JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • النتائج
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

تحفز العديد من الجينات غير المنظمة هجرة الخلايا السرطانية وغزوها ، مما يؤدي إلى سوء التشخيص. يعد تحديد الجينات التي تنظم هجرة الخلايا السرطانية وغزوها أمرا بالغ الأهمية. يقدم هذا البروتوكول طريقة للتحقيق في آثار زيادة التعبير عن الجين على هجرة وغزو الخلايا السرطانية في الوقت الفعلي.

Abstract

الخلايا السرطانية شديدة الحركة والغازية وتظهر أنماط التعبير الجيني المتغيرة. إن معرفة كيفية تنظيم التغيرات في التعبير الجيني لهجرة الخلايا السرطانية وغزوها أمر ضروري لفهم آليات تسلل الخلايا السرطانية إلى الأنسجة السليمة المجاورة وورم خبيث. في السابق ، ثبت أن ضربة قاضية للجينات متبوعة بالقياس في الوقت الفعلي القائم على المعاوقة لهجرة الخلايا السرطانية وغزوها تمكن من تحديد الجينات المطلوبة لهجرة الخلايا السرطانية وغزوها. في الآونة الأخيرة ، زادت لقاحات mRNA ضد SARS-CoV-2 من الاهتمام باستخدام mRNA الاصطناعي لأغراض علاجية. هنا ، تمت مراجعة الطريقة التي تستخدم mRNA الاصطناعية لدراسة تأثير الإفراط في التعبير الجيني على هجرة الخلايا السرطانية وغزوها. توضح هذه الدراسة أن التعبير الجيني المرتفع مع نقل mRNA الاصطناعي متبوعا بالقياس في الوقت الفعلي القائم على المعاوقة قد يساعد في تحديد الجينات التي تحفز هجرة الخلايا السرطانية وغزوها. تقدم ورقة الطريقة هذه تفاصيل مهمة حول إجراءات فحص تأثير التعبير الجيني المتغير على هجرة الخلايا السرطانية وغزوها.

Introduction

تلعب حركية الخلايا السرطانية دورا مهما في ورم خبيث 1,2. إن انتشار الخلايا السرطانية إلى الأنسجة السليمة المجاورة والبعيدة يجعل علاج السرطان صعبا ويساهم في تكرار 3,4. لذلك ، من الضروري فهم آليات حركة الخلايا السرطانية وتطوير الاستراتيجيات العلاجية ذات الصلة. نظرا لأن العديد من الخلايا السرطانية قد غيرت ملامح التعبير الجيني ، فمن الأهمية بمكان فهم التغييرات في ملف تعريف التعبير الجيني التي تؤدي إلى تغيير حركة الخلايا السرطانية 5,6.

تم تطوير العديد من المقايسات لقياس هجرة الخلايا في المختبر. توفر بعض المقايسات معلومات محدودة فقط بسبب السماح فقط بالقياسات في نقاط زمنية محددة ، بينما يقدم البعض الآخر معلومات شاملة عن حركة الخلايا السرطانية في الوقت الفعلي7. على الرغم من أن العديد من فحوصات حركية الخلايا هذه يمكن أن توفر نتائج كمية في وقت معين أو نقطة النهاية ، إلا أنها تفشل في توفير معلومات مفصلة بما فيه الكفاية عن التغيرات الديناميكية في معدل هجرة الخلايا خلال الفترة التجريبية. بالإضافة إلى ذلك ، قد يكون من الصعب فحص التغييرات المحتملة في معدل هجرة الخلايا اعتمادا على التصميم التجريبي وأنواع الخلايا وأرقام الخلايا. علاوة على ذلك ، يمكن التحقيق في آثار العلاجات غير المعقدة من خلال القياس الكمي البسيط لمقايسات الحركة التقليدية ، ولكن قد تكون هناك حاجة إلى تقدير كمي أكثر تعقيدا لدراسة التأثيرات المعقدة لمختلف العلاجات المشتركة8.

تم تطوير أداة لمراقبة التيار الكهربائي لقاع بئر لوحة العيار الدقيق المغطى بأقطاب كهربائية دقيقة9. يعيق التصاق الخلايا بسطح البئر تدفق الإلكترون ، وترتبط المعاوقة بالارتباط الكمي والنوعي للخلايا. يسمح وجود الأقطاب الكهربائية الدقيقة في قاع البئر بقياس التصاق الخلايا وانتشارها وتكاثرها. يسمح وجود الأقطاب الكهربائية الدقيقة تحت غشاء صغير يسهل اختراقه في الغرفة العلوية بقياس هجرة الخلايا وغزوها إلى الغرفة السفلية ، مع طلاء الغرفة العلوية ببروتينات مصفوفة خارج الخلية (ECM) للسماح بالغزو10.

في السابق ، ثبت أن القياسات في الوقت الفعلي القائمة على المعاوقة لهجرة الخلايا السرطانية وغزوها توفر بيانات في الوقت الفعلي خلال التجربة بأكملها ، بالإضافة إلى مقارنات وتقديرات فورية في ظل ظروف تجريبية مختلفة11. في ورقة الطريقة هذه ، تم حث ضربة قاضية للجينات لاختبار دور البروتينات ذات الأهمية في هجرة الخلايا السرطانية وغزوها. نظرا لأن تأثير ضربة قاضية للجين الكامل في ظل الظروف التجريبية المختبرة استغرق 3-4 أيام بعد التثقيب الكهربائي باستخدام الحمض النووي الريبي الصغير المتداخل (siRNAs) 8 ، فقد تم إعادة طلاء الخلايا بعد التثقيب الكهربائي وإعادة حصادها بعد 3 أيام للقياس في الوقت الفعلي القائم على المعاوقة لهجرة الخلايا السرطانية وغزوها.

منظم CT10 للكيناز (Crk) و Crk-like (CrkL) عبارة عن بروتينات محول تتوسط تفاعلات البروتين والبروتين في اتجاه مجرى مسارات كيناز مستقبلات عامل النمو المختلفة ومسارات التيروزين كيناز غير المستقبلة12. تساهم المستويات المرتفعة من بروتينات Crk و CrkL في سوء التشخيص في العديد من أنواع السرطان البشرية ، بما في ذلك الورم الأرومي الدبقي13. ومع ذلك ، فمن غير الواضح كيف تؤدي بروتينات Crk و CrkL المرتفعة إلى سوء التشخيص. لذلك ، من المهم تحديد تأثير التعبير المفرط ل Crk و CrkL على وظائف الخلايا السرطانية. في السابق ، تم إجراء دراسة ضربة قاضية للجينات لإثبات أن المستويات الداخلية لبروتينات Crk و CrkL مطلوبة لهجرة خلايا الورم الأرومي الدبقي وغزوها8. هنا ، تم تطوير نظام فحص معدل لمعالجة تأثير التعبير المفرط ل Crk و CrkL على هجرة الخلايا السرطانية وغزوها.

في الآونة الأخيرة ، جذب التوليف في المختبر ل mRNA وتطبيقاته العلاجية اهتماما متجددا بسبب تطوير لقاحات mRNA ضد SARS-CoV-2 (استعرضه Verbeke et al.14). بالإضافة إلى ذلك ، تم إحراز تقدم ملحوظ في استخدام mRNA الاصطناعية في السرطان وأمراض أخرى15,16. يعد التثقيب الكهربائي للخلايا طريقة فعالة لتوصيل mRNA الاصطناعي والحث على التعديل الجيني العابر (تمت مراجعته بواسطة Campillo-Davo et al.17) ، ويتيح استخدام mRNA الاصطناعي التعبير الجيني السريع والفعال في الخلايا الليفية الخالدة 18. تجمع ورقة الطريقة هذه بين الإفراط في التعبير الجيني باستخدام mRNA الاصطناعي مع تحليلات الخلايا في الوقت الفعلي لدراسة هجرة الخلايا السرطانية وغزوها. ومع ذلك ، فإن المخطط التجريبي المستخدم في siRNAs لا يعمل مع نقل mRNA الاصطناعي ، حيث يزداد مستوى البروتينات الخارجية بسرعة وينخفض تدريجيا عند نقل mRNA الاصطناعي18. لذلك ، تم تعديل الطريقة لإجراء تحليل في الوقت الفعلي لهجرة الخلايا وغزوها مباشرة بعد النقل دون زراعة الخلايا بشكل إضافي.

توضح ورقة الطريقة هذه أن الجمع بين القياسات في الوقت الفعلي القائمة على المعاوقة مع نقل الخلايا السرطانية باستخدام mRNAs الاصطناعية يوفر تحليلا سريعا وشاملا لآثار تنظيم الجينات على هجرة الخلايا السرطانية وغزوها. تصف ورقة الطريقة هذه الإجراءات التفصيلية لقياس كيفية تأثر هجرة وغزو خلايا الورم الأرومي الدبقي بالتعبير المفرط عن Crk و CrkL. من خلال فحص التأثيرات المعتمدة على التركيز ل mRNA الاصطناعية على هجرة الخلايا السرطانية ، تصف الورقة بوضوح كيف أن الزيادة في مستويات البروتين تحفز هجرة الخلايا السرطانية. بالإضافة إلى ذلك ، يتم تقديم نهج لتغيير تركيز هلام ECM لتقييم آثار التغيرات في التعبير الجيني على غزو الخلايا السرطانية.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

1. تخليق الحمض النووي الريبوزي المرسال

ملاحظة: بالنسبة لتخليق mRNA ، يجب معالجة جميع الكواشف والمعدات بشكل خاص لتعطيل RNases قبل الاستخدام. راجع جدول المواد للحصول على تفاصيل حول جميع المواد والأدوات والكواشف المستخدمة في هذا البروتوكول.

  1. خطي الحمض النووي
    ملاحظة: تم استنساخ الحمض النووي للفأر ل CrkI و CrkL في متجه التعبير pFLAG-CMV-5a لإضافة علامة FLAG epitope في المحطة C واستنساخها في ناقل pcDNA3.1 / myc-His لدمج مروج T7 ، كما هو موضح سابقا 18,19.
    1. أضف 10 ميكرولتر من محلول تفاعل 10x ، و 1.5 ميكرولتر من PmeI (10000 وحدة / مل) ، و 10 ميكروغرام من الحمض النووي البلازميد إلى أنبوب طرد مركزي دقيق لخطي الحمض النووي البلازميد مع إنزيم التقييد. أضف الماء الخالي من النيوكلياز ليصل حجم التفاعل إلى 100 ميكرولتر.
    2. امزج عن طريق النقر ، وتدويره لأسفل ، واحتضان خليط التفاعل عند 37 درجة مئوية طوال الليل.
    3. قم بتدويرها وإضافة 5 ميكرولتر من 10٪ كبريتات دوديسيل الصوديوم (SDS) و 1 ميكرولتر من البروتيناز K (20 مجم / مل ، درجة الحمض النووي الريبي) إلى خليط التفاعل. امزج عن طريق النقر ، وقم بتدويره لأسفل ، واحتضانه على حرارة 50 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة.
    4. تحت غطاء الدخان ، أضف 100 ميكرولتر من المرحلة السفلية من الفينول: الكلوروفورم: كحول الأيزو أميل إلى خليط تفاعل البلازميد للاستخراج. دوامة ، ثم أجهزة الطرد المركزي عند 18800 × جم لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة. انقل المرحلة العليا إلى أنبوب جديد.
    5. كرر الخطوة 1.1.4 مع الكلوروفورم: كحول الأيزو أميل في 24: 1.
    6. في الأنبوب الجديد ، ارفع حجم التفاعل إلى 300 ميكرولتر بإضافة 200 ميكرولتر من الماء الخالي من النيوكلياز ، ثم أضف 30 ميكرولتر من أسيتات الصوديوم 3 M و 600 ميكرولتر من الإيثانول بنسبة 100٪.
    7. تخلط عن طريق الدوامة ، ثم توضع في -20 درجة مئوية لمدة 30-60 دقيقة لترسيب الإيثانول للحمض النووي.
    8. أجهزة الطرد المركزي عند 18800 × جم لمدة 20 دقيقة عند 4 درجات مئوية ، وتخلص من المادة الطافية ، واشطف الحبيبات ب 1 مل من الإيثانول بنسبة 70٪. كرر الطرد المركزي لمدة 10 دقائق ، ثم قم بإزالة المادة الطافية تماما.
    9. جفف مع فتح الغطاء لمدة 2 دقيقة ، أضف 30 ميكرولتر من الماء الخالي من النيوكلياز ، وأعد تعليق حبيبات الحمض النووي.
    10. أوجد تركيز الحمض النووي (DNA) باستخدام مقياس الطيف الضوئي.
    11. تحقق من حجم وكمية الحمض النووي الخطي باستخدام هلام الأغاروز الكهربائي.
  2. تخليق الحمض النووي الريبي باستخدام بوليميراز الحمض النووي الريبي T7
    1. أضف 2 ميكرولتر لكل من 10x عازلة للنسخ ، و ATP ، و GTP ، و UTP ، و CTP ، و T7 و 1 ميكروغرام من الحمض النووي الخطي إلى أنبوب طرد مركزي دقيق. أضف الماء الخالي من النيوكلياز ليصل حجم التفاعل إلى 20 ميكرولتر.
    2. امزج عن طريق النقر ، والدوران لأسفل ، واحتضان خليط التفاعل عند 37 درجة مئوية لمدة 2 ساعة لتخليق الحمض النووي الريبي.
    3. قم بتدويرها لأسفل ، أضف 1 ميكرولتر من DNase (2 وحدة / ميكرولتر) ، واحتضانها عند 37 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة لإزالة قالب الحمض النووي.
  3. ترسيب كلوريد الليثيوم للحمض النووي الريبي
    1. أضف 10 ميكرولتر من كلوريد الليثيوم (7.5 M) إلى خليط التفاعل. امزج عن طريق النقر ، والدوران لأسفل ، واحتضان خليط التفاعل عند -20 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة.
    2. أجهزة الطرد المركزي عند 18800 × جم لمدة 20 دقيقة عند 4 درجات مئوية ، وتخلص من المادة الطافية ، واشطف الحبيبات ب 500 ميكرولتر من الإيثانول بنسبة 70٪. كرر الطرد المركزي لمدة 10 دقائق ، ثم قم بإزالة المادة الطافية تماما.
    3. جفف مع فتح الغطاء لمدة 2 دقيقة ، أضف 30 ميكرولتر من الماء الخالي من النيوكلياز ، وأعد تعليق حبيبات الحمض النووي الريبي.
  4. متوجا
    1. سخني عينة الحمض النووي الريبي عند 65 درجة مئوية لمدة 10 دقائق ، ثم ضعها على الثلج للتبريد.
    2. أضف 5 ميكرولتر لكل من 10x عازلة للتغطية ، و 10 mM GTP ، و 1 mM (10x) S-adenosylmethionine (SAM) ، و 2 ميكرولتر لكل من مزيج إنزيم السد ومزيج إنزيم O-methyltransferase ، و 1.25 ميكرولتر من مثبط RNase. امزج عن طريق النقر ، والدوران لأسفل ، واحتضان خليط التفاعل عند 37 درجة مئوية لمدة 1 ساعة.
  5. بولي (أ) مخلفات
    1. قم بتدوير العينة ، ثم أضف 6 ميكرولتر من الماء الخالي من النيوكلياز ، و 20 ميكرولتر من 5x E-PAP buffer ، و 10 ميكرولتر من 25 mM MnCl2 ، و 10 ميكرولتر من 10 mM ATP ، و 4 ميكرولتر من إنزيم مخلفات E-PAP poly (A). امزج عن طريق النقر ، والدوران لأسفل ، واحتضان خليط التفاعل عند 37 درجة مئوية لمدة 2 ساعة.
  6. ترسيب كلوريد الليثيوم والقياس الكمي للحمض النووي الريبوزي المرسال الاصطناعي
    1. أضف 50 ميكرولتر من كلوريد الليثيوم (7.5 م) ، وقم بإجراء ترسيب كلوريد الليثيوم كما هو موضح في الخطوات 1.3.1-1.3.3.
    2. قياس تركيز الحمض النووي الريبوزي الرسول (mRNA) باستخدام مقياس الطيف الضوئي.
    3. تحقق من حجم وكمية mRNA باستخدام الفورمالديهايد (1٪ -2٪) أغاروز (1٪) هلام الكهربائي.

2. طلاء هلام المصفوفة خارج الخلية (ECM) لألواح غزو الخلية والهجرة (CIM)

ملاحظة: لوحة غزو الخلايا وهجرتها (CIM) عبارة عن لوحة مكونة من 16 بئرا مصنعة تجاريا لتحليل الخلايا في الوقت الفعلي القائم على المعاوقة. بالنسبة لفحص غزو الخلية ، قم بتغطية ألواح CIM بهلام ECM ، كما هو موضح سابقا ولكن مع بعض التعديلات11.

  1. قم بإزالة حصة من مخزون جل ECM من الفريزر واحتفظ بها على الجليد.
  2. قم بتخفيف جل ECM (10 مجم / مل) إلى تركيز عمل (100 ميكروغرام / مل) عن طريق خلط 990 ميكرولتر من وسط النسر المعدل من Dulbecco (بدون مصل أو مضادات حيوية) مع 10 ميكرولتر من جل ECM في أنبوب طرد مركزي دقيق. تخلط عن طريق ماصة لطيفة.
  3. أضف 60 ميكرولتر من جل ECM المخفف إلى كل بئر من الآبار ال 16 للغرفة العلوية للوحة CIM. قم بتطبيق طريقة السحب العكسي مع تجنب فقاعات الهواء20,21.
    ملاحظة: قم بتحسين تركيز جل ECM لكل خط خلية. بالنسبة لخطوط خلايا الورم الأرومي الدبقي ، تم استخدام 0.1 ميكروغرام / ميكرولتر إلى 1 ميكروغرام / ميكرولتر جل ECM للتحسين.
  4. ضع الحجرة العلوية للوحة CIM مع غطاء اللوحة على ورقة بلاستيكية واقية داخل حاضنة CO2 لمدة 4 ساعات تقريبا لتشكيل طبقة هلام.
    تنبيه: أثناء طلاء لوحة CIM بهلام ECM ، يجب ألا يكون لأقطاب الغرفة العلوية للوحة CIM اتصال مباشر بأيدي المجرب أو أسطح الجهاز ، بما في ذلك خزانة السلامة البيولوجية أو حاضنة CO2 .

3. تحضير الخلايا السرطانية

ملاحظة: يجب أن تبقى جميع مواد زراعة الخلايا معقمة. حصاد الخلايا السرطانية وتقشيرها كهربائيا تحت خزانة أمان بيولوجي مع معدات الحماية الشخصية المناسبة (PPE) ، كما هو موضح سابقا ولكن مع بعض التعديلات11.

  1. ثقافة الخلايا السرطانية
    1. زراعة خلايا U-118MG في 10 مل من DMEM تحتوي على 5٪ مصل بقري جنيني (FBS) و 1٪ مضادات حيوية لكل طبق زراعة أنسجة البوليسترين 100 مم × 20 مم عند 37 درجة مئوية في حاضنة CO2 بنسبة 5٪ (حالة استزراع).
  2. استنزاف مصل الخلايا السرطانية
    ملاحظة: يجب تقليل تعرض الخلايا للجاذبات الكيميائية الموجودة في FBS قبل فحوصات هجرة الخلايا وغزوها باستخدام تركيز عال من FBS.
    1. أزل الوسط القديم ، وأضف 10 مل من DMEM المسخن مسبقا الذي يحتوي على 0.5٪ FBS و 1٪ مضاد حيوي لكل طبق (وسط مصل منخفض).
    2. كرر الخطوة 3.2.1.
    3. احتضان الخلايا عند 37 درجة مئوية في حاضنة CO2 5٪ لمدة 4 ساعات أو أكثر.
  3. حصاد الخلايا السرطانية
    1. قم بإزالة الوسط القديم ، وأضف 8 مل من محلول ملحي Dulbecco المخزن بالفوسفات (DPBS) لكل طبق ، وقم بإزالة DPBS ، وأضف 0.05٪ trypsin-EDTA المسخن مسبقا (2 مل / طبق) لتغطية السطح ، واحتضانه في حاضنة CO2 لمدة 30 ثانية.
    2. قم بنضح التربسين-EDTA بعناية ، وأضف وسط مصل منخفض (7 مل / طبق) ، ثم اجمع الخلايا في أنبوب طرد مركزي سعة 50 مل أو 15 مل.
    3. قسمة حجم صغير من الخلايا ، واستخدم عداد خلايا آلي محمول باليد لحساب الخلايا.
    4. احسب العدد الإجمالي للخلايا والحجم المطلوب ل 10000 خلية / ميكرولتر.
    5. قم بتدوير الخلايا عن طريق الطرد المركزي لها عند 100 × جم لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة ، واستنشاق المادة الطافية ، وإضافة الحجم المحسوب من DMEM الذي يحتوي على 0.5٪ FBS (بدون مضادات حيوية) ، وإعادة تعليق حبيبات الخلية برفق.
    6. نقل 110 ميكرولتر من تعليق الخلية ، الذي يحتوي على 1.1 مليون خلية ، إلى أنبوب طرد مركزي دقيق لكل علاج.
    7. كرر الخطوة 3.3.6 لنقل الخلايا إلى أربعة أنابيب طرد مركزي دقيقة لأربعة علاجات مختلفة.
      ملاحظة: تحتوي لوحة CIM على إجمالي 16 بئرا. تصميم أربع معالجات مختلفة للمقارنة بحيث يمكن تخصيص أربعة آبار من لوحة CIM لكل معالجة. استخدم الخلايا الكهربائية في التجارب التالية: تحليلات اللطخة الغربية (0.3 مليون خلية لكل طبق زراعة أنسجة 35 ملم) ، وأربعة آبار من فحوصات هجرة الخلايا في الوقت الفعلي (0.1 مليون خلية / بئر) ، وأربعة آبار من فحوصات غزو الخلايا في الوقت الفعلي (0.1 مليون خلية / بئر) لكل علاج. اضبط عدد الخلايا التي تحتاج إلى الكهرباء إذا تغير التصميم التجريبي.

4. التثقيب الكهربائي للخلايا السرطانية

  1. لإزالة الوسط ، أضف 1 مل من DPBS إلى تعليق الخلية في كل أنبوب ، وقم بتدوير تعليق الخلية ثلاث مرات لمدة 10 ثوان في كل مرة أثناء تدوير الأنبوب 180 درجة كل 10 ثوان باستخدام جهاز طرد مركزي صغير ، وقم بإزالة المادة الطافية باستخدام ماصة صغيرة.
    ملاحظة: من المهم تشكيل حبيبات خلية مدمجة ولكن يمكن إنعاشها بسهولة.
  2. أضف 110 ميكرولتر من المخزن المؤقت لإعادة التعليق R إلى حبيبات الخلية للحصول على 0.1 مليون خلية في 10 ميكرولتر.
  3. أضف mRNA الاصطناعي إلى حبيبات الخلية للحصول على تركيز 0.2-20 نانوغرام / ميكرولتر اعتمادا على مستوى التعبير المطلوب. امزج وأعد تعليق حبيبات الخلية برفق عن طريق النقر أو السحب اللطيف.
    ملاحظة: استخدم تركيزات مختلفة من mRNA الاصطناعي ، وافحص تعبير البروتين باستخدام تحليل اللطخة الغربية ، وحدد تركيز mRNA الاصطناعي الذي يؤدي إلى مستوى التعبير المطلوب من أجل التحقيق في العلاقة المحددة بين تعبير البروتين والتأثيرات البيولوجية.
  4. قم بإلكتروبور 10 ميكرولتر من تعليق الخلية بنظام التثقيب الكهربائي عند 1350 فولت لمدة 10 مللي ثانية مع ثلاث نبضات في كل مرة.
  5. نقل الخلايا الكهربائية إلى أنبوب طرد مركزي دقيق جديد مع 1.1 مل من DMEM يحتوي على 0.5٪ FBS.
  6. كرر التثقيب الكهربائي حتى يتم ثقب بقية تعليق الخلية بالكهرباء. اجمع الخلايا الكهربائية في أنبوب الطرد المركزي الدقيق للحصول على 1.1 مليون خلية في 1.1 مل.
    ملاحظة: يمكن استخدام كل من أطراف التثقيب الكهربائي 100 ميكرولتر و 10 ميكرولتر لإلكتروب كمية كبيرة من الخلايا ، ولكن يتم تضمين أطراف التثقيب الكهربائي ل 10 ميكرولتر و 100 ميكرولتر في مجموعتين منفصلتين ويجب شراؤها بشكل منفصل. يتم تضمين المخزن المؤقت لإعادة التعليق R في كلتا المجموعتين.
  7. عند الانتهاء من جميع التثقيب الكهربائي المعني ، أعد تعليق الخلايا المجمعة برفق.
  8. لوحة 0.3 مليون خلية في طبق زراعة أنسجة البوليسترين 35 مم × 10 مم مع 2 مل من DMEM تحتوي على 5٪ FBS ، وزراعة الخلايا لمدة يوم واحد تحت حالة المزرعة لإعداد محللات الخلية الكلية وتحليل اللطخة الغربية.
  9. احتفظ ببقية الخلايا الكهربية في درجة حرارة الغرفة حتى يصبح نظام تحليل الخلايا في الوقت الفعلي جاهزا.

5. إعداد محلل الخلايا في الوقت الفعلي والبرنامج ولوحات CIM

ملاحظة: قم بإعداد محلل الخلايا في الوقت الحقيقي ولوحتي CIM ، كما هو موضح سابقا11.

  1. توازن محلل الخلايا في الوقت الحقيقي
    1. انقل محلل الخلايا في الوقت الفعلي إلى حاضنة CO2 قبل عدة ساعات من الاستخدام لموازنة النظام في ظل ظروف الثقافة.
  2. إعداد برنامج التحليل
    1. افتح برنامج التحليل بالنقر المزدوج على أيقونة برنامج تحليل الخلايا في الوقت الفعلي على سطح المكتب.
    2. بمجرد فتح خيار إعداد نمط التجربة الافتراضي ، حدد خيار تشغيل ثلاث تجارب بشكل منفصل.
      ملاحظة: كل مهد له نافذة منفصلة. هناك علامات تبويب مختلفة لإعداد الفاصل الزمني للقياس ومدته وتحليل البيانات والظروف التجريبية الأخرى.
    3. افتح كل مهد بالنقر فوق علامة التبويب رقم .
    4. انقر فوق علامة التبويب ملاحظات التجربة ، وحدد المجلد الذي سيتم حفظ البيانات فيه ، وأدخل اسم التجربة.
    5. انقر فوق علامة التبويب تخطيط ، وقم بإعداد آبار مكررة رباعية لكل حالة معالجة عن طريق تحديد أربعة آبار في وقت واحد وإدخال معلومات العينة ، ثم انقر فوق تطبيق.
    6. انقر فوق علامة التبويب " جدولة" | أضف خطوة لإعداد الوضع المكون من خطوتين لقياسات مقاومة الخلية. ثم ، انقر فوق Apply لإعداد الخطوة الأولى.
    7. انقر فوق إضافة خطوة مرة أخرى ، وأدخل 10 دقائق للفاصل الزمني و 48 ساعة لمدة الهجرة والغزو ، وانقر فوق تطبيق لإعداد الخطوة الثانية.
      ملاحظة: تستغرق الخطوة الأولى قياسا أساسيا لمرة واحدة (عملية مسح واحدة بفاصل زمني قدره 1 دقيقة). تقيس الخطوة الثانية مقاومة الخلية للتجربة (على سبيل المثال ، 289 عملية مسح بفاصل زمني مدته 10 دقائق لمدة 48 ساعة) في المهد. اضبط الفاصل الزمني والمدة حسب التصميم التجريبي.
    8. انتقل إلى الحامل التالي ، وقم بإعداده بتكرار الخطوات 5.2.3-5.2.7.
  3. تحضير لوحات CIM
    1. قبل ساعة واحدة من بدء قياس مقاومة الخلية ، املأ آبار الغرفة السفلية للوحة CIM ب 160 ميكرولتر من DMEM تحتوي على مصل 10٪ أو جاذبات كيميائية أخرى.
    2. قم بتجميع الغرفة العلوية التي تحتوي على الآبار المطلية بالهلام ECM (للغزو) أو الآبار غير المطلية (للترحيل) مع الغرفة السفلية.
    3. أضف 50 ميكرولتر من وسط المصل المنخفض إلى آبار الغرفة العلوية للوحة CIM لفحص هجرة الخلايا ، وضع لوحة CIM في مهد النظام.
    4. انقر فوق علامة التبويب الرسالة ، وتأكد من عرض رسالة Connections ok . لوحة CIM جاهزة الآن للتجربة.
    5. احتضان لوحة CIM المجمعة في حاضنة CO2 لمدة 30-60 دقيقة قبل تحليل الخلية في الوقت الفعلي لتأقلم لوحة CIM مع حالة الثقافة.

6. تحليل الخلايا في الوقت الحقيقي وتصدير البيانات

ملاحظة: قم بإجراء قراءة خط الأساس وبذر الخلايا وقياس مقاومة الخلية وتصدير البيانات كما هو موضح سابقا11.

  1. قراءة خط الأساس
    ملاحظة: يجب قراءة خط الأساس بعد تأقلم لوحة CIM وقبل إضافة الخلايا إلى آبار الغرفة العلوية.
    1. انقر فوق الزر "ابدأ" لكل مهد. عند ظهور نافذة حفظ باسم ، احفظ الملف التجريبي لتنفيذ قراءة الخط الأساسي.
  2. بذر الخلايا
    1. قم بإزالة لوحة CIM من المهد ، وضعها في خزانة السلامة البيولوجية على حامل اللوحة.
    2. أضف 100 ميكرولتر (تحتوي على 100000 خلية) من الخلايا الكهربائية إلى آبار الغرفة العلوية للوحة CIM وفقا للبرنامج الموجود في وحدة التحكم. قم بتطبيق طريقة السحب العكسي مع تجنب فقاعات الهواء.
    3. اترك لوحة CIM أسفل خزانة السلامة الحيوية لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة للتأكد من انتشار الخلايا بالتساوي في قاع البئر.
  3. قياس مقاومة الخلية
    1. انقل لوحة CIM المجمعة بالكامل إلى المهد المعني. انقر فوق الزر "ابدأ " لبدء قياس مقاومة الخلية للخطوة الثانية.
    2. انقر فوق علامة التبويب Plot ، ثم انقر فوق الزر Add All ، وحدد مربعات Average و STD DEV لتصور البيانات في الوقت الفعلي.
      ملاحظة: خيار التخطيط الافتراضي هو الوقت للمحور السيني وفهرس الخلية للمحور ص. يسمح قسم تحديد قطعة الأرض للمستخدم بتحديد خيارات بديلة للمحور ص: فهرس الخلية الطبيعي أو فهرس خلية دلتا. بمجرد إجراء المسح النهائي ، تكتمل التجربة ، ويتم حفظ النتائج تلقائيا.
  4. تصدير البيانات للتحليل
    1. انقر فوق علامة التبويب Plot وحدد مربعات Average و STD DEV لنسخ البيانات لكل بئر على حدة.
    2. انقر بزر الماوس الأيمن فوق منطقة الرسم ، وحدد نسخ البيانات بتنسيق القائمة.
    3. افتح ملف جدول بيانات فارغا، والصق البيانات، ثم احفظ الملف.
    4. ارجع إلى برنامج التحليل ، وانقر فوق علامة التبويب Plate لكل مهد ، وحدد Release لإغلاق تجربة المهد.
    5. ارجع إلى ملف جدول البيانات، واضبط وقت البيانات الأولية بحيث يصبح وقت البدء في الخطوة الثانية هو وقت البدء الفعلي للقياس.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

النتائج

تلعب بروتينات Crk و CrkL أدوارا مهمة في حركة العديد من أنواع الخلايا ، بما في ذلك الخلايا العصبية22 والخلايا التائية23 والخلايا الليفية 18,19 ومجموعة متنوعة من الخلايا السرطانية 13. منذ أن تم الإبلاغ عن ارتفاع بروتينات Crk و CrkL ?...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

الهجرة والغزو هي سمات مهمة للخلايا السرطانية. يوفر قياس حركة الخلايا السرطانية وفهم الآلية الأساسية التي تتحكم في حركة الخلايا السرطانية رؤى مهمة في التدخلات العلاجية 2,27. تم تطوير عدة طرق لدراسة هجرة الخلايا7. يعد فحص التئام الجروح باستخدام ال...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

ليس لدى المؤلفين أي تضارب في المصالح للكشف عنه.

Acknowledgements

يشكر المؤلفون مركز الكتابة الطبية في رحمة الأطفال في مدينة كانساس سيتي لتحرير هذه المخطوطة. تم دعم هذا العمل من قبل مؤسسة ناتالي A.R.T. (إلى TP) ومنحة المجلس الاستشاري لشركاء MCA من مستشفى الرحمة للأطفال (CMH) ومركز السرطان بجامعة كانساس (KUCC) (إلى TP).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
AlphaImager HPProteinSimple92-13823-00Agarose gel imaging system
α-Tubulin antibodySigmaT9026Used to detect α-tubulin protein (dilution 1:3,000)
CIM-plate 16Agilent Technologies, Inc5665825001Cell invasion and migration plates
Crk antibodyBD Biosciences610035Used to detect CrkI and CrkII proteins (dilution 1:1,500)
CrkL antibodySanta Cruzsc-319Used to detect CrkL protein (dilution 1:1,500)
Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium (DMEM)ATCC302002Cell culture medium
Dulbecco's phosphate-buffered saline (DPBS)Corning21-031-CVBuffer used to wash cells
Fetal bovine serum (FBS)HycloneSH30910.03Culture medium supplement
Heracell VIOS 160i CO2 incubatorThermo Scientific51030285CO2 incubator
IRDye 800CW goat anti-mouse IgG secondary antibodyLi-Cor926-32210Secondary antibody for Western blot analysis (dilution 1:10,000)
IRDye 800CW goat anti-rabbit IgG secondary antibodyLi-Cor926-32211Secondary antibody for Western blot analysis  (dilution 1:10,000)
Lithium chloride InvitrogenAM9480Used for RNA precipitation
Matrigel matrixCorning354234Extracellular matrix (ECM) gel
MEGAscript T7 transcription kitInvitrogenAM1334Used for RNA synthesis
Millennium RNA markersInvitrogenAM7150Used for formaldehyde agarose gel electrophoresis
Mini centrifugeISC BioExpressC1301P-ISCUsed to spin down cells
Mouse brain QUICK-Clone cDNATaKaRa637301Source of genes (inserts) for cloning
NanoQuantTecanM200PRONucleic acid quantification system
Neon electroporation system ThermoFisher ScientificMPK5000Electroporation system1
Neon transfection system 10 µL kitThermoFisher ScientificMPK1025Electroporation kit
Neon transfection system 100 µL kitThermoFisher ScientificMPK10096Electroporation kit
NorthernMax denaturing gel bufferInvitrogenAM8676Used for formaldehyde agarose gel electrophoresis
NorthernMax formaldehyde load dyeInvitrogenAM8552Used for formaldehyde agarose gel electrophoresis
NorthernMax running bufferInvitrogenAM8671Used for formaldehyde agarose gel electrophoresis
Nuclease-free waterTeknovaW3331Used for various reactions during mRNA synthesis
Odyssey CLx ImagerLi-CorImager for Western blot analysis
pcDNA3.1/myc-HisInvitrogenV80020The vector into which inserts (mouse CrkI and CrkL cDNAs) were cloned
pFLAG-CMV-5aMillipore SigmaE7523Source of the FLAG epitope tag
Phenol:chloroform:isoamyl alcohol SigmaP2069Used for DNA extraction
PmeINew England BioLabsR0560LUsed to linearize the plasmids for mRNA synthesis
Poly(A) tailing kitInvitrogenAM1350Used for poly(A) tail reaction
Polystyrene tissue culture dish (100 x 20 mm style)Corning353003Used for culturing cells before transfection
Polystyrene tissue culture dish (35 x 10 mm style)Corning353001Used for culturing transfected cells
Proteinase KInvitrogen25530049Used to remove protein in the reaction mixture
Purifier Axiom Class II, Type C1Labconco Corporation304410001Biosafety cabinet for sterile handling of cells
Resuspension Buffer RThermoFisher ScientificA buffer included in the electroporation kits, MPK1025 and MPK10096. The buffer is used to resupend cells before electroporation, and its composition is proprietary information.
RNaseZapInvitrogenAM9780RNA decontamination solution
ScepterMilliporeC85360Handheld automated cell counter 
ScriptCap 2'-O-methyltransferase kitCellscriptC-SCMT0625Used for capping reaction
ScriptCap m7G capping systemCellscriptC-SCCE0625Used for capping reaction
Sodium dodecyl sulfate solutionInvitrogen15553-035Detergent used for the proteinase K reaction
Sorvall Legend XT centrifugeThermo Scientific75004532Benchtop centrifuge to spin down cells
Trypsin-EDTAGibco25300-054Used for dissociation of cells
U-118MG ATCCHTB15An adherent cell line derived from a human glioblastoma patient
Vinculin antibodySigmaV9131Used to detect vinculin protein (dilution 1:100,000)
xCELLigence RTCA DPAgilent Technologies, Inc380601050Instrument used for real-time cell analysis
1Electroporation parameters and other related information for various cell lines are available on the manufacturer's homepage (https://www.thermofisher.com/us/en/home/life-science/cell-culture/transfection/neon-transfection-system/neon-transfection-system-cell-line-data.html?).

References

  1. Palmer, T. D., Ashby, W. J., Lewis, J. D., Zijlstra, A. Targeting tumor cell motility to prevent metastasis. Advanced Drug Delivery Reviews. 63 (8), 568-581 (2011).
  2. Eccles, S. A., Box, C., Court, W. Cell migration/invasion assays and their application in cancer drug discovery. Biotechnology Annual Review. 11, 391-421 (2005).
  3. Kluiver, T. A., Alieva, M., van Vuurden, D. G., Wehrens, E. J., Rios, A. C. Invaders exposed: Understanding and targeting tumor cell invasion in diffuse intrinsic pontine glioma. Frontiers in Oncology. 10, 92(2020).
  4. Xie, Q., Mittal, S., Berens, M. E. Targeting adaptive glioblastoma: An overview of proliferation and invasion. Neuro-Oncology. 16 (12), 1575-1584 (2014).
  5. Wee, Y., Wang, T., Liu, Y., Li, X., Zhao, M. A pan-cancer study of copy number gain and up-regulation in human oncogenes. Life Sciences. 211, 206-214 (2018).
  6. Zhao, M., Liu, Y., Qu, H. Expression of epithelial-mesenchymal transition-related genes increases with copy number in multiple cancer types. Oncotarget. 7 (17), 24688-24699 (2016).
  7. Pijuan, J., et al. In vitro cell migration, invasion, and adhesion assays: From cell imaging to data analysis. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 7, 107(2019).
  8. Park, T., Large, N., Curran, T. Quantitative assessment of glioblastoma phenotypes in vitro establishes cell migration as a robust readout of Crk and CrkL activity. The Journal of Biological Chemistry. 296, 100390(2021).
  9. Urcan, E., et al. Real-time xCELLigence impedance analysis of the cytotoxicity of dental composite components on human gingival fibroblasts. Dental Materials. 26 (1), 51-58 (2010).
  10. Limame, R., et al. Comparative analysis of dynamic cell viability, migration and invasion assessments by novel real-time technology and classic endpoint assays. PLoS One. 7 (10), e46536(2012).
  11. Mudduluru, G., Large, N., Park, T. Impedance-based real-time measurement of cancer cell migration and invasion. Journal of Visualized Experiments. (158), e60997(2020).
  12. Feller, S. M. Crk family adaptors-signalling complex formation and biological roles. Oncogene. 20 (44), 6348-6371 (2001).
  13. Park, T. Crk and CrkL as therapeutic targets for cancer treatment. Cells. 10 (4), 739(2021).
  14. Verbeke, R., Lentacker, I., De Smedt, S. C., Dewitte, H. The dawn of mRNA vaccines: The COVID-19 case. Journal of Controlled Release. 333, 511-520 (2021).
  15. Heine, A., Juranek, S., Brossart, P. Clinical and immunological effects of mRNA vaccines in malignant diseases. Molecular Cancer. 20 (1), 52(2021).
  16. Kwon, H., et al. Emergence of synthetic mRNA: In vitro synthesis of mRNA and its applications in regenerative medicine. Biomaterials. 156, 172-193 (2018).
  17. Campillo-Davo, D., et al. The ins and outs of messenger RNA electroporation for physical gene delivery in immune cell-based therapy. Pharmaceutics. 13 (3), 396(2021).
  18. Park, T., Koptyra, M., Curran, T. Fibroblast growth requires CT10 regulator of kinase (Crk) and Crk-like (CrkL). The Journal of Biological Chemistry. 291 (51), 26273-26290 (2016).
  19. Park, T. J., Curran, T. Essential roles of Crk and CrkL in fibroblast structure and motility. Oncogene. 33 (43), 5121-5132 (2014).
  20. Chou, P. P., Jaynes, P. K., King, B. P., Chapman, E., Bailey, J. L. Precision comparison between conventional (method-I) and reverse (method-Ii) pipetting. Clinical Chemistry. 30 (6), 958(1984).
  21. Pushparaj, P. N. Revisiting the micropipetting techniques in biomedical sciences: A fundamental prerequisite in good laboratory practice. Bioinformation. 16 (1), 8-12 (2020).
  22. Park, T. J., Curran, T. Crk and Crk-like play essential overlapping roles downstream of disabled-1 in the Reelin pathway. The Journal of Neuroscience. 28 (50), 13551-13562 (2008).
  23. Huang, Y., et al. CRK proteins selectively regulate T cell migration into inflamed tissues. The Journal of Clinical Investigation. 125 (3), 1019-1032 (2015).
  24. Wang, L., et al. Signaling adaptor protein Crk is indispensable for malignant feature of glioblastoma cell line KMG4. Biochemical and Biophysical Research Communications. 362 (4), 976-981 (2007).
  25. Kumar, S., et al. Reciprocal regulation of Abl kinase by Crk Y251 and Abi1 controls invasive phenotypes in glioblastoma. Oncotarget. 6 (35), 37792-37807 (2015).
  26. Kumar, S., et al. Crk tyrosine phosphorylation regulates PDGF-BB-inducible Src activation and breast tumorigenicity and metastasis. Molecular Cancer Research. 16 (1), 173-183 (2018).
  27. Raudenska, M., et al. Engine shutdown: Migrastatic strategies and prevention of metastases. Trends in Cancer. 9 (4), 293-308 (2023).
  28. Decaestecker, C., Debeir, O., Van Ham, P., Kiss, R. Can anti-migratory drugs be screened in vitro? A review of 2D and 3D assays for the quantitative analysis of cell migration. Medicinal Research Reviews. 27 (2), 149-176 (2007).
  29. Farasani, A., Darbre, P. D. Long-term exposure to triclosan increases migration and invasion of human breast epithelial cells in vitro. Journal of Applied Toxicology. 41 (7), 1115-1126 (2021).
  30. Hanusova, V., Skalova, L., Kralova, V., Matouskova, P. The effect of flubendazole on adhesion and migration in SW480 and SW620 colon cancer cells. Anti-Cancer Agents in Medicinal Chemistry. 18 (6), 837-846 (2018).
  31. Lago-Baameiro, N., et al. PARK7/DJ-1 inhibition decreases invasion and proliferation of uveal melanoma cells. Tumori. 109 (1), 47-53 (2023).
  32. Escalona, R. M., et al. Knock down of TIMP-2 by siRNA and CRISPR/Cas9 mediates diverse cellular reprogramming of metastasis and chemosensitivity in ovarian cancer. Cancer Cell International. 22 (1), 422(2022).
  33. Mosca, L., et al. Effects of S-adenosyl-L-methionine on the invasion and migration of head and neck squamous cancer cells and analysis of the underlying mechanisms. International Journal of Oncology. 56 (5), 1212-1224 (2020).
  34. Zhao, Q., et al. VEGI174 protein and its functional domain peptides exert antitumour effects on renal cell carcinoma. International Journal of Oncology. 54 (1), 390-398 (2019).
  35. Witte, D., et al. TGF-beta1-induced cell migration in pancreatic carcinoma cells is RAC1 and NOX4-dependent and requires RAC1 and NOX4-dependent activation of p38 MAPK. Oncology Reports. 38 (6), 3693-3701 (2017).
  36. Bui, L. C., et al. Regulation of aquaporin 3 expression by the AhR pathway is critical to cell migration. Toxicological Sciences. 149 (1), 158-166 (2016).
  37. Tsuji, K., et al. Effects of different cell-detaching methods on the viability and cell surface antigen expression of synovial mesenchymal stem cells. Cell Transplantation. 26 (6), 1089-1102 (2017).
  38. Frandsen, S. K., McNeil, A. K., Novak, I., McNeil, P. L., Gehl, J. Difference in membrane repair capacity between cancer cell lines and a normal cell line. The Journal of Membrane Biology. 249 (4), 569-576 (2016).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

196 MRNA MRNA MRNA

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved