Isolement du virus associé aux moustiques à partir de moustiques collectés sur le terrain

Résumé

De nombreuses nouvelles séquences pseudo-virales ont été trouvées chez les moustiques en raison de l’utilisation intensive des technologies de séquençage. Nous fournissons une procédure efficace pour isoler et amplifier les virus à l’aide de lignées cellulaires de vertébrés et de moustiques, qui pourrait servir de base à de futures études sur les virus associés aux moustiques, y compris les virus transmis par les moustiques et les virus spécifiques aux moustiques.

Résumé

Grâce à la vaste application des technologies de séquençage, de nombreuses nouvelles séquences virales ont été découvertes chez les arthropodes, y compris les moustiques. Les deux principales catégories de ces nouveaux virus associés aux moustiques sont les « virus transmis par les moustiques » et les « virus spécifiques aux moustiques (MSV) ». Ces nouveaux virus pourraient être pathogènes à la fois pour les vertébrés et les moustiques, ou ils pourraient simplement être symbiotiques avec les moustiques. Les virus d’entité sont essentiels pour confirmer les caractéristiques biologiques de ces virus. Ainsi, un protocole détaillé a été décrit ici pour l’isolement et l’amplification du virus à partir de moustiques collectés sur le terrain. Tout d’abord, les échantillons de moustiques ont été préparés en tant que surnageants d’homogénats de moustiques. Après une centrifugation à deux reprises, les surnageants ont ensuite été inoculés dans la lignée cellulaire de moustiques C6/36 ou la lignée cellulaire de vertébrés BHK-21 pour l’amplification du virus. Après 7 jours, les surnageants ont été collectés en tant que surnageants P1 et stockés à -80 °C. Ensuite, les surnageants P1 ont été passés deux fois de plus dans les cellules C6/36 ou BHK-21 pendant que l’état de la cellule était vérifié quotidiennement. Lorsque l’effet cytopathogène (ECP) sur les cellules a été découvert, ces surnageants ont été recueillis et utilisés pour identifier les virus. Ce protocole sert de base à la recherche future sur les virus associés aux moustiques, y compris les MBV et les MSV.

Introduction

Les moustiques sont un groupe d’arthropodes vecteurs pathogènes importants. Il existe environ 3 500 espèces de moustiques dans la famille Culicidae ^1,2. Le développement de technologies de séquençage à haut débit a conduit à la découverte de nombreuses séquences nouvelles ressemblant à des virus chez des moustiques de différentes parties du monde³. En général, ces virus associés aux moustiques peuvent être classés en deux groupes principaux : les MBV et les MSV.

Les MBV sont un groupe de virus divers qui sont les agents responsables de nombreuses maladies humaines ou animales, telles que le virus de la fièvre jaune (YFV), le virus de la dengue (DENV), le virus de l’encéphalite japonaise (JEV), le virus du Nil occidental (WNV) et le virus de la fièvre de la vallée du Rift (RVFV)⁴. Ils ont gravement menacé la santé publique en provoquant une morbidité et une mortalité graves chez les humains et les animaux à travers le monde. Les MBV entretiennent naturellement un cycle de vie entre divers hôtes par transmission d’un moustique infecté à un hôte naïf, ainsi que d’un hôte infecté par le virus et à un moustique nourricier⁵. Par conséquent, ces virus peuvent infecter à la fois les lignées cellulaires de moustiques et les lignées cellulaires de vertébrés en laboratoire¹.

Les VHS, qui comprennent le virus Yichang (YCN), le flavivirus Culex (CxFV) et le virus Chaoyang (CHAOV), sont un sous-groupe de virus spécifiques aux insectes ^1,6,7. Au cours des dernières années, il y a eu une augmentation de la découverte de nouveaux VHS, et certains de ces VHS ont eu un impact sur la transmission des MBV. Par exemple, le CxFV, qui peut être une infection persistante chez Culex pipiens, pourrait supprimer la réplication du VNO à un stade précoce⁸. Un autre flavivirus spécifique à un insecte, le virus de l’agent de fusion cellulaire (CFAV), inhibe la propagation du DENV et du virus Zika (ZIKV) chez les moustiques Aedes aegypti ⁹. Ainsi, ce protocole est une approche utile pour isoler les virus associés aux moustiques et peut aider à poursuivre la recherche sur la distribution des agents pathogènes liés aux moustiques et le contrôle des maladies transmises par les moustiques.

Protocole

1. Échantillonnage et tri des moustiques

1. Piègez les moustiques adultes à travers les pièges lumineux MXA-02 ou les pièges à moustiques au dioxyde de carbone sur le terrain.
2. Tuez les moustiques collectés en trempant dans de l’azote liquide^10,11. Les transporter au laboratoire par le système logistique de la chaîne du froid¹².
   NOTE: La glace sèche était principalement utilisée dans le système logistique de la chaîne du froid.
3. (Facultatif) Si les sites d’échantillonnage se trouvaient à proximité du laboratoire, envoyer directement les moustiques vivants dans les pièges à moustiquaires au laboratoire et les euthanasier par congélation à ≤-20 °C pendant 30 min⁴.
4. Faire une identification morphologique des moustiques collectés grâce au manuel^{d’outils 13} pour la classification et l’identification des moustiques.
   NOTE: Si nécessaire, le codage à barres ADN pourrait être utilisé pour classer et identifier les moustiques^14,15.
5. En fonction des dates d’échantillonnage et des sites, répartissez-les dans différents bassins, puis stockez-les dans des tubes de 2 à 5 mL.
6. Dessinez un tableau pour enregistrer chaque tube avec les espèces de moustiques, le nombre, le code d’échantillonnage, la date et les sites.
7. Imprimez les étiquettes avec les codes d’échantillonnage et fixez-les aux tubes.
8. Conserver les tubes contenant les échantillons de moustiques à -80 °C jusqu’à une analyse plus approfondie.

2. Broyage des moustiques

1. Placer 20 à 50 moustiques dans chaque tube stérile de 2 ml avec des billes de céramique de 3 mm contenant 1,5 ml de milieu du Roswell Park Memorial Institute (RPMI) contenant 2 % de solution de pénicilline-streptomycine-amphotéricine B.
   REMARQUE: Gardez les tubes sur de la glace ou sur un plateau d’anice.
2. Homogénéiser les moustiques avec un homogénéisateur tissulaire à basse température en broyant pendant 30 s à 70 Hz à 4 °C pendant trois cycles¹⁶.
3. Centrifuger les mélanges à 15 000 × g pendant 30 min à 4 °C et transférer les surnageants dans de nouveaux tubes.
4. Centrifuger à nouveau les surnageants à 15 000 × g pendant 10 min à 4 °C pour éliminer les débris de moustiques^12,17.
   NOTE: Si nécessaire, les surnageants peuvent être filtrés à l’aide de filtres de 0,22 μm.
5. Aliquote des surnageants (P0) dans des tubes de stockage à bouchon à vis de 2 mL (200 μL par tube) et les stocker à -80 °C.

3. Préparation des cellules et du milieu de maintenance de la culture cellulaire

NOTE: La lignée cellulaire de moustique C6/36 (déficiente en ARNi d’Aedes albopictus ) et la lignée cellulaire de vertébrés BHK-21 (rein de bébé hamster) ont été utilisées pour l’amplification et l’isolement du virus.

1. Inoculer 1 × 10^{6 cellules} en C6/36 dans une fiole de 75 cm 2 contenant 10 ml de milieu RPMI additionné de sérum fœtal bovin (FBS) à 10 % et de 1 % de pénicilline/streptomycine (P/S) à 28 °C dans un incubateur humidifié à 5 % de CO².
2. Inoculer 1 × 10^{6 cellules} BHK-21 dans une fiole de 75 cm 2 avec 10 mL de milieu Eagle modifié (DMEM) de Dulbecco complété par 10 % de FBS et 1 % P/S à 37 °C dans un incubateur humidifié à 5 % de CO₂.
   NOTE: Les cellules ont été passées deux ou trois fois par semaine^17,18.
3. Ensemencer les cellules cultivées dans une fiole de 75^cm2 (cellules C6/36 ou BHK-21) dans les plaques à 24 puits (C6/36 par puits: 1,4 × 10⁵; BHK-21 par puits: 0,8 × 10⁵).
4. Placez les plaques à 24 puits à 28 °C ou 37 °C pendant la nuit.
5. Observez les cellules au microscope et confirmez si la confluence cellulaire dans chaque puits est de 80% à 90%.
6. Préparer le milieu de maintien de la culture cellulaire (500 mL).
   NOTE: Pour C6/36, le milieu était RPMI complété par 2% FBS et 2% Penicilline-Streptomycin-Amphotéricine B Solution. Pour BHK-21, le milieu était DMEM complété par 2% FBS et 2% Penicilline-Streptomycin-Amphotéricine B Solution.

4. Isolement du virus

REMARQUE : Toutes les étapes ont été effectuées dans un laboratoire de niveau de biosécurité 2 (BSL-2). L’exigence de niveau de sécurité du laboratoire de biosécurité a été déterminée par l’évaluation des risques de biosécurité basée sur les réglementations de différents pays et régions. Le processus doit être effectué dans une enceinte de biosécurité.

1. Retirer le milieu de culture cellulaire des plaques de 24 puits et ajouter 100 μL du milieu de maintien de la culture cellulaire et 100 μL du surnageant de l’homogénat de moustiques (P0) à chaque puits.
2. Incuber les plaques à 28 °C ou 37 °C pendant 60 min et les agiter doucement toutes les 15 minutes pour éviter le dessèchement cellulaire.
3. Retirer le surnageant et rincer chaque puits doucement avec 600 μL de milieu de maintien de culture cellulaire pour éliminer complètement les débris.
4. Ajouter 800 μL de milieu de maintien de culture cellulaire à chaque puits et conserver les plaques dans un incubateur humidifié à 5% de CO₂ à 28 °C ou 37 °C pendant 7 jours.
5. Surveiller quotidiennement l’état cellulaire de chaque puits au microscope¹⁵.
6. Recueillir les surnageants des cellules (surnageants P1) le 7^ème jour et stocker les surnageants à -80 °C.
7. Répétez les étapes 4.1-4.6 2x pour obtenir les surnageants P2 et P3.
   REMARQUE : À l’étape 4.3, le rinçage de chaque puits avec 600 μL de milieu de maintenance de culture cellulaire était facultatif pour les P2 et P3.
8. Selon le puits qui montre l’effet cytopathogène (CPE) - les cellules meurent, pyknose et se détachent de la surface; fusion avec des cellules adjacentes pour former une syncytie; ou l’apparition de corps d’inclusion nucléaires ou cytoplasmiques — ajouter 300 à 400 μL du surnageant de ce puits CPE dans chaque puits des nouvelles plaques à 6 puits contenant des cellules (la confluence cellulaire était de 80% à 90%) pour amplifier considérablement les virus.
9. Recueillir les surnageants et les aliquotes dans des tubes de stockage à bouchon à vis de 2 mL (500 μL par tube). Conservez-les à -80 °C.
   NOTE: Après trois générations de passages successifs dans les cellules, les échantillons qui n’ont pas induit de CPE ont été jetés. Si nécessaire, les générations de passage successifs dans les cellules peuvent être augmentées.

5. Détection des séquences virales par RT-PCR

1. Extraire l’ARN total de 200 μL du surnageant viral à l’aide d’un mini kit d’ARN viral¹⁶.
   REMARQUE: Ici, un système automatisé d’extraction d’acide nucléique a été utilisé pour extraire l’ARN total en suivant les instructions du fabricant de l’instrument.
2. Convertissez l’ARN en ADNc en suivant les instructions du kit RT-PCR à l’aide d’un instrument de PCR.
   1. Ajouter 15 μL d’ARN mélangé avec 1 μL d’amorces aléatoires dans le tube de PCR. Placez le tube à 70 °C pendant 5 min, puis placez-le sur la glace pendant 5 min.
   2. Ajouter 5 μL de tampon 5x et 25 μL de mélange (10 mM de dNTP, 40 U/μL d’inhibiteur de RNase et 200 U/μL DE M-MLV) dans le tube et placer le tube à 42 °C pendant 60 min et à 95 °C pendant 10 min.
   3. Conserver le tube à -20 °C.
3. Utilisez un kit de PCR et des amorces universelles (Tableau 1) pour détecter les virus par PCR.
   1. Pour les arbovirus, mettre en place le système de réaction PCR (total 30 μL) avec les composants suivants : 3 μL de tampon Taq 10x, 3 μL de dNTP (1mM), 1 μL d’amorce directe (10 μm), 1 μL d’amorce inverse (10 μm), 0,3 μL de Taq (10 U/μL), 19,7 μL de_ddH2Oet 2 μL d’ADNc.
   2. Pour la détection des flavivirus, configurer le processus de réaction comme suit: stade 1: 35 cycles de 94 °C pendant 30 s, 52 °C pendant 30 s et 72 °C pendant 30 s; étape 2: 72 °C pendant 10 min.
   3. Pour la détection des alphavirus, configurer le processus de réaction comme suit: stade 1: 35 cycles de 94 °C pendant 30 s, 50 °C pendant 30 s et 72 °C pendant 30 s; étape 2: 72 °C pendant 10 min.
   4. Pour la détection des bunyavirus, configurer le processus de réaction comme suit: stade 1: 35 cycles de 94 °C pendant 30 s, 50 °C pendant 30 s et 72 °C pendant 30 s; étape 2: 72 °C pendant 10 min.
4. Détecter les produits d’amplification PCR par électrophorèse sur gel d’agarose à 1% et les envoyer pour analyse de séquençage.
   NOTE: Si les conditions le permettent, les surnageants peuvent subir une analyse de séquençage de nouvelle génération pour identifier les nouveaux virus et obtenir l’ensemble des séquences du génome viral.

Résultats

Après inoculation avec les surnageants des homogénats de moustiques (P0), les cellules C6/36 présentaient un large espace intercellulaire, et des cellules exfoliées ont été observées à 120 h (Figure 1A) par rapport aux cellules non inoculées (témoin) en même temps (Figure 1B). Après incubation des cellules BHK-21 avec les surnageants P3, une CPE visible a été observée dans les cellules BHK-21 à 48 h (Figure 1C) contr...

Discussion

L’objectif de cette méthode était d’offrir un moyen pratique d’isoler les virus associés aux moustiques à l’aide de diverses lignées cellulaires. Il est essentiel d’ajouter l’antibiotique-antimycotique (pénicilline-streptomycine-amphotéricine) aux surnageants des homogénats de moustiques pour éviter la contamination par des bactéries ou des champignons. Les moustiques et les surnageants viraux obtenus sur le terrain doivent être réfrigérés à -80 °C pour éviter les cycles répétés de gel-dé...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.22 µm membrane filter	Millipore	SLGP033RB	Polymer films with specific pore ratings.To remove cell debris and bacteria.
24-well plates	CORNING	3524	Containers for cell
75 cm2 flasks	CORNING	430641	Containers for cell
a sterile 2 mL tube with 3 mm ceramic beads
Antibiotic-Antimycotic	Gibco	15240-062	Antibiotic in the medium to prevent contamination from bacteria and fungi
Automated nucleic acid extraction system	NanoMagBio	S-48
BHK-21 cells	National Virus Resource Center, Wuhan Institute of Virology
C6/36 cells	National Virus Resource Center, Wuhan Institute of Virology
Centrifugal machine	Himac	CF16RN	Instrument for centrifugation of mosquito samples
CO2
Dulbecco’s minimal essential medium (DMEM)	Gibco	C11995500BT	medium for vertebrate cell lines
Ebinur Lake virus			Cu20-XJ isolation
Feta Bovine Serum (FBS)	Gibco	10099141C	Provide nutrition for cells
high-speed low-temperature tissue homogenizer	servicebio	KZ-III-F	Instrument for grinding
incubator (28 °C)	Panasonic	MCO-18AC	Instrument for cell culture
incubator (37 °C)	Panasonic	MCO-18AC	Instrument for cell culture
PCR tube
penicillin-streptomycin	Gibco	15410-122	Antibiotic in the medium to prevent contamination from bacteria
Penicillin-Streptomycin-Amphotericin B Solution	Gibco	15240096
Refrigerator (-80 °C)	sanyo	MDF-U54V
Roswell Park Memorial Institute  medium (RPMI)	Gibco	C11875500BT	medium for mosiquto cell lines
Screw cap storage tubes (2 mL)	biofil	FCT010005
sterile pestles	Tiangen	OSE-Y004	Consumables  for grinding
TGrinder OSE-Y30 electric tissue grinder	Tiangen	OSE-Y30	Instrument for grinding
The dissecting microscope	ZEISS	stemi508
the light traps MXA-02	Maxttrac
The mosquito absorbing machine	Ningbo Bangning
The pipette tips	Axygen	TF
The QIAamp viral RNA mini kit	QIAGEN	52906
Tweezers	Dumont	0203-5-PO