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In diesem Artikel

  • Zusammenfassung
  • Zusammenfassung
  • Einleitung
  • Protokoll
  • Ergebnisse
  • Diskussion
  • Offenlegungen
  • Danksagungen
  • Materialien
  • Referenzen
  • Nachdrucke und Genehmigungen

Zusammenfassung

Viele hochregulierte Gene stimulieren die Migration und Invasion von Tumorzellen, was zu einer schlechten Prognose führt. Es ist entscheidend zu bestimmen, welche Gene die Migration und Invasion von Tumorzellen regulieren. Dieses Protokoll stellt eine Methode vor, um die Auswirkungen der erhöhten Expression eines Gens auf die Migration und Invasion von Tumorzellen in Echtzeit zu untersuchen.

Zusammenfassung

Tumorzellen sind hochbeweglich und invasiv und weisen veränderte Genexpressionsmuster auf. Das Wissen, wie Veränderungen in der Genexpression die Migration und Invasion von Tumorzellen regulieren, ist unerlässlich, um die Mechanismen der Infiltration von Tumorzellen in benachbarte gesunde Gewebe und der Metastasierung zu verstehen. Zuvor wurde gezeigt, dass der Gen-Knockdown gefolgt von der impedanzbasierten Echtzeitmessung der Tumorzellmigration und -invasion die Identifizierung der Gene ermöglicht, die für die Migration und Invasion von Tumorzellen erforderlich sind. In jüngster Zeit haben die mRNA-Impfstoffe gegen SARS-CoV-2 das Interesse an der Verwendung synthetischer mRNA zu therapeutischen Zwecken erhöht. Hier wurde die Methode mit synthetischer mRNA überarbeitet, um den Effekt der Genüberexpression auf die Migration und Invasion von Tumorzellen zu untersuchen. Diese Studie zeigt, dass eine erhöhte Genexpression mit synthetischer mRNA-Transfektion gefolgt von impedanzbasierter Echtzeitmessung dazu beitragen kann, die Gene zu identifizieren, die die Migration und Invasion von Tumorzellen stimulieren. Diese Methodenarbeit liefert wichtige Details zu den Verfahren zur Untersuchung des Einflusses einer veränderten Genexpression auf die Migration und Invasion von Tumorzellen.

Einleitung

Die Motilität der Tumorzellen spielt eine entscheidende Rolle bei der Metastasierung 1,2. Die Ausbreitung von Tumorzellen in benachbarte und entfernte gesunde Gewebe erschwert die Krebsbehandlung und trägt zum Rezidiv bei 3,4. Daher ist es wichtig, die Mechanismen der Tumorzellmotilität zu verstehen und entsprechende therapeutische Strategien zu entwickeln. Da viele Tumorzellen veränderte Genexpressionsprofile aufweisen, ist es wichtig zu verstehen, welche Veränderungen im Genexpressionsprofil zu einer veränderten Tumorzellmotilität führen 5,6.

Es wurden mehrere Assays entwickelt, um die Zellmigration in vitro zu messen. Einige Assays liefern nur begrenzte Informationen, da sie Messungen nur zu bestimmten Zeitpunkten ermöglichen, während andere umfassende Informationen über die Tumorzellmotilität in Echtzeit bieten7. Obwohl viele dieser Zellmotilitätsassays quantitative Ergebnisse zu einem bestimmten Zeitpunkt oder am Endpunkt liefern können, liefern sie keine ausreichend detaillierten Informationen über dynamische Änderungen der Zellmigrationsrate während des Versuchszeitraums. Darüber hinaus kann es schwierig sein, mögliche Änderungen der Zellmigrationsrate in Abhängigkeit vom Versuchsdesign, den Zelltypen und der Zellanzahl zu untersuchen. Darüber hinaus können die Auswirkungen unkomplizierter Behandlungen durch die einfache Quantifizierung herkömmlicher Motilitätsassays untersucht werden, aber eine ausgefeiltere Quantifizierung kann erforderlich sein, um die komplexen Auswirkungen verschiedener kombinierter Behandlungen zu untersuchen8.

Es wurde einInstrument zur Überwachung des elektrischen Stroms einer Mikrotiterplatte entwickelt, die mit Mikroelektroden bedeckt ist. Die Adhäsion der Zellen an der Oberfläche der Vertiefung behindert den Elektronenfluss, und die Impedanz korreliert mit der quantitativen und qualitativen Bindung der Zellen. Das Vorhandensein der Mikroelektroden am Boden der Vertiefung ermöglicht die Messung der Zelladhäsion, -ausbreitung und -proliferation. Das Vorhandensein der Mikroelektroden unter einer mikroporösen Membran der oberen Kammer ermöglicht die Messung der Zellmigration und -invasion in die untere Kammer, wobei die obere Kammer mit extrazellulären Matrixproteinen (ECM) beschichtet ist, um eine Invasion zu ermöglichen10.

Zuvor wurde gezeigt, dass impedanzbasierte Echtzeitmessungen der Tumorzellmigration und -invasion während des gesamten Experiments Echtzeitdaten sowie sofortige Vergleiche und Quantifizierungen unter verschiedenen experimentellen Bedingungen liefern11. In dieser Methodenarbeit wurde der Gen-Knockdown induziert, um die Rolle von Proteinen von Interesse bei der Migration und Invasion von Tumorzellen zu testen. Da ein ausgewachsener Gen-Knockdown-Effekt unter den getesteten experimentellen Bedingungen 3-4 Tage nach der Elektroporation mit kleinen interferierenden RNAs (siRNAs)8 einsetzte, wurden die Zellen nach der Elektroporation neu plattiert und 3 Tage später für die impedanzbasierte Echtzeitmessung der Tumorzellmigration und -invasion erneut geerntet.

CT10-Regulator der Kinase (Crk) und Crk-like (CrkL) sind Adapterproteine, die Protein-Protein-Wechselwirkungen stromabwärts verschiedener Wachstumsfaktor-Rezeptorkinase-Signalwege und Nichtrezeptor-Tyrosinkinase-Signalwege vermitteln12. Erhöhte Spiegel von Crk und CrkL-Proteinen tragen zu einer schlechten Prognose bei mehreren menschlichen Krebsarten, einschließlich des Glioblastoms13, bei. Unklar ist allerdings, wie erhöhte Crk- und CrkL-Proteine zu einer schlechten Prognose führen. Daher ist es wichtig, den Effekt der Crk- und CrkL-Überexpression auf die Tumorzellfunktionen zu definieren. Zuvor wurde eine Gen-Knockdown-Studie durchgeführt, um zu zeigen, dass endogene Konzentrationen von Crk- und CrkL-Proteinen für die Migration und Invasion von Glioblastomzellen erforderlich sind8. Hier wurde ein modifiziertes Assay-System entwickelt, um den Effekt der Crk- und CrkL-Überexpression auf die Migration und Invasion von Tumorzellen zu untersuchen.

In jüngster Zeit haben die In-vitro-Synthese von mRNA und ihre therapeutischen Anwendungen durch die Entwicklung der mRNA-Impfstoffe gegen SARS-CoV-2 (überprüft von Verbeke et al.14) erneut Aufmerksamkeit erregt. Darüber hinaus wurden bemerkenswerte Fortschritte bei der Verwendung synthetischer mRNA bei Krebs und anderen Krankheiten erzielt15,16. Die Elektroporation von Zellen ist eine effektive Methode, um synthetische mRNA zu verabreichen und eine vorübergehende genetische Modifikation zu induzieren (überprüft von Campillo-Davo et al.17), und die Verwendung synthetischer mRNA ermöglicht eine schnelle und effiziente Genexpression in immortalisierten Fibroblasten 18. Diese Methodenarbeit kombiniert die Überexpression von Genen unter Verwendung synthetischer mRNA mit Echtzeit-Zellanalysen, um die Migration und Invasion von Tumorzellen zu untersuchen. Das experimentelle Schema, das für siRNAs verwendet wird, funktioniert jedoch nicht mit synthetischer mRNA-Transfektion, da der Gehalt an exogenen Proteinen schnell ansteigt und bei synthetischer mRNA-Transfektion allmählich abnimmt18. Daher wurde die Methode modifiziert, um die Echtzeitanalyse der Zellmigration und -invasion direkt nach der Transfektion durchzuführen, ohne die Zellen zusätzlich zu kultivieren.

Diese Methodenarbeit zeigt, dass die Kombination von impedanzbasierten Echtzeitmessungen mit der Transfektion von Tumorzellen mit synthetischen mRNAs eine schnelle und umfassende Analyse der Auswirkungen der Genhochregulierung auf die Migration und Invasion von Tumorzellen ermöglicht. In diesem Methodenpapier werden detaillierte Verfahren beschrieben, um zu messen, wie die Migration und Invasion von Glioblastomzellen durch die Überexpression von Crk und CrkL beeinflusst wird. Durch die Untersuchung der konzentrationsabhängigen Effekte von synthetischer mRNA auf die Tumorzellmigration wird in der Arbeit klar beschrieben, wie ein Anstieg des Proteinspiegels die Migration von Tumorzellen stimuliert. Darüber hinaus wird ein Ansatz zur Variation der Konzentration des ECM-Gels vorgestellt, um die Auswirkungen von Veränderungen der Genexpression auf die Tumorzellinvasion zu untersuchen.

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Protokoll

1. Synthese von mRNA

HINWEIS: Für die mRNA-Synthese müssen alle Reagenzien und Geräte speziell behandelt werden, um die RNasen vor der Verwendung zu inaktivieren. In der Materialtabelle finden Sie Details zu allen Materialien, Instrumenten und Reagenzien, die in diesem Protokoll verwendet werden.

  1. Linearisierung der DNA
    ANMERKUNG: Maus-cDNAs von CrkI und CrkL wurden in den pFLAG-CMV-5a-Expressionsvektor kloniert, um den FLAG-Epitop-Tag am C-Terminus hinzuzufügen, und in den pcDNA3.1/myc-Him-Vektor subkloniert, um den T7-Promotor einzubauen, wie zuvor beschrieben18,19.
    1. Geben Sie 10 μl 10x Reaktionspuffer, 1,5 μl PmeI (10.000 Einheiten/ml) und 10 μg einer Plasmid-DNA in ein Mikrozentrifugenröhrchen, um die Plasmid-DNA mit dem Restriktionsenzym zu linearisieren. Fügen Sie nukleasefreies Wasser hinzu, um das Reaktionsvolumen auf 100 μl zu bringen.
    2. Die Reaktionsmischung wird durch Abklopfen gemischt, geschleudert und über Nacht bei 37 °C inkubiert.
    3. 5 μl 10%iges Natriumdodecylsulfat (SDS) und 1 μl Proteinase K (20 mg/ml, RNA-Qualität) in die Reaktionsmischung geben. Durch Klopfen mischen, schleudern und 30 Minuten bei 50 °C inkubieren.
    4. Unter dem Abzug 100 μl der unteren Phase von Phenol:Chloroform:isoamylalkohol zur Extraktion in die Plasmidreaktionsmischung geben. Vortex, und dann bei 18.800 × g für 5 min bei Raumtemperatur zentrifugieren. Verschieben Sie die obere Phase in eine neue Röhre.
    5. Schritt 1.1.4 mit Chloroform:isoamylalkohol im Verhältnis 24:1 wiederholen.
    6. Im neuen Röhrchen wird das Reaktionsvolumen durch Zugabe von 200 μl nukleasefreiem Wasser auf 300 μl und dann durch Zugabe von 30 μl 3 M Natriumacetat und 600 μl 100%igem Ethanol auf 300 μl gebracht.
    7. Durch Vortexen mischen und dann 30-60 Minuten lang bei −20 °C für die Ethanolfällung der DNA platzieren.
    8. Bei 18.800 × g 20 min bei 4 °C zentrifugieren, den Überstand verwerfen und das Pellet mit 1 ml 70%igem Ethanol spülen. Wiederholen Sie die Zentrifugation für 10 Minuten und entfernen Sie dann den Überstand vollständig.
    9. Trocknen Sie 2 Minuten lang bei geöffneter Kappe, fügen Sie 30 μl nukleasefreies Wasser hinzu und resuspendieren Sie das DNA-Pellet.
    10. Bestimmen Sie die DNA-Konzentration mit einem Spektralphotometer.
    11. Überprüfen Sie die Größe und Menge der linearisierten DNA mit Hilfe der Agarose-Gelelektrophorese.
  2. RNA-Synthese mittels T7-RNA-Polymerase
    1. Geben Sie je 2 μl 10x Transkriptionspuffer, ATP, GTP, UTP, CTP und T7 und 1 μg einer linearisierten DNA in ein Mikrozentrifugenröhrchen. Fügen Sie nukleasefreies Wasser hinzu, um das Reaktionsvolumen auf 20 μl zu bringen.
    2. Die Reaktionsmischung wird durch Abklopfen gemischt, heruntergeschleudert und bei 37 °C für 2 h für die RNA-Synthese inkubiert.
    3. Schleudern Sie, fügen Sie 1 μl DNase (2 U/μl) hinzu und inkubieren Sie bei 37 °C für 15 Minuten, um die Template-DNA zu entfernen.
  3. Lithiumchlorid-Ausfällung der RNA
    1. 10 μl Lithiumchlorid (7,5 M) werden in das Reaktionsgemisch gegeben. Die Reaktionsmischung wird durch Abklopfen gemischt, geschleudert und 30 min lang bei −20 °C inkubiert.
    2. Bei 18.800 × g 20 min bei 4 °C zentrifugieren, den Überstand verwerfen und das Pellet mit 500 μl 70%igem Ethanol spülen. Wiederholen Sie die Zentrifugation für 10 Minuten und entfernen Sie dann den Überstand vollständig.
    3. Trocknen Sie 2 Minuten lang bei geöffneter Kappe, fügen Sie 30 μl nukleasefreies Wasser hinzu und resuspendieren Sie das RNA-Pellet.
  4. Bedeckend
    1. Erhitzen Sie die RNA-Probe 10 Minuten lang bei 65 °C und legen Sie sie dann zum Abkühlen auf Eis.
    2. Fügen Sie jeweils 5 μl 10x Capping-Puffer, 10 mM GTP und 1 mM (10x) S-Adenosylmethionin (SAM), jeweils 2 μl einer Capping-Enzymmischung und einer O-Methyltransferase-Enzymmischung und 1,25 μl RNase-Inhibitor hinzu. Das Reaktionsgemisch wird durch Abklopfen gemischt, heruntergeschleudert und 1 h lang bei 37 °C inkubiert.
  5. Poly(A)-Rückstände
    1. Schleudern Sie die Probe herunter und fügen Sie dann 6 μl nukleasefreies Wasser, 20 μl 5x E-PAP-Puffer, 10 μl 25 mM MnCl2, 10 μl 10 mM ATP und 4 μl E-PAP Poly(A)-Tailing-Enzym hinzu. Die Reaktionsmischung wird durch Abklopfen gemischt, geschleudert und 2 h lang bei 37 °C inkubiert.
  6. Lithiumchlorid-Fällung und Quantifizierung der synthetischen mRNA
    1. 50 μl Lithiumchlorid (7,5 m) zugeben und die Lithiumchloridfällung wie in den Schritten 1.3.1-1.3.3 beschrieben durchführen.
    2. Messen Sie die Konzentration der mRNA mit einem Spektralphotometer.
    3. Überprüfen Sie die Größe und Menge der mRNA mit Formaldehyd (1%-2%) Agarose (1%) Gelelektrophorese.

2. Extrazelluläre Matrix (ECM) Gelbeschichtung der Zellinvasions- und Migrationsplatten (CIM)

HINWEIS: Eine CIM-Platte (Cell Invasion and Migration) ist eine kommerziell hergestellte 16-Well-Platte für die impedanzbasierte Echtzeit-Zellanalyse. Für den Zellinvasionsassay werden die CIM-Platten mit ECM-Gel beschichtet, wie zuvor beschrieben, jedoch mit einigen Modifikationen11.

  1. Nehmen Sie ein Aliquot ECM-Gelbrühe aus dem Gefrierschrank und bewahren Sie es auf Eis auf.
  2. Verdünnen Sie das ECM-Gel (10 mg/ml) auf eine Arbeitskonzentration (100 μg/ml), indem Sie 990 μl Modified Eagle Medium (DMEM) von Dulbecco (ohne Serum oder Antibiotika) mit 10 μl ECM-Gel in einem Mikrozentrifugenröhrchen mischen. Durch vorsichtiges Pipettieren mischen.
  3. Geben Sie 60 μl verdünntes ECM-Gel in jede der 16 Vertiefungen der oberen Kammer der CIM-Platte. Wenden Sie die umgekehrte Pipettiermethode an und vermeiden Sie dabei Luftblasen20,21.
    HINWEIS: Optimieren Sie die Konzentration des ECM-Gels für jede Zelllinie. Für Glioblastom-Zelllinien wurde 0,1 μg/μL bis 1 μg/μL ECM-Gel zur Optimierung verwendet.
  4. Die obere Kammer der CIM-Platte mit abgenommener Plattenabdeckung für ca. 4 h auf eine schützende Kunststofffolie in einem CO2 -Inkubator legen, um eine Gelschicht zu bilden.
    VORSICHT: Während der Beschichtung der CIM-Platte mit ECM-Gel sollten die Elektroden der oberen Kammer der CIM-Platte keinen direkten Kontakt mit den Händen des Versuchsleiters oder den Oberflächen des Geräts, einschließlich der Biosicherheitswerkbank oder des CO2 - Inkubators, haben.

3. Präparation der Tumorzellen

HINWEIS: Alle Zellkulturmaterialien müssen steril aufbewahrt werden. Entnahme und Elektropolierung der Tumorzellen unter einer biologischen Sicherheitswerkbank mit geeigneter persönlicher Schutzausrüstung (PSA), wie zuvor beschrieben, jedoch mit einigen Modifikationen11.

  1. Kultivierung der Tumorzellen
    1. Kultur von U-118MG-Zellen in 10 ml DMEM mit 5 % fötalem Kälberserum (FBS) und 1 % Antibiotika pro 100 mm x 20 mm Polystyrol-Gewebekulturschale bei 37 °C in einem 5 % CO2 - Inkubator (Kulturbedingung).
  2. Serumdepletion der Tumorzellen
    HINWEIS: Die Exposition der Zellen gegenüber den in FBS vorhandenen Chemolockstoffen muss vor den Zellmigrations- und Invasionsassays durch Verwendung einer hohen Konzentration von FBS minimiert werden.
    1. Entfernen Sie das alte Medium und fügen Sie 10 ml vorgewärmtes DMEM hinzu, das 0,5 % FBS und 1 % Antibiotika pro Schale enthält (niedriges Serummedium).
    2. Wiederholen Sie Schritt 3.2.1.
    3. Die Zellen werden bei 37 °C in einem 5%igenCO2-Inkubator für 4 h oder länger inkubiert.
  3. Entnahme der Tumorzellen
    1. Entfernen Sie das alte Medium, fügen Sie 8 ml vorgewärmte phosphatgepufferte Kochsalzlösung (DPBS) von Dulbecco pro Schale hinzu, entfernen Sie das DPBS, fügen Sie vorgewärmtes 0,05%iges Trypsin-EDTA (2 ml/Schale) hinzu, um die Oberfläche zu bedecken, und inkubieren Sie 30 s lang im CO2 - Inkubator.
    2. Saugen Sie das Trypsin-EDTA vorsichtig ab, fügen Sie Serummedium (7 ml/Schale) hinzu und sammeln Sie dann die Zellen in einem 50-ml- oder 15-ml-Zentrifugenröhrchen.
    3. Aliquotieren Sie ein kleines Volumen von Zellen und verwenden Sie einen tragbaren automatischen Zellzähler, um die Zellen zu zählen.
    4. Berechnen Sie die Gesamtzahl der Zellen und das erforderliche Volumen für 10.000 Zellen/μl.
    5. Schleudern Sie die Zellen, indem Sie sie bei 100 × g für 5 Minuten bei Raumtemperatur zentrifugieren, saugen Sie den Überstand ab, fügen Sie das berechnete Volumen DMEM mit 0,5 % FBS (ohne Antibiotika) hinzu und resuspendieren Sie das Zellpellet vorsichtig.
    6. Für jede Behandlung werden 110 μl der Zellsuspension mit 1,1 Millionen Zellen in ein Mikrozentrifugenröhrchen überführt.
    7. Wiederholen Sie Schritt 3.3.6, um die Zellen für vier verschiedene Behandlungen in vier Mikrozentrifugenröhrchen zu überführen.
      HINWEIS: Eine CIM-Platte hat insgesamt 16 Vertiefungen. Entwerfen Sie vier verschiedene Behandlungen zum Vergleich, so dass jeder Behandlung vier Vertiefungen der CIM-Platte zugewiesen werden können. Verwenden Sie die elektroporierten Zellen für die folgenden Experimente: Western-Blot-Analysen (0,3 Millionen Zellen pro 35-mm-Gewebekulturschale), vier Wells mit Echtzeit-Zellmigrationsassays (0,1 Millionen Zellen/Well) und vier Wells mit Echtzeit-Zellinvasionsassays (0,1 Millionen Zellen/Well) für jede Behandlung. Passen Sie die Anzahl der Zellen an, die elektroporiert werden müssen, wenn sich das Versuchsdesign ändert.

4. Elektroporation der Tumorzellen

  1. Um das Medium zu entfernen, fügen Sie der Zellsuspension in jedem Röhrchen 1 ml DPBS hinzu, schleudern Sie die Zellsuspension dreimal für jeweils 10 s herunter, während Sie das Röhrchen alle 10 s mit einer Minizentrifuge um 180° drehen, und entfernen Sie den Überstand mit einer Mikropipette.
    HINWEIS: Es ist wichtig, ein kompaktes, aber leicht resuspendierbares Zellpellet zu bilden.
  2. Geben Sie 110 μl Resuspensionspuffer R in das Zellpellet, um 0,1 Millionen Zellen in 10 μl zu erhalten.
  3. Fügen Sie dem Zellpellet synthetische mRNA hinzu, um je nach gewünschtem Expressionsniveau eine Konzentration von 0,2-20 ng/μl zu erhalten. Mischen und resuspendieren Sie das Zellpellet vorsichtig durch Klopfen oder vorsichtiges Pipettieren.
    HINWEIS: Verwenden Sie verschiedene Konzentrationen synthetischer mRNA, untersuchen Sie die Proteinexpression mit Hilfe der Western-Blot-Analyse und bestimmen Sie die Konzentration der synthetischen mRNA, die zum gewünschten Expressionsniveau führt, um die spezifische Korrelation zwischen der Proteinexpression und biologischen Effekten zu untersuchen.
  4. Elektropolieren Sie 10 μl der Zellsuspension mit einem Elektroporationssystem bei 1.350 V für 10 ms mit jeweils drei Impulsen.
  5. Die elektroporierten Zellen werden in ein neues Mikrozentrifugenröhrchen mit 1,1 ml DMEM mit 0,5 % FBS überführt.
  6. Wiederholen Sie die Elektroporation, bis der Rest der Zellsuspension elektroporiert ist. Kombinieren Sie die elektroporierten Zellen im Mikrozentrifugenröhrchen, um 1,1 Millionen Zellen in 1,1 ml zu erhalten.
    HINWEIS: Sowohl 100-μl- als auch 10-μl-Elektroporationsspitzen können zum Elektropolieren eines großen Zellvolumens verwendet werden, aber die Elektroporationsspitzen für 10 μl und 100 μl sind in zwei separaten Kits enthalten und müssen separat erworben werden. Der Aufhängungspuffer R ist in beiden Kits enthalten.
  7. Nach Abschluss aller jeweiligen Elektroporationen werden die gepoolten Zellen vorsichtig resuspendiert.
  8. Platten Sie 0,3 Millionen Zellen in einer 35 mm x 10 mm großen Polystyrol-Gewebekulturschale mit 2 ml DMEM mit 5 % FBS und kultivieren Sie die Zellen 1 Tag lang unter Kulturbedingungen für die Gesamtzelllysatvorbereitung und Western-Blot-Analysen.
  9. Bewahren Sie den Rest der elektroporierten Zellen bei Raumtemperatur auf, bis das Echtzeit-Zellanalysesystem bereit ist.

5. Einrichten des Echtzeit-Zellanalysators, des Programms und der CIM-Platten

HINWEIS: Bereiten Sie den Echtzeit-Zellanalysator und zwei CIM-Platten vor, wie zuvor beschrieben11.

  1. Äquilibrierung des Echtzeit-Zellanalysators
    1. Bringen Sie den Echtzeit-Zellanalysator einige Stunden vor der Verwendung in einen CO2 - Inkubator, um das System unter den Kulturbedingungen auszugleichen.
  2. Einrichten des Analyseprogramms
    1. Öffnen Sie das Analyseprogramm, indem Sie auf dem Desktop auf das Symbol der Echtzeit-Zellanalysesoftware doppelklicken.
    2. Sobald die Option Standard-Experimentmuster-Setup geöffnet ist, wählen Sie die Option zum separaten Ausführen von drei Experimenten aus.
      HINWEIS: Jede Halterung verfügt über ein separates Fenster. Es gibt verschiedene Registerkarten, um das Messintervall und die Messdauer, die Datenanalyse und andere experimentelle Bedingungen einzurichten.
    3. Öffnen Sie jede Dockingstation, indem Sie auf die Registerkarte Nummer klicken.
    4. Klicken Sie auf die Registerkarte Experimentnotizen , wählen Sie den Ordner aus, in dem die Daten gespeichert werden sollen, und geben Sie den Namen des Experiments ein.
    5. Klicken Sie auf die Registerkarte Layout , richten Sie vierfache Wells für jede Behandlungsbedingung ein, indem Sie vier Wells gleichzeitig auswählen und die Probeninformationen eingeben, und klicken Sie dann auf Anwenden.
    6. Klicken Sie auf die Registerkarte Zeitplan | Fügen Sie einen Schritt hinzu , um den zweistufigen Modus der Zellimpedanzmessungen einzurichten. Klicken Sie dann auf Übernehmen , um den ersten Schritt einzurichten.
    7. Klicken Sie erneut auf Schritt hinzufügen, geben Sie 10 Minuten für das Intervall und 48 Stunden für die Dauer für Migration und Invasion ein und klicken Sie auf Anwenden, um den zweiten Schritt einzurichten.
      HINWEIS: Im ersten Schritt wird eine einmalige Baseline-Messung durchgeführt (ein Sweep mit einem Intervall von 1 Minute). Im zweiten Schritt wird die Zellimpedanz für das Experiment (z. B. 289 Sweeps mit einem 10-Minuten-Intervall für 48 Stunden) an der Halterung gemessen. Passen Sie das Intervall und die Dauer je nach Versuchsaufbau an.
    8. Wechseln Sie zur nächsten Dockingstation, und richten Sie sie ein, indem Sie die Schritte 5.2.3 bis 5.2.7 wiederholen.
  3. Vorbereitung der CIM-Platten
    1. Eine Stunde vor Beginn der Zellimpedanzmessung werden die Vertiefungen der unteren Kammer der CIM-Platte mit 160 μl DMEM gefüllt, das 10 % Serum oder andere Chemolockstoffe enthält.
    2. Montieren Sie die obere Kammer, die die gelbeschichteten ECM-Wells (für die Invasion) oder die unbeschichteten Wells (für die Migration) enthält, mit der unteren Kammer.
    3. Geben Sie 50 μl niedriges Serummedium in die Vertiefungen der oberen Kammer der CIM-Platte für den Zellmigrationsassay und legen Sie die CIM-Platte in die Halterung des Systems.
    4. Klicken Sie auf die Registerkarte Meldung, und stellen Sie sicher, dass die Meldung Verbindungen ok angezeigt wird. Die CIM-Platte ist nun bereit für das Experiment.
    5. Die montierte CIM-Platte wird vor der Echtzeit-Zellanalyse 30-60 min im CO2 -Inkubator vorinkubiert, um die CIM-Platte an die Kulturbedingungen zu gewöhnen.

6. Zellanalyse und Datenexport in Echtzeit

HINWEIS: Führen Sie eine Baseline-Messung, Zellimpfung, Zellimpedanzmessung und Datenexport durch, wie zuvor beschrieben11.

  1. Baseline-Ablesung
    HINWEIS: Die Baseline sollte abgelesen werden, nachdem die CIM-Platte akklimatisiert ist und bevor die Zellen in die Vertiefungen der oberen Kammer gegeben werden.
    1. Klicken Sie für jede Halterung auf die Schaltfläche Start . Wenn das Fenster " Speichern unter" angezeigt wird, speichern Sie die experimentelle Datei, um die Baseline-Messung durchzuführen.
  2. Aussaat von Zellen
    1. Nehmen Sie die CIM-Platte aus der Halterung und legen Sie sie in die Biosicherheitswerkbank auf den Plattenhalter.
    2. Geben Sie 100 μl (mit 100.000 Zellen) elektroporierte Zellen in die Vertiefungen der oberen Kammer der CIM-Platte gemäß dem Programm in der Steuereinheit. Wenden Sie die umgekehrte Pipettiermethode an und vermeiden Sie dabei Luftblasen.
    3. Lassen Sie die CIM-Platte 30 Minuten lang bei Raumtemperatur unter der Biosicherheitswerkbank, um sicherzustellen, dass sich die Zellen gleichmäßig auf dem Boden der Vertiefung verteilen.
  3. Messung der Zellimpedanz
    1. Schieben Sie die fertig montierte CIM-Platte zurück in die jeweilige Halterung. Klicken Sie auf die Schaltfläche Start , um die Zellimpedanzmessung für den zweiten Schritt zu starten.
    2. Klicken Sie auf die Registerkarte Zeichnen , klicken Sie dann auf die Schaltfläche Alle hinzufügen und aktivieren Sie die Kontrollkästchen Durchschnitt und STD DEV , um die Daten in Echtzeit zu visualisieren.
      Hinweis: Die Standard-Zeichnungsoption ist Zeit für die X-Achse und Zellenindex für die Y-Achse. Im Abschnitt Plotauswahl kann der Benutzer alternative Optionen für die Y-Achse auswählen: Normalisierter Zellenindex oder Delta-Zellenindex. Sobald der letzte Sweep durchgeführt wurde, ist das Experiment abgeschlossen, und die Ergebnisse werden automatisch gespeichert.
  4. Export der Daten zur Analyse
    1. Klicken Sie auf die Registerkarte Zeichnen und wählen Sie die Felder Durchschnitt und STD DEV aus, um die Daten für jede Vertiefung einzeln zu kopieren.
    2. Klicken Sie mit der rechten Maustaste auf die Zeichnungsfläche, und wählen Sie Daten im Listenformat kopieren aus.
    3. Öffnen Sie eine leere Tabellenkalkulationsdatei, fügen Sie die Daten ein, und speichern Sie die Datei.
    4. Kehren Sie zum Analyseprogramm zurück, klicken Sie für jede Halterung auf die Registerkarte Platte und wählen Sie Freigeben , um das Experiment für die Halterung zu schließen.
    5. Kehren Sie zur Tabellenkalkulationsdatei zurück und passen Sie die Zeit der Rohdaten so an, dass die Startzeit im zweiten Schritt zur tatsächlichen Startzeit für die Messung wird.

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Ergebnisse

Crk- und CrkL-Proteine spielen eine wichtige Rolle bei der Motilität vieler Zelltypen, darunter Neuronen22, T-Zellen23, Fibroblasten 18,19 und eine Vielzahl von Tumorzellen13. Da Crk- und CrkL-Proteine im Glioblastom24,25,26 erhöht sind, wurden in dieser Arbeit die Auswirkungen der Überexpression von CrkI, einer Spleißvariante von Crk,<...

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Diskussion

Migration und Invasion sind wichtige Merkmale von Tumorzellen. Die Messung der Motilität von Tumorzellen und das Verständnis des zugrunde liegenden Mechanismus, der die Tumorzellmotilität steuert, liefern wichtige Einblicke in therapeutische Interventionen 2,27. Es wurden mehrere Methoden entwickelt, um die Zellmigration zu untersuchen7. Der Wundheilungstest mit Kratzern oder Kultureinsätzen ist eine einfache und häufig verwendete Met...

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Offenlegungen

Die Autoren haben keine Interessenkonflikte offenzulegen.

Danksagungen

Die Autoren danken dem Medical Writing Center at Children's Mercy Kansas City für die Bearbeitung dieses Manuskripts. Diese Arbeit wurde von Natalies A.R.T. Foundation (an T.P.) und durch ein Stipendium des MCA Partners Advisory Board vom Children's Mercy Hospital (CMH) und dem University of Kansas Cancer Center (KUCC) (an T.P.) unterstützt.

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Materialien

NameCompanyCatalog NumberComments
AlphaImager HPProteinSimple92-13823-00Agarose gel imaging system
α-Tubulin antibodySigmaT9026Used to detect α-tubulin protein (dilution 1:3,000)
CIM-plate 16Agilent Technologies, Inc5665825001Cell invasion and migration plates
Crk antibodyBD Biosciences610035Used to detect CrkI and CrkII proteins (dilution 1:1,500)
CrkL antibodySanta Cruzsc-319Used to detect CrkL protein (dilution 1:1,500)
Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium (DMEM)ATCC302002Cell culture medium
Dulbecco's phosphate-buffered saline (DPBS)Corning21-031-CVBuffer used to wash cells
Fetal bovine serum (FBS)HycloneSH30910.03Culture medium supplement
Heracell VIOS 160i CO2 incubatorThermo Scientific51030285CO2 incubator
IRDye 800CW goat anti-mouse IgG secondary antibodyLi-Cor926-32210Secondary antibody for Western blot analysis (dilution 1:10,000)
IRDye 800CW goat anti-rabbit IgG secondary antibodyLi-Cor926-32211Secondary antibody for Western blot analysis  (dilution 1:10,000)
Lithium chloride InvitrogenAM9480Used for RNA precipitation
Matrigel matrixCorning354234Extracellular matrix (ECM) gel
MEGAscript T7 transcription kitInvitrogenAM1334Used for RNA synthesis
Millennium RNA markersInvitrogenAM7150Used for formaldehyde agarose gel electrophoresis
Mini centrifugeISC BioExpressC1301P-ISCUsed to spin down cells
Mouse brain QUICK-Clone cDNATaKaRa637301Source of genes (inserts) for cloning
NanoQuantTecanM200PRONucleic acid quantification system
Neon electroporation system ThermoFisher ScientificMPK5000Electroporation system1
Neon transfection system 10 µL kitThermoFisher ScientificMPK1025Electroporation kit
Neon transfection system 100 µL kitThermoFisher ScientificMPK10096Electroporation kit
NorthernMax denaturing gel bufferInvitrogenAM8676Used for formaldehyde agarose gel electrophoresis
NorthernMax formaldehyde load dyeInvitrogenAM8552Used for formaldehyde agarose gel electrophoresis
NorthernMax running bufferInvitrogenAM8671Used for formaldehyde agarose gel electrophoresis
Nuclease-free waterTeknovaW3331Used for various reactions during mRNA synthesis
Odyssey CLx ImagerLi-CorImager for Western blot analysis
pcDNA3.1/myc-HisInvitrogenV80020The vector into which inserts (mouse CrkI and CrkL cDNAs) were cloned
pFLAG-CMV-5aMillipore SigmaE7523Source of the FLAG epitope tag
Phenol:chloroform:isoamyl alcohol SigmaP2069Used for DNA extraction
PmeINew England BioLabsR0560LUsed to linearize the plasmids for mRNA synthesis
Poly(A) tailing kitInvitrogenAM1350Used for poly(A) tail reaction
Polystyrene tissue culture dish (100 x 20 mm style)Corning353003Used for culturing cells before transfection
Polystyrene tissue culture dish (35 x 10 mm style)Corning353001Used for culturing transfected cells
Proteinase KInvitrogen25530049Used to remove protein in the reaction mixture
Purifier Axiom Class II, Type C1Labconco Corporation304410001Biosafety cabinet for sterile handling of cells
Resuspension Buffer RThermoFisher ScientificA buffer included in the electroporation kits, MPK1025 and MPK10096. The buffer is used to resupend cells before electroporation, and its composition is proprietary information.
RNaseZapInvitrogenAM9780RNA decontamination solution
ScepterMilliporeC85360Handheld automated cell counter 
ScriptCap 2'-O-methyltransferase kitCellscriptC-SCMT0625Used for capping reaction
ScriptCap m7G capping systemCellscriptC-SCCE0625Used for capping reaction
Sodium dodecyl sulfate solutionInvitrogen15553-035Detergent used for the proteinase K reaction
Sorvall Legend XT centrifugeThermo Scientific75004532Benchtop centrifuge to spin down cells
Trypsin-EDTAGibco25300-054Used for dissociation of cells
U-118MG ATCCHTB15An adherent cell line derived from a human glioblastoma patient
Vinculin antibodySigmaV9131Used to detect vinculin protein (dilution 1:100,000)
xCELLigence RTCA DPAgilent Technologies, Inc380601050Instrument used for real-time cell analysis
1Electroporation parameters and other related information for various cell lines are available on the manufacturer's homepage (https://www.thermofisher.com/us/en/home/life-science/cell-culture/transfection/neon-transfection-system/neon-transfection-system-cell-line-data.html?).

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