في النظام اللوجستي لسلسلة التبريد.
  3. (اختياري) إذا كانت مواقع العينات بالقرب من المختبر ، أرسل البعوض الحي مباشرة في الفخاخ الشبكية إلى المختبر والقتل الرحيم عن طريق التجميد عند ≤-20 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة4.
  4. قم بإجراء تحديد مورفولوجي للبعوض الذي تم جمعه من خلال كتاب الأدوات13 لتصنيف وتحديد البعوض.
    ملاحظة: إذا لزم الأمر ، يمكن استخدام الترميز الشريطي للحمض النووي لتصنيف وتحديد البعوض14،15.
  5. بناء على تواريخ ومواقع أخذ العينات ، قم بتعيينها في تجمعات مختلفة ، ثم قم بتخزينها في أنابيب 2-5 مل.
  6. ارسم جدولا لتسجيل كل أنبوب مع أنواع البعوض والرقم ورمز أخذ العينات والتاريخ والمواقع.
  7. اطبع الملصقات مع رموز أخذ العينات وأرفقها بالأنابيب.
  8. احتفظ بالأنابيب مع عينات البعوض عند -80 درجة مئوية حتى إجراء مزيد من التحليل.

2. طحن البعوض

  1. ضع 20-50 بعوضة في كل أنبوب معقم سعة 2 مل مع خرز خزفي 3 مم مع 1.5 مل من وسط معهد روزويل بارك التذكاري (RPMI) يحتوي على 2٪ محلول بنسلين-ستربتومايسين-أمفوتريسين ب.
    ملاحظة: احتفظ بالأنابيب على صينية ثلج أو لطيفة.
  2. تجانس البعوض باستخدام خالط الأنسجة بدرجة حرارة منخفضة عن طريق الطحن لمدة 30 ثانية عند 70 هرتز عند 4 درجات مئوية لمدة ثلاث دورات16.
  3. أجهزة الطرد المركزي في الخلائط عند 15000 × جم لمدة 30 دقيقة عند 4 درجات مئوية ونقل المواد الطافية إلى أنابيب جديدة.
  4. أجهزة الطرد المركزي مرة أخرى عند 15000 × جم لمدة 10 دقائق عند 4 درجات مئوية لإزالة حطام البعوض12,17.
    ملاحظة: إذا لزم الأمر ، يمكن تصفية المواد الطافية باستخدام مرشحات 0.22 ميكرومتر.
  5. قم بقسمة المواد الطافية (P0) في أنابيب تخزين بغطاء لولبي سعة 2 مل (200 ميكرولتر لكل أنبوب) وتخزينها في -80 درجة مئوية.

3. إعداد الخلايا ووسط صيانة زراعة الخلايا

ملاحظة: تم استخدام خط خلية البعوض C6/36 (Aedes albopictus RNAi-ناقص) وخط خلايا الفقاريات BHK-21 (كلية الهامستر الصغيرة) لتضخيم الفيروس وعزله.

  1. تلقيح 1 × 106 خلايا C6 / 36 في دورق 75 سم 2 مع 10 مل من وسط RPMI المكمل بمصل بقري جنيني 10٪ (FBS) و 1٪ بنسلين / ستربتومايسين (P / S) عند 28 درجة مئوية في حاضنة مرطبة بنسبة 5٪ CO2.
  2. تلقيح 1 × 106 خلايا BHK-21 في قارورة 75 سم 2 مع 10 مل من وسط النسر المعدل من Dulbecco (DMEM) المكمل ب 10٪ FBS و 1٪ P / S عند 37 درجة مئوية في حاضنة مرطبة بنسبة 5٪ CO2.
    ملاحظة: تم تمرير الزنازين مرتين أو ثلاث مرات في الأسبوع17,18.
  3. زرع الخلايا المستزرعة في قارورة 75 سم2 (خلايا C6 / 36 أو BHK-21) في ألواح 24 بئر (C6 / 36 لكل بئر: 1.4 × 105 ؛ BHK-21 لكل بئر: 0.8 × 105).
  4. ضع الألواح المكونة من 24 بئرا على حرارة 28 درجة مئوية أو 37 درجة مئوية طوال الليل.
  5. راقب الخلايا الموجودة تحت المجهر وتأكد مما إذا كان التقاء الخلايا في كل بئر هو 80٪ -90٪.
  6. تحضير وسط صيانة زراعة الخلايا (500 مل).
    ملاحظة: بالنسبة ل C6/36 ، كان الوسط عبارة عن متوسط RPMI مكمل بمحلول FBS 2٪ و 2٪ محلول البنسلين - الستربتومايسين - الأمفوتريسين B. بالنسبة ل BHK-21 ، كان الوسط عبارة عن وسط DMEM مكمل بمحلول FBS 2٪ و 2٪ محلول البنسلين - الستربتومايسين - الأمفوتريسين B.

4. عزل الفيروسات

ملاحظة: نفذت جميع الخطوات في مختبر السلامة الأحيائية من المستوى 2 (BSL-2). تم تحديد متطلبات مستوى الأمان لمختبر السلامة الأحيائية من خلال تقييم مخاطر السلامة الأحيائية بناء على لوائح البلدان والمناطق المختلفة. يجب تنفيذ العملية في خزانة السلامة البيولوجية.

  1. قم بإزالة وسط زراعة الخلايا من ألواح 24 بئرا وأضف 100 ميكرولتر من وسط صيانة زراعة الخلايا و 100 ميكرولتر من طاف تجانس البعوض (P0) إلى كل بئر.
  2. احتضن الألواح على حرارة 28 درجة مئوية أو 37 درجة مئوية لمدة 60 دقيقة ورجها برفق كل 15 دقيقة لمنع جفاف الخلايا.
  3. قم بإزالة المادة الطافية وشطف كل بئر برفق باستخدام 600 ميكرولتر من وسط صيانة زراعة الخلايا لإزالة الحطام تماما.
  4. أضف 800 ميكرولتر من وسط صيانة زراعة الخلايا إلى كل بئر واحتفظ بالألواح في حاضنة مرطبة بنسبة 5٪ CO2 عند 28 درجة مئوية أو 37 درجة مئوية لمدة 7 أيام.
  5. مراقبة حالة الخلية لكل بئر تحت المجهر يوميا15.
  6. جمع المواد الطافية للخلايا (الطافات P1)في اليوم السابع وتخزين المواد الطافية في -80 درجة مئوية.
  7. كرر الخطوات 4.1-4.6 2x للحصول على طاف P2 و P3.
    ملاحظة: في الخطوة 4.3 ، كان شطف كل بئر برفق باستخدام 600 ميكرولتر من وسط صيانة زراعة الخلايا اختياريا ل P2 و P3.
  8. اعتمادا على أي بئر يظهر التأثير الممرض للخلايا (CPE) - تموت الخلايا ، pyknosis ، وتنفصل عن السطح ؛ الانصهار مع الخلايا المجاورة لتشكيل syncytia. أو ظهور أجسام التضمين النووية أو السيتوبلازمية - أضف 300-400 ميكرولتر من طافية بئر CPE هذا في كل بئر من الألواح الجديدة المكونة من 6 آبار والتي تحتوي على خلايا (كان التقاء الخلايا 80٪ -90٪) لتضخيم الفيروسات بشكل كبير.
  9. اجمع المواد الطافية وقسمها في أنابيب تخزين بغطاء لولبي سعة 2 مل (500 ميكرولتر لكل أنبوب). قم بتخزينها في درجة حرارة -80 درجة مئوية.
    ملاحظة: بعد ثلاثة أجيال من المرور المتتالي في الخلايا ، تم التخلص من العينات التي لم تحفز CPE. إذا لزم الأمر ، يمكن زيادة أجيال المرور المتتالية في الخلايا.

5. الكشف عن التسلسلات الفيروسية بواسطة RT-PCR

  1. استخراج إجمالي الحمض النووي الريبي من 200 ميكرولتر من المادة الطافية الفيروسية باستخدام مجموعة صغيرة من الحمض النووي الريبيالفيروسي 16.
    ملاحظة: هنا ، تم استخدام نظام استخراج الحمض النووي الآلي لاستخراج إجمالي الحمض النووي الريبي باتباع تعليمات الشركة المصنعة للأداة.
  2. قم بتحويل الحمض النووي الريبي إلى cDNA باتباع تعليمات مجموعة RT-PCR باستخدام أداة تفاعل البوليميراز المتسلسل.
    1. أضف 15 ميكرولتر من الحمض النووي الريبي الممزوج ب 1 ميكرولتر من البادئات العشوائية في أنبوب PCR. ضع الأنبوب على حرارة 70 درجة مئوية لمدة 5 دقائق ثم ضعه على الثلج لمدة 5 دقائق.
    2. أضف 5 ميكرولتر من 5x buffer و 25 ميكرولتر من الخليط (10 mM dNTP ، 40 U / μL مثبط RNase ، و 200 U / μL M-MLV) في الأنبوب وضع الأنبوب عند 42 درجة مئوية لمدة 60 دقيقة و 95 درجة مئوية لمدة 10 دقائق.
    3. قم بتخزين الأنبوب في درجة حرارة -20 درجة مئوية.
  3. استخدم مجموعة PCR والبادئات العامة (الجدول 1) للكشف عن الفيروسات بواسطة تفاعل البوليميراز المتسلسل.
    1. بالنسبة للفيروسات المنقولة بالمفصليات ، قم بإعداد نظام تفاعل تفاعل تفاعل البوليميراز المتسلسل (إجمالي 30 ميكرولتر) بالمكونات التالية: 3 ميكرولتر من 10x Taq buffer ، 3 ميكرولتر من dNTP (1 mM) ، 1 ميكرولتر من التمهيدي الأمامي (10 ميكرومتر) ، 1 ميكرولتر من التمهيدي العكسي (10 ميكرومتر) ، 0.3 ميكرولتر من Taq (10 U / μL) ، 19.7 ميكرولتر من ddH 2 O ، و2ميكرولتر من cDNA.
    2. للكشف عن الفيروسات المصفرة ، قم بإعداد عملية التفاعل على النحو التالي: المرحلة 1: 35 دورة من 94 درجة مئوية لمدة 30 ثانية ، و 52 درجة مئوية لمدة 30 ثانية ، و 72 درجة مئوية لمدة 30 ثانية ؛ المرحلة 2: 72 درجة مئوية لمدة 10 دقائق.
    3. للكشف عن فيروسات ألفا ، قم بإعداد عملية التفاعل على النحو التالي: المرحلة 1: 35 دورة من 94 درجة مئوية لمدة 30 ثانية ، و 50 درجة مئوية لمدة 30 ثانية ، و 72 درجة مئوية لمدة 30 ثانية ؛ المرحلة 2: 72 درجة مئوية لمدة 10 دقائق.
    4. للكشف عن فيروسات bunyavirus ، قم بإعداد عملية التفاعل على النحو التالي: المرحلة 1: 35 دورة من 94 درجة مئوية لمدة 30 ثانية ، و 50 درجة مئوية لمدة 30 ثانية ، و 72 درجة مئوية لمدة 30 ثانية ؛ المرحلة 2: 72 درجة مئوية لمدة 10 دقائق.
  4. الكشف عن منتجات تضخيم PCR بنسبة 1 ٪ هلام الأغاروز الكهربائي وإرسالها لتحليل التسلسل.
    ملاحظة: إذا سمحت الظروف ، يمكن أن تخضع المواد الطافية لتحليل تسلسل الجيل التالي لتحديد الفيروسات الجديدة والحصول على تسلسل الجينوم الفيروسي بالكامل.

النتائج

بعد التلقيح بالمواد الطافية لمتجانسات البعوض (P0) ، أظهرت خلايا C6 / 36 مساحة واسعة بين الخلايا ، ولوحظت الخلايا المقشرة عند 120 ساعة (الشكل 1 أ) مقارنة بالخلايا غير الملقحة (السيطرة) في نفس الوقت (الشكل 1 ب). بعد احتضان خلايا BHK-21 بالمواد الطافية P3 ، لوحظ CPE مرئي في خل...

Discussion

كان الهدف من هذه الطريقة هو تقديم طريقة عملية لعزل الفيروسات المرتبطة بالبعوض باستخدام خطوط الخلايا المختلفة. من الأهمية بمكان إضافة المضادات الحيوية ومضادات الفطريات (البنسلين - الستربتومايسين - الأمفوتريسين) إلى المواد الطافية لمتجانسات البعوض لتجنب التلوث بالبكتيريا أو الفطريات. يجب...

Disclosures

ليس لدى المؤلفين أي تضارب في المصالح للكشف عنه.

Acknowledgements

تم دعم هذا العمل من قبل مشروع خطة ووهان للعلوم والتكنولوجيا (2018201261638501).

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
0.22 µm membrane filterMilliporeSLGP033RBPolymer films with specific pore ratings.To remove cell debris and bacteria.
24-well platesCORNING3524Containers for cell
75 cm2 flasksCORNING430641Containers for cell
a sterile 2 mL tube with 3 mm ceramic beads
Antibiotic-AntimycoticGibco15240-062Antibiotic in the medium to prevent contamination from bacteria and fungi
Automated nucleic acid extraction systemNanoMagBioS-48
BHK-21 cellsNational Virus Resource Center, Wuhan Institute of Virology
C6/36 cellsNational Virus Resource Center, Wuhan Institute of Virology
Centrifugal machineHimacCF16RNInstrument for centrifugation of mosquito samples
CO2
Dulbecco’s minimal essential medium (DMEM)GibcoC11995500BTmedium for vertebrate cell lines
Ebinur Lake virusCu20-XJ isolation
Feta Bovine Serum (FBS)Gibco10099141C

Provide nutrition for cells
high-speed low-temperature tissue homogenizerservicebioKZ-III-FInstrument for grinding
incubator (28 °C)PanasonicMCO-18ACInstrument for cell culture
incubator (37 °C)PanasonicMCO-18ACInstrument for cell culture
PCR tube
penicillin-streptomycinGibco15410-122Antibiotic in the medium to prevent contamination from bacteria
Penicillin-Streptomycin-Amphotericin B SolutionGibco15240096
Refrigerator (-80 °C)sanyoMDF-U54V
Roswell Park Memorial Institute  medium (RPMI)GibcoC11875500BTmedium for mosiquto cell lines
Screw cap storage tubes (2 mL)biofil FCT010005
sterile pestlesTiangenOSE-Y004Consumables  for grinding
TGrinder OSE-Y30 electric tissue grinderTiangenOSE-Y30Instrument for grinding
The dissecting microscopeZEISSstemi508
the light traps MXA-02Maxttrac
The mosquito absorbing machineNingbo Bangning
The pipette tipsAxygenTF
The QIAamp viral RNA mini kitQIAGEN52906
TweezersDumont0203-5-PO

References

  1. Xia, H., Wang, Y., Atoni, E., Zhang, B., Yuan, Z. Mosquito-associated viruses in China. Virologica Sinica. 33 (1), 5-20 (2018).
  2. Atoni, E., et al. A dataset of distribution and diversity of mosquito-associated viruses and their mosquito vectors in China. Scientific Data. 7 (1), 342 (2020).
  3. Atoni, E., et al. The discovery and global distribution of novel mosquito-associated viruses in the last decade (2007-2017). Reviews in Medical Virology. 29 (6), 2079 (2019).
  4. Xia, H., et al. Comparative metagenomic profiling of viromes associated with four common mosquito species in China. Virologica Sinica. 33 (1), 59-66 (2018).
  5. Ong, O. T. W., Skinner, E. B., Johnson, B. J., Old, J. M. Mosquito-borne viruses and non-human vertebrates in Australia: A review. Viruses. 13 (2), 265 (2021).
  6. Agboli, E., Leggewie, M., Altinli, M., Schnettler, E. Mosquito-specific viruses-transmission and interaction. Viruses. 11 (9), 873 (2019).
  7. Halbach, R., Junglen, S., van Rij, R. P. Mosquito-specific and mosquito-borne viruses: evolution, infection, and host defense. Current Opinion in Insect Science. 22, 16-27 (2017).
  8. Bolling, B. G., Olea-Popelka, F. J., Eisen, L., Moore, C. G., Blair, C. D. Transmission dynamics of an insect-specific flavivirus in a naturally infected Culex pipiens laboratory colony and effects of co-infection on vector competence for West Nile virus. Virology. 427 (2), 90-97 (2012).
  9. Baidaliuk, A., et al. Cell-fusing agent virus reduces arbovirus dissemination in Aedes aegypti mosquitoes in vivo. Journal of Virology. 93 (18), 00715-00719 (2019).
  10. Atoni, E., et al. Metagenomic virome analysis of Culex mosquitoes from Kenya and China. Viruses. 10 (1), 30 (2018).
  11. Xia, H., et al. First isolation and characterization of a group C Banna virus (BAV) from Anopheles sinensis mosquitoes in Hubei, China. Viruses. 10 (10), 555 (2018).
  12. Shi, C., et al. Stability of the virome in lab- and field-collected Aedes albopictus mosquitoes across different developmental stages and possible core viruses in the publicly available virome data of Aedes mosquitoes. mSystems. 5 (5), 00640 (2020).
  13. Zhou, M., Chu, H. . Handbook for Classification and Identification of Main Vectors. , (2019).
  14. Wang, G., et al. Identifying the main mosquito species in China based on DNA barcoding. Plos One. 7 (10), (2012).
  15. Ratnasingham, S., Hebert, P. D. N. Bold: The Barcode of Life Data System (www.barcodinglife.org). Molecular Ecology Notes. 7 (3), 355-364 (2007).
  16. Huang, Y., et al. In vitro and in vivo characterization of a new strain of mosquito Flavivirus derived from Culicoides. Viruses. 14 (6), 1298 (2022).
  17. Zhao, L., et al. Characterization of a novel Tanay virus isolated from Anopheles sinensis mosquitoes in Yunnan, China. Frontiers in Microbiology. 10, 1963 (1963).
  18. Ren, N., et al. Characterization of a novel reassortment Tibet orbivirus isolated from Culicoides spp. in Yunnan, PR China. Journal of General Virology. 102 (9), 001645 (2021).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

186

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved