JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • النتائج
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

يوفر هذا البروتوكول استراتيجية الجمع بين اثنين من الأعشاب لعلاج خلايا PC12 المصابة. يوفر البروتوكول مرجعا لتحسين أفضل طريقة تطبيق للطب الصيني التقليدي (TCM).

Abstract

في ضوء مزايا الجمع بين الطب الصيني التقليدي (TCM) في علاج نقص التروية الدماغية ، درسنا الاختلافات في الفعالية والآلية بين تركيبة التحضير ومجموعة المكونات من أجل استكشاف استراتيجية الجمع بين الأعشاب لعلاج خلايا PC12 المصابة. تم استخدام كلوريد الكوبالت (CoCl2) جنبا إلى جنب مع وسط خال من الجلوكوز للحث على الضرر التأكسدي لخلايا PC12. بعد ذلك ، تم اختيار المزيج الأمثل من حقن Astragalus mongholicus (Ast) وحقن Erigeron breviscapus (Eri) ودمجهما باتباع طرق تصميم موحدة بعد فحص تركيزهما الآمن والفعال على خلايا PC12. علاوة على ذلك ، تتكون تركيبة المكونات التي تم فحصها من 10 ميكرومتر أستراغالوسيد A ، و 40 ميكرومتر سكوتيلارين ، و 75 ميكرومتر حمض الكلوروجينيك في عشبين. بعد ذلك ، تم استخدام MTT و Annexin V-FITC / PI والتألق المناعي وتحليل اللطخة الغربية لتقييم فعالية وآلية تركيبة التحضير ومجموعة المكونات على خلايا PC12 المصابة. أظهرت النتائج أن تركيبة التحضير المثلى لبقاء الخلية كانت حقن Ast وكبسولة Eri بتركيز 6: 1.8 (ميكرومتر). كانت تركيبة المكونات (10 ميكرومتر أستراغالوسيد A ، 40 ميكرومتر سكوتيلارين ، و 75 ميكرومتر حمض الكلوروجينيك) أكثر فعالية من تركيبة التحضير. كلا المجموعتين خفضت بشكل ملحوظ معدل موت الخلايا المبرمج ، وكثافة مضان caspase-3 ، ومستوى أنواع الأكسجين التفاعلية داخل الخلايا (ROS). وفي الوقت نفسه ، قاموا بتنظيم مستويات التعبير من p-Akt / Akt و Bcl-2 / Bax و Nrf2. كانت هذه التأثيرات أكثر وضوحا في تركيبة المكونات. في الختام ، يمكن لكلا المجموعتين أن تمنع الإصابة التي يسببها CoCl2 جنبا إلى جنب مع وسيط خال من الجلوكوز على خلايا PC12 ، وبالتالي تعزيز بقاء الخلية. ومع ذلك ، قد تكون كفاءة تركيبة المكونات على تركيبة التحضير بسبب تنظيمها الأقوى لمسار إشارات PI3K / Akt / Nrf2 المتعلق بالإجهاد التأكسدي وموت الخلايا المبرمج.

Introduction

نقص التروية الدماغية المزمن ، الناجم عن نقص التروية الدماغية ، هو مرض شائع في منتصف العمر وكبار السن1. كمرض إقفاري خفي طويل الأمد ، يمكن أن يؤدي إلى خلل وظيفي عصبي تدريجي أو مستمر. وتشمل الآليات المرضية الرئيسية موت الخلايا المبرمج والضرر التأكسدي ، مما يؤدي إلى خلل وظيفي عصبي تدريجي أو مستمر. هذا هو الأساس المرضي لمرض الزهايمر ، والخرف الوعائي ، وأمراض أخرى ، ويؤثر بشكل خطير على نوعية حياة المرضى. ومع ذلك ، لا يزال هناك نقص في الأدوية المثالية في الطب الحديث لعلاج نقص التروية الدماغية المزمن2. في الوقت نفسه ، تم استخدام مزيج من Astragalus mongholicus (Ast) و Erigeron breviscapus (Eri) على نطاق واسع في الممارسة السريرية للطب الصيني التقليدي (TCM)4. تحسنت استراتيجية الجمع بشكل ملحوظ في تعزيز استعادة وظيفة الأعصاب بعد نقص التروية الدماغية ، وهو أفضل من دواء واحد. ومع ذلك ، هناك اختلافات كبيرة في نسبة الجرعة في الجمع بين العقارين4. المكونات الفعالة وآلية العمل ليست محددة بشكل جيد ، وهي القضية الرئيسية التي تقيد تطبيقها السريري.

أظهرت الدراسات السابقة التأثير التآزري لمزيج التحضير لحقن Ast وحقن Eri في علاج نقص التروية الدماغية في الفئران. يمكن أن ينظم التعبير عن بروتين p-Akt ويقلل من تنظيم التعبير عن بروتين Bcl-2 المرتبط بالموت (BAD) 5,6 ، وهو أحد بروتينات عائلة B-lymphoblastoma 2 (Bcl-2) وله تأثير في تعزيز موت الخلايا المبرمج. ومع ذلك ، فإن الأساس المادي وآلية تأثيره التآزري غير واضحين. علاوة على ذلك ، تم إنشاء نموذج إصابة خلايا PC12 باستخدام CoCl2 مجتمعة وسط خال من الجلوكوز ، وتم فحص تركيبة المكونات المثلى في Ast و Eriوتعريفها 7.

في هذه الدراسة ، يتم فحص الجرعات الفعالة من Ast و Eri باستخدام نموذج خلية PC12 المصاب. يتم فحص المزيج الأمثل من العقارين باستخدام هذا النموذج جنبا إلى جنب مع طريقة التصميم المتجانسة. يستخدم نموذج الخلية لإجراء مزيد من التقييم للاختلاف في تأثيرات وآليات تركيبة التحضير ومجموعة المكونات في خلايا PC12 المصابة. تهدف هذه الاستراتيجية إلى استكشاف التأثير الوقائي والآلية التنظيمية لنوعي المجموعات على خلايا PC12 المصابة من خلال مسار إشارة PI3K / Akt / Nrf2 لتحديد أفضل وضع توليفة. توفر هذه الدراسة مرجعا لتحسين أفضل وضع تطبيق للطب الصيني التقليدي.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

1. إعداد الكاشف

  1. تحضير الوسط الكامل بإضافة 90 مل من وسط السكر العالي DMEM ، و 10 مل من مصل الأبقار الجنينية (FBS) ، و 1 مل من محلول البنسلين والستربتومايسين في دورق مزرعة معقم سعة 125 مل. تخلط الوسط بالكامل وتخزن في درجة حرارة 4 درجات مئوية في ظروف مغلقة.
  2. قم بإعداد محلول CoCl 2 بإضافة 0.02 جم من مسحوق CoCl2 (وزنه بدقة) في 10 مل من وسط DMEM الخالي من السكر (مذاب تماما) للحصول على محلول مخزون 8.4 مليمتر. قم بتصفية المحلول بفلتر بكتيري 0.22 ميكرومتر ، وأغلقه ، وقم بتخزينه في 4 درجات مئوية بعيدا عن الضوء.
    ملاحظة: CoCl2 غير مستقر ويجب تخزينه في حاوية محكمة الإغلاق ، محمية من الضوء ؛ فترة صلاحية محلول CoCl2 هي 7 أيام.
  3. تحضير محلول الملح المخزن Tris-Hcl (TBST).
    1. تزن بدقة 8 غرام من كلوريد الصوديوم ، 0.2 غرام من كلوريد البوتاسيوم ، و 3 غرام من قاعدة تريس. أضفها إلى دورق سعة 1 لتر ، ثم أضف 1000 مل من ماء RO لإذابة الخليط.
    2. اضبط الرقم الهيدروجيني على 7.4 ، وأضف 1 مل من توين 20 ، واخلطه جيدا للحصول على محلول TBST.
      ملاحظة: يعمل Tween 20 كخافض للتوتر السطحي لتقليل الارتباط غير المحدد للأجسام المضادة بالمستضدات ويعمل بشكل أفضل عند تركيز 0.1٪.
  4. تحضير محلول MTT (3- (4،5-ثنائي ميثيل ثيازول -2) -2،5-ملح بروميد ثنائي فينيل تيترازوليوم) عن طريق وزن 0.1 جم من مسحوق MTT في 20 مل من محلول PBS للحصول على محلول مخزون 5 مجم / مل. قم بتصفية المحلول باستخدام مرشح بكتيري 0.22 ميكرومتر ، وأغلقه ، وقم بتخزينه في 4 درجات مئوية بعيدا عن الضوء ، وضعه في وضع الاستعداد.
    ملاحظة: مسحوق MTT غير مستقر ويمتص الرطوبة بسهولة ، لذلك يجب تخزينه في مكان مغلق وجاف بعيدا عن الضوء. تنتهي صلاحية حل MTT بعد 7 أيام. MTT له تأثير مسرطن ، لذلك تجنب الاتصال المباشر مع الجلد.
  5. قم بإعداد محلول كبسولة Eri عن طريق إزالة غلاف الكبسولة ووزنه بدقة 0.18 جم من المحتوى في 10 مل من الوسط الخالي من السكر DMEM لتحضير محلول مخزون 100 ميكرومتر (بناء على تركيز سكوتيلارين). قم بتصفية المحلول بفلتر بكتيري 0.2 ميكرومتر ، وأغلقه ، وقم بتخزينه في حاوية محكمة الإغلاق عند 4 درجات مئوية.
    ملاحظة: سكوتيلارين هو العنصر النشط الرئيسي في Erigeron breviscapus. تم تحديد تركيز سكوتيلارين في الكبسولات بواسطة HPLC-UV ليكون 2.56 مجم / جم ، أي 5.54 ميكرومول / جم8. يتم حساب تركيز المستحضر على أساس تركيز سكوتيلارين. هذا مناسب لتقييم النشاط الدوائي للتحضير والمكون.
  6. قم بإعداد محلول حقن Ast بإضافة 5 مل من الحقن و 5 مل من وسائط DMEM الخالية من السكر في أنبوب طرد مركزي معقم سعة 15 مل لتحضير محلول مخزون 60 ميكرومتر (بناء على تركيز أستراغالوسيد أ). قم بتصفية المحلول من خلال مرشح بكتيري 0.2 ميكرومتر ، وقم بتخزينه في حاوية محكمة الإغلاق عند 4 درجات مئوية.
    ملاحظة: حجم الحقن هو 10 مل لكل منهما ، وقد تم تحديد تركيز أستراغالوسيد A في الحقن بواسطة HPLC-ELSD ليكون 0.094 مجم / مل (أي 120 ميكرومتر)9. يجب أن يتم التحضير في خزانة السلامة الأحيائية وأن يتم تشغيله بطريقة مقاومة للضوء طوال الوقت. يجب قياس حجم محلول الحقن والوسط الخالي من السكر بدقة وخلطه جيدا.
  7. قم بإعداد محلول astragaloside A عن طريق وزن 7.85 مجم من معيار astragaloside A بدقة وحله تماما في 2 مل من ثنائي ميثيل سلفوكسيد (DMSO) لتحضير محلول مخزون 5000 ميكرومتر. قم بترشيحه بفلتر بكتيري 0.22 ميكرومتر وقم بتخزينه محكم الإغلاق عند 4 درجات مئوية.
    ملاحظة: مسحوق Astragaloside A غير قابل للذوبان في الوسط الخالي من السكر. عند تحضير المحلول ، قم بحله بالكمية المناسبة من DMSO للحفاظ على التركيز التجريبي النهائي ل DMSO أقل من 0.1٪ لضمان عدم وجود سمية خلوية.
  8. قم بإعداد محلول سكوتيلارين بوزن 11.56 مجم من معيار سكوتيلارين بدقة وحله بالكامل باستخدام 5 مل من وسط DMEM الخالي من السكر لتحضير محلول مخزون 5000 ميكرومتر. قم بترشيحه بفلتر بكتيري 0.22 ميكرومتر وقم بتخزينه محكم الإغلاق عند 4 درجات مئوية.
  9. قم بإعداد محلول حمض الكلوروجينيك بوزن 8.86 مجم من معيار حمض الكلوروجينيك بدقة وحله بالكامل باستخدام 5 مل من وسط DMEM الخالي من السكر لتحضير محلول مخزون 5000 ميكرومتر. قم بترشيحه بفلتر بكتيري 0.22 ميكرومتر وقم بتخزينه محكم الإغلاق عند 4 درجات مئوية.
    ملاحظة: مسحوق حمض الكلوروجينيك غير مستقر ويمتص الماء بسهولة. يجب أن تكون مختومة وتخزينها في 4 °C بعيدا عن الضوء. يجب تقليل وقت التعرض أثناء الوزن.

2. فحص صلاحية الخلية

  1. الحصول على خلايا PC12 وزرعها في DMEM مع 10٪ FBS و 100 وحدة / مل من البنسلين و 100 ميكروغرام / مل من الستربتومايسين.
    ملاحظة: في هذه الدراسة ، يتم الحصول على الخلايا من الأكاديمية الصينية للعلوم. خلايا PC12 هي خلايا ملتصقة لها الخصائص العامة لخلايا الغدد الصم العصبية وتستخدم على نطاق واسع في الفيزيولوجيا العصبية وعلم الأدوية العصبية.
  2. استزرع الخلايا عند 37 درجة مئوية في حاضنة مكملة بنسبة 5٪ CO 2 واستزرعها فرعيا كل2-3 أيام. استخدم الخلايا في الفقرات من 4 إلى 8 لجميع التجارب.
  3. زراعة الخلايا
    1. عالج خلايا PC12 في مرحلة النمو اللوغاريتمي (70٪ -80٪ التقاء الخلايا) باستخدام 1 مل من التربسين (0.25٪) ومراقبة الخلايا تحت المجهر. عندما تصبح الخلايا مستديرة ، أوقف هضم التربسين بإضافة 3 مل من الوسط الكامل.
    2. نقل الخلايا إلى أنبوب طرد مركزي معقم سعة 15 مل وطرد مركزي للخلايا بسرعة 840 × جم لمدة 5 دقائق. تخلص من المادة الطافية ، وأعد تعليقها باستخدام الوسط الكامل ، وانقل تعليق الخلية إلى أنبوب طرد مركزي دقيق سعة 1.5 مل. ثم احسب عدد الخلايا باستخدام مقياس التدفق الخلوي.
      1. ابدأ برنامج قياس التدفق الخلوي ، وحدد مضاعف التخفيف المقابل لمحلول الخلية في إعداد العد ، وانقر فوق مخطط الكثافة بعد تحميل عينة الخلية من أنبوب الطرد المركزي الدقيق سعة 1.5 مل.
      2. ضع دائرة حول عدد الخلايا بعيدا عن المحور X والمحور Y، وانقر بزر الماوس الأيمن فوق جدول البيانات أسفل الشكل، وحدد X وY وCount وAbs Count. تعطي البيانات الموجودة ضمن Abs Count في جدول البيانات نتيجة عد الخلايا.
    3. اضبط تركيز الخلية على 1 × 10 5 خلايا / مل ، وقم بتلقيح 100 ميكرولتر / بئر في 96 لوحة بئر ، واستزرع عند 37 درجة مئوية و5 ٪ CO2 في حاضنة لمدة 24 ساعة.
  4. فحص التركيزات الآمنة لعقارين على خلايا PC12 العادية
    1. قم بزراعة الخلايا كما هو موضح في الخطوات 2.1-2.2. تخلص من المادة الطافية ، وعالج الخلايا الطبيعية بتركيزات نهائية مختلفة من حقن Ast (4 و 8 و 12 و 16 و 20 و 24 ميكرومتر) وكبسولة Eri (0.625 و 1.25 و 2.5 و 5 و 10 و 20 ميكرومتر). عالج ستة آبار مكررة لكل مجموعة لمدة 24 ساعة.
      ملاحظة: تضاف الأدوية إلى الوسائط لتحقيق التركيز النهائي للدواء (المذكور في الخطوة 2.4.1) ، ثم يضاف حجم متساو من الوسائط إلى كل بئر. عند استنشاق المادة الطافية ، يجب وضع طرف الماصة برفق على جدار البئر لتجنب ملامسة الخلايا الموجودة في قاع البئر. عند إضافة حلول مختلفة ، قم بإضافتها برفق وسرعة على طول حواف الآبار ، وانتبه عند تغيير رأس مسدس الماصة لتجنب التأثير على النتائج التجريبية.
    2. تخلص من المادة الطافية ، وأضف 120 ميكرولتر من محلول MTT (1 مجم / مل) إلى كل بئر ، واحتضن الخلايا لمدة 4 ساعات عند 37 درجة مئوية.
    3. بعد الحضانة ، تخلص من المادة الطافية مرة أخرى وأضف 150 ميكرولتر من DMSO إلى كل بئر. رج الطبق لمدة 10 دقائق بسرعة 240 مرة / دقيقة (عدد الاهتزازات الأفقية في الدقيقة) باستخدام مذبذب دوامة.
    4. قم بقياس امتصاص كل عينة عند 490 نانومتر باستخدام قارئ الصفيحة الدقيقة. احسب صلاحية الخلية (٪) ، وهي امتصاص المجموعة المعالجة / امتصاص المجموعة الطبيعية (التحكم) × 100.
      ملاحظة: تأكد من أن حل MTT ضمن فترة الصلاحية ؛ إذا تغير اللون (إلى الأخضر الداكن) ، فلا يمكن استخدامه. عند اختبار امتصاص الخلايا ، يجب ضبط بئر فارغ (وسط الثقافة و MTT ، بدون خلايا أو أدوية) للقضاء على تداخل الكواشف الأخرى. يضاف حجم 150 ميكرولتر من DMSO إلى كل بئر ويهتز لمدة 10 دقائق لإذابة البلورات الزرقاء الأرجوانية بشكل أفضل. يجب الكشف عن الامتصاص في أقرب وقت ممكن لضمان دقة النتائج.
  5. فحص التركيزات الفعالة لعقارين على خلايا PC12 المصابة
    1. قم بزراعة الخلايا لمدة 24 ساعة كما هو مذكور في الخطوات 2.1-2.2 ، وتخلص من المادة الطافية ، ثم عالج الخلايا ب 20 ميكرولتر / بئر من CoCl2 (0.4 mM) مع الوسط الخالي من السكر.
    2. قم بمعالجة الخلايا في وقت واحد باستخدام 100 ميكرولتر / بئر من حقن Ast (التركيزات النهائية هي 2 و 6 و 8 و 10 و 12 ميكرومتر) أو 100 ميكرولتر من كبسولة Eri (التركيزات النهائية هي 1 و 2 و 3 و 4 و 5 ميكرومتر) عند 37 درجة مئوية لمدة 24 ساعة أخرى. أضف 120 ميكرولتر / بئر من الوسط الكامل إلى المجموعة الضابطة.
      ملاحظة: CoCl2 يحفز ظروف نقص الأكسجين في الخلايا.
    3. قم بقياس امتصاص كل عينة بطريقة MTT واحسب صلاحية الخلية كما هو موضح سابقا في الخطوتين 2.4.2 و 2.4.3.
  6. فحص المزيج الأمثل من دواءين بناء على طريقة التصميم المتجانسة
    ملاحظة: بعد الحصول على نطاق التركيز الفعال لحقن استراغالوس وكبسولة breviscapus ، تم استخدام طريقة التصميم الموحدة U 7 (7 4) للحصول على ست مجموعات مختلفة من الدواءين. حقن أست: كبسولة إيري: 1) 2: 2.6 ميكرومتر ، 2) 4: 5 ميكرومتر ، 3) 6: 1.8 ميكرومتر ، 4) 8: 4.2 ميكرومتر ، 5) 10: 1 ميكرومتر ، و 6) 12: 3.4 ميكرومتر.
    1. زراعة الخلايا كما هو موضح أعلاه في الخطوة 2.3.1 ، وعلاج خلايا PC12 المصابة بتركيزات ستة نسب من حقن Ast: كبسولة Eri كما هو مذكور أعلاه.
    2. عالج الخلايا لمدة 24 ساعة واحسب صلاحية الخلية كما هو موضح سابقا في الخطوتين 2.4.2 و 2.4.3.
  7. تقييم التأثير الوقائي لمجموعتين مثاليتين على خلايا PC12 المصابة
    ملاحظة: بعد الحصول على تركيبة التحضير المثلى (حقن Ast: كبسولة Eri من 6: 1.8 ميكرومتر) ومجموعة المكونات المثلى7 (10 ميكرومتر أستراغالوسيد A ، 40 ميكرومتر سكوتيلارين ، و 75 ميكرومتر حمض الكلوروجينيك) ، يتم إجراء مزيد من التقييم للتحقق من آثارها الوقائية على خلايا PC12 المصابة.
    1. قم بزراعة الخلايا كما هو موضح أعلاه في الخطوة 2.3.1 ، وعلاج خلايا PC12 المصابة بنوعين من مجموعات الأدوية كما تمت مناقشته في الملاحظة أعلاه.
    2. عالج الخلايا لمدة 24 ساعة واحسب صلاحية الخلية كما هو موضح سابقا في الخطوتين 2.4.2 و 2.4.3.

3. مقايسة Annexin V-FITC / PI لمعدل موت الخلايا المبرمج

  1. بذر خلايا PC12 في صفيحة مكونة من 12 بئرا بتركيز 1.3 × 105 خلايا / بئر واستزرعها عند 37 درجة مئوية لمدة 24 ساعة.
  2. تجميع الخلايا: المجموعة الضابطة ، المجموعة النموذجية ، ومجموعتين من الأدوية. أضف 1.2 مل/بئر من الوسط الكامل إلى المجموعة الضابطة، وأضف 1.2 مل/بئر من الوسائط التي تحتوي على 0.4 mM CoCl 2 إلى مجموعة النموذج، وأضف 1.2 مل/بئر من كل من المجموعتين اللتين تحتويان على 0.4 mM CoCl2. احتضان الخلايا عند 37 درجة مئوية لمدة 24 ساعة أخرى.
  3. بعد العلاج بالعقاقير ، عالج الخلايا ب 250 ميكرولتر / بئر من التربسين ، وانقل الخلايا في أنبوب طرد مركزي سعة 15 مل ، وأجهزة طرد مركزي بسرعة 840 xg لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة (RT). تخلص من المادة الطافية وأعد تعليق الحبيبات في 500 ميكرولتر من المخزن المؤقت للربط.
    1. احتضان الخلايا في الظلام مع 5 ميكرولتر من Annexin V-FITC و 10 ميكرولتر من يوديد البروبيديوم (PI) لمدة 15 دقيقة في RT ، ثم تحقق من موت الخلايا المبرمج عن طريق قياس التدفق الخلوي. ضع ثلاثة آبار مكررة في كل مجموعة.
      ملاحظة: لا يمكن أن يحتوي التربسين المستخدم في هذا الاختبار على EDTA لأن EDTA هو عامل مخلب أيون معدني يتنافس مع annexin V لربط أيونات الكالسيوم ويؤثر على تقارب الملحق ل PI. عندما يحدث موت الخلايا المبرمج ، يتحول الفوسفوسرين ، الموجود أصلا على الجانب الداخلي من غشاء الخلية ، إلى الخارج إلى سطح الخلية ، ويرتبط Annexin V-FITC بشكل انتقائي بالفوسفوسرين خارج الغشاء لإظهار التألق الأخضر.
    2. انقر فوق التعويض التلقائي في قائمة ابدأ ، وحدد FETC و PE و PerCP و APC في تحديد القناة ، وحدد التعويض في: الارتفاع. انقر فوق موافق في العنصر الإحصائي: الوسيط. باستخدام نفس طريقة عد الخلايا المذكورة في الخطوة 2.3.2 ، اجمع عينات الخلايا ، وانقر فوق خريطة الكثافة ، وقم بوضع دائرة حول مجتمع الخلية الفعال.
    3. باستخدام مضان FITC كمعلمة المحور X ، ومعلمات التألق الأخرى كمعلمة المحور Y ، قم بإنشاء خريطة كثافة. انقر فوق مصفوفة التعويض في قائمة ابدأ والمعامل في مصفوفة الفائض. يتم عرض معلومات خريطة الكثافة لتحليل معدل موت الخلايا المبرمج.

4. الكشف المناعي لجيل كاسباز -3

  1. قم بزرع خلايا PC12 على أغطية بكثافة 8 × 104 خلايا / غطاء ووضعها في 24 لوحة بئر عند 37 درجة مئوية لمدة 24 ساعة. قم بتجميع الخلايا كما هو مذكور أعلاه في الخطوة 3.2 ؛ قم بإعداد ثلاثة أغطية قابلة للتكرار لكل مجموعة.
  2. بعد العلاج بالعقاقير ، اشطف الأغطية مرتين باستخدام PBS (37 درجة مئوية) لمدة 5 دقائق لكل منهما ، وقم بتثبيتها بنسبة 4٪ بارافورمالدهيد لمدة 15 دقيقة ، ونفاذها باستخدام 0.5٪ Triton X-100 لمدة 20 دقيقة في RT.
  3. شطف الخلايا مرة أخرى ومنعها مع مصل الماعز 10 ٪ لمدة 1 ساعة في RT.
  4. احتضان كل غطاء ب 200 ميكرولتر من الجسم المضاد الأولي caspase-3 (بروتين تنفيذي رئيسي لموت الخلايا المبرمج) مخفف بتركيز 1: 250 في 1x TBST ، طوال الليل عند 4 درجات مئوية. اغسل ب 1x TBST (ثلاث مرات لمدة 3 دقائق لكل منهما) ، واحتضان 200 ميكرولتر من الجسم المضاد الثانوي (1: 300 تخفيف في 1x TBST) لمدة ساعة واحدة في RT في الظلام.
    ملاحظة: يتم إخماد التألق بسهولة ؛ وبالتالي ، بعد حضانة الجسم المضاد الثانوي ، يجب أن تبقى الشرائح بعيدا عن الضوء. يجب تخزين الأجسام المضادة الأولية والثانوية عند 4 درجات مئوية بعيدا عن الضوء.
  5. أضف 300 ميكرولتر من DAPI (0.5 ميكروغرام / مل) إلى أغطية الغطاء (للكشف عن النوى) لمدة 10 دقائق واغسل الخلايا ثلاث مرات باستخدام 1x TBST لمدة 5 دقائق لكل منها.
  6. راقب الأغطية تحت مجهر التألق والتقط الصور10. قم بإجراء تحليل إحصائي لشدة التألق باستخدام برنامج التصوير.
    ملاحظة: يجب أن تكون الشرائح وأغطية الغطاء المستخدمة نظيفة ومعقمة. عند التلوين ، انتبه إلى درجة الحموضة والتركيز ودرجة حرارة محلول الصباغة ، وتجنب التبريد الفلوري. يجب تشغيل المجهر الفلوري قبل 15 دقيقة على الأقل لتسخين المصباح الزئبقي مسبقا وإيقاف تشغيله لمدة 30 دقيقة قبل تشغيله مرة أخرى. عند الحصول على الصور ، يجب أن تكون معلمات التعرض لنفس الصبغة في نفس مجموعة التجارب متسقة لضمان دقة النتائج.

5. مقايسة التألق المناعي لمستوى أنواع الأكسجين التفاعلية

  1. زراعة وعلاج الخلايا كما تمت مناقشته في الخطوة 4.1.
  2. بعد العلاج بالعقاقير ، اغسل كل غطاء ثلاث مرات باستخدام PBS لمدة 3 دقائق ، واحتضانه ب 400 ميكرولتر من DCFH-DA (10 ميكرومتر) عند 37 درجة مئوية لمدة 20 دقيقة.
    ملاحظة: DCFH-DA هو مؤشر عالمي للإجهاد التأكسدي. لديها نفاذية غشاء الخلية ولا مضان. بمجرد دخوله الخلية ، يتم تحلله بواسطة الإستراز لإنتاج 2'،7'-dichlorodihydrofluorescein (DCFH) ثم يتأكسد بسرعة لإنتاج منتج فلوري قوي.
  3. اغسل الخلايا مرة أخرى باستخدام DMEM الخالي من المصل (مرتين لمدة 3 دقائق لكل منهما) وراقب على الفور قسيمة الغطاء بعد إضافة عامل التبريد الفلوري تحت مجهر التألق. احسب شدة التألق النسبية بواسطة برنامج التصوير.
    ملاحظة: بعد تحميل مسبار DCFH-DA ، تأكد من تنظيف المسبار المتبقي الذي لا يدخل الخلية ، وإلا ستصبح الخلفية عالية.

6. الكشف عن اللطخة الغربية لتعبير البروتين ل Nrf2 و p-Akt و Akt و Bcl-2 و Bax11,12

  1. تلقيح خلايا PC12 في 6 ألواح آبار بتركيز 1 × 106 خلايا / بئر ومزرعة عند 37 درجة مئوية لمدة 24 ساعة. قم بتجميع الخلايا ومعالجتها كما هو مذكور أعلاه في الخطوة 4.1 ، وقم بتعيين ثلاثة آبار مكررة في كل مجموعة.
  2. بعد العلاج بالعقاقير لمدة 24 ساعة ، اغسل الخلايا ثلاث مرات باستخدام PBS لمدة 5 دقائق لكل منها واحتضانها على الثلج لمدة 30 دقيقة في محلول تحلل معد. بعد التحلل ، قم بطرد الخلايا بالطرد المركزي لمدة 20 دقيقة عند 16000 × جم و 4 درجات مئوية وجمع المواد الطافية.
  3. الكشف عن تركيز البروتين وضبطه وفقا للتعليمات من خلال فحص برادفورد. تمييع العينات وتشويهها عند 100 درجة مئوية لمدة 10 دقائق.
    ملاحظة: يتكون مخزن التحلل من مثبط إنزيم الفوسفاتيز ومثبط الأنزيم البروتيني ومحللة RIPA بنسبة حجم 1:1:50. في المجموعة الضابطة ، يلزم 200 ميكرولتر / بئر من محلول التحلل ، و 100 ميكرولتر / بئر من محلول التحلل في المجموعات الأخرى. بشكل عام ، تركيزات البروتين في مجموعات التحكم والنموذج ونوعين من مجموعات التركيبات هي 0.45 مجم / مل و 0.25 مجم / مل و 0.32-0.39 مجم / مل على التوالي. تركيزات البروتين بعد التخفيف مع المخزن المؤقت للتحميل هي 0.36 و 0.2 و 0.256-0.312 مجم / مل على التوالي.
  4. للكشف عن البروتينات ذات الأوزان الجزيئية المختلفة ، قم بتحميل 25 ميكروغرام من البروتين في كل حارة ، وقم بتشغيل رحلان كهربائي SDS-PAGE بنسبة 12٪ ، وانقل الجل إلى أغشية PVDF.
    ملاحظة: أثناء تحضير جل SDS ، يجب خلطه بالكامل بدون فقاعات أو جزيئات غير قابلة للذوبان ؛ خلاف ذلك ، قد تحدث عصابات غير متساوية أو غير منتظمة. عند نقل الأغشية ، تأكد من عدم وجود فقاعات بين غشاء PVDF والهلام ؛ خلاف ذلك ، سوف تظهر بقع بيضاء في الشريط. بالإضافة إلى ذلك ، يجب تنفيذ هذه الخطوة في درجات حرارة منخفضة ، ويجب تغيير كيس الثلج كل 30 دقيقة.
  5. سد الأغشية بحليب خالي الدسم بنسبة 5٪ لمدة 1.5 ساعة عند RT واحتضان 5 مل من الأجسام المضادة الأولية المقابلة (Nrf2 1: 1,000 ، Akt 1: 2,000 ، p-Akt 1: 2,000 ، Bcl-2 1: 5,000 ، و Bax 1: 1,000) لمدة 24 ساعة عند 4 درجات مئوية. استخدم الجسم المضاد β-actin (1: 5,000) كعنصر تحكم داخلي.
  6. اغسل الأغشية باستخدام TBST (ثلاث مرات لمدة 10 دقائق لكل منها) ، ثم احتضن 5 مل من الأجسام المضادة الثانوية المترافقة HPR (1: 5000) عند RT لمدة 2 ساعة.
    ملاحظة: لا ينبغي تغيير نسبة تخفيف الأجسام المضادة بشكل تعسفي ، ويجب غسل الأغشية باستخدام TBST بما يتفق بدقة مع المتطلبات لتجنب أن يكون لون خلفية الشريط أسود جدا.
  7. أخيرا ، اغسل الغشاء باستخدام TBST مرة أخرى ، وعالجه بركيزة HRP المضيئة كيميائيا (وفقا لتعليمات الشركة المصنعة) للكشف عن شريط البروتين. التقط الصور باستخدام نظام التصوير الكيميائي وحدد القيم الرمادية للبروتينات باستخدام برنامج التصوير ، مع β-actin كعنصر تحكم داخلي مقارن.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

النتائج

يوضح الشكل 1 فحص المزيج الأمثل من حقن Ast وكبسولة Eri. يوضح الشكل 1 أ معدل بقاء الخلية لحقن Ast وكبسولة Eri على خلايا PC12 العادية. كانت صلاحية الخلية أقل من 95٪ مع حقن Ast بتركيزات أكبر من 12 ميكرومتر (الشكل 1 أ) وكبسولة إيري بتركيزات أكبر من 5 ميكرومتر (الشكل 1 ?...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

لا يزال هناك نقص في الأدوية المثالية لعلاج نقص التروية الدماغية في الممارسة السريرية الحديثة2. بتوجيه من تكملة qi وتفعيل طريقة الدورة الدموية ، تم استخدام Ast و Eri والمستحضرات الأخرى معا في الممارسة السريرية للطب الصيني التقليدي وحققت مزايا شاملة جيدة13،14<...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

يعلن المؤلفون عدم وجود تضارب في المصالح.

Acknowledgements

تم تمويل هذا البحث من خلال مشاريع البحث والتطوير الرئيسية التابعة لإدارة العلوم والتكنولوجيا بمقاطعة سيتشوان (2020YFS0325).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
1300 series class II biosafety cabinetThermo Fisher Scientific Instruments Company1374
3-(4,5-Dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromideGuangzhou saiguo biotech Company1334GR001MTT
ACEA NovoExpress 1.4.0ACEA Biosciences, Inc-
AktWuhan Three Eagles Proteintech Group, Inc10176-2-AP
Analytical flow cytometryThermo Fisher Scientific Instruments Company62-2-1810-1027-0
Annexin V-FITC apoptosis detection kitBeyotime Biotechnology CompanyC1062L
Astragalus injectionHeilongjiang Zhenbao Island Pharmaceutical CompanyA03190612144Ast injection
Astragaloside AChongqing Gao Ren Biotechnology Company84687-43-4
BaxWuhan Three Eagles Proteintech Group, Inc60267-1-Ig
BCA protein quantification kitBeyotime Biotechnology CompanyP0012
Bcl-2Wuhan Three Eagles Proteintech Group, Inc26593-1-AP
Carbon dioxide incubatorsThermo Fisher Scientific Instruments Company0816-2014
Caspase-3Wuhan Three Eagles Proteintech Group, Inc19677-1-AP
Chlorogenic acidChongqing Gao Ren Biotechnology Company327-97-9
Cobalt chloride hexahydrateMerck Biotechnology, Inc.7791-13-1CoCl2
Dimethyl sulfoxideGuangzhou saiguo biotech Company2020112701DMSO
Disodium hydrogen phosphate dodecahydrateChengdu Kolon Chemical Company2020090101
DMEM high sugar mediumThermo scientific Hyclone2110050
DMEM sugar free mediumBeijing Solarbio life sciences Company2029548
ECL luminous fluidLianshuo Biological CompanyWBKLS0500
Electronic balanceHaozhuang Hengping Scientific Instrument Co., Ltd., Shanghai, ChinaFA1204
Electrophoresis instrumentBio-Rad Laboratories (Shanghai) Co., Ltd1658026
Erigeron breviscapus capsuleYunnan Biogu Pharmaceutical CompanyZ53021671Eri capsule
Fetal bovine serumFour Seasons Institute of Biological Engineering20210402FBS
Fluorescent microscopeOlympms CorporationIX71-F32PH
Gel imagerBio-Rad Laboratories (Shanghai) Co., Ltd1708265
Goat anti-mouse secondary antibodyWuhan Three Eagles Proteintech Group, IncSA00001-1
Goat anti-rabbit secondary antibodyWuhan Three Eagles Proteintech Group, IncSA00001- 2
IBM SPSS Statistics version 26.0International Business Machines Corporation, USA-
ImageJ 1.8.0National Institutes of Health, USA-imaging software
Immunol fluorescence staining kitBeyotime Biotechnology CompanyP0196
KClChengdu Kolon Chemical Company2021070901
MarkerThermo Fisher Scientific Instruments Company26616
Microplate readerPerkin Elmer Corporate Management (Shanghai) Co.HH35L2018296
Motic Inverted microscopeNanda Scientific Instruments Co.AE2000LED
NaClChengdu Kolon Chemical Company2014081301
Nonfat milkBeyotime Biotechnology CompanyP0216
Nrf2Wuhan Three Eagles Proteintech Group, Inc16396-1-AP
P-AktWuhan Three Eagles Proteintech Group, Inc66444-1-Ig
PC12 cellsChinese Academy of SciencesCBP60430
Penicillin-Streptomycin solutionThermo scientific HycloneSV30010
Phosphatase protease inhibitor mixtureBeyotime Biotechnology CompanyP1045
Potassium dihydrogen phosphateChengdu Kolon Chemical Company2015082901
Reactive oxygen species assay kitBeyotime Biotechnology CompanyS0033S
RI-PA lysis solutionBeyotime Biotechnology CompanyP0013B
ScutellarinChongqing Gao Ren Biotechnology Company27740-01-8
SDS-PAGE sample loading buffer, 5xBeyotime Biotechnology CompanyP0015L
Sterile filter tips (0.22 µm)Merck Biotechnology, Inc.SLGP033RB
Tris-baseGuangzhou saiguo biotech Company1115GR500 TBS
TrypsinThermo scientific HycloneJ190013
Tween-20Chengdu Kolon Chemical Company2021051301
Vortex oscillatorOHAUS International Co., Ltd., Shanghai, ChinaVXMNAL
β-actinWuhan Three Eagles Proteintech Group, Inc66009-1-Ig

References

  1. Mendelevich, E. G. Chronic cerebral ischemia, and dizziness. Zhurnal Nevrologii i Psikhiatrii Imeni SS Korsakova. 122 (3), 22-26 (2022).
  2. Gao, L. Expert consensus on the diagnosis and treatment of chronic cerebral ischemia with integrated traditional Chinese and western medicine. Chinese Journal of Integrated Traditional and Western Medicine. 38 (10), 1161-1167 (2018).
  3. Luyu, S., Heng, L., Dengke, L. Combined treatment of 45 cases of cerebral infarction with Astragalus and Dengzhan Xixin injection. Jilin Journal of Traditional Chinese Medicine. 27 (4), 23-24 (2007).
  4. Bei, N., et al. Clinical study of Dengzhanxixin injection combined with Astragalus injection in the treatment of acute ischemic stroke. Journal of Basic Chinese Medicine. 21 (9), 1123-1127 (2015).
  5. Tian, F., et al. Optimal ratio of Astragalus injection combined with Dengzhan Xixin injection against cerebral ischemia-reperfusion injury in rats by baseline equal-ratio increase-decrease design method. China Pharmacy. 30 (14), 1885-1889 (2019).
  6. Li, J., et al. Protective effect and mechanism of Astragalus combined with Erigeron breviscapusin the best proportion on cerebral ischemia rats. Pharmacology and Clinics of Chinese Materia Medica. 35 (2), 104-108 (2019).
  7. Yan, Y., et al. Study on the oxidative damage of PC12 cells with hypoxia and hypoglycemia based on the combination of Astragalus and Dengzhan Asarum based on the Nrf2/HO-1 pathway. Pharmacology and Clinics of Chinese Materia Medica. 38 (2), 159-164 (2022).
  8. Chinese Pharmacopoeia, Dengzhan Asarum Granules. Volume I. , Available from: https://db.ouryao.com/yd2020/view.php?id=f27dcefa69 924(2020).
  9. Chinese Pharmacopoeia, Astragalus granules. Volume I. , Available from: https://db.ouryao.com/yd2020/view.php?id=fbcd0a8bf8 1592(2020).
  10. Liu, X., et al. N-linoleyltyrosine protects PC12 cells against oxidative damage via autophagy: Possible involvement of CB1 receptor regulation. International Journal of Molecular Medicine. 46 (5), 1827-1837 (2020).
  11. Fan, Y., et al. Gab1 regulates SDF-1-induced progression via inhibition of apoptosis pathway induced by PI3K/AKT/Bcl-2/BAX pathway in human chondrosarcoma. Tumor Biology. 37 (1), 1141-1149 (2016).
  12. Meng, M., Zhang, L., Ai, D., Wu, H., Peng, W. β-Asarone ameliorates β-Amyloid-induced neurotoxicity in PC12 cells by activating P13K/Akt/Nrf2 signaling pathway. Frontiers in Pharmacology. 12, 659955(2021).
  13. Li, J., Chen, H. Advances in the treatment of chronic cerebral ischemia with traditional Chinese and western medicine. Xinjiang Journal of Traditional Chinese Medicine. 39 (3), 115-118 (2021).
  14. Yu, M., Zhan, Q., Xu, X. Discussion on the therapeutic value of traditional Chinese medicine on cognitive dysfunction caused by chronic cerebral ischemia. Chinese Medicine Modern Distance Education of China. 11 (19), 155-157 (2013).
  15. Wang, M., Liu, J., Yao, M., Ren, J. Advances in research on pharmacological and neuroprotective effects of traditional Chinese medicine after cerebral ischemia. China Journal of Chinese Materia Medica. 45 (3), 513-517 (2020).
  16. Wang, N., Sun, H., Ma, X. Effects of different doses of astragalus injection on neurological rehabilitation of stroke patients. Chinese Journal of Clinical Rational Drug Use. 9 (13), 67-69 (2016).
  17. Sun, Y. Q. Effects of astragalus injection on apoptosis after cerebral ischemia-reperfusion in rats. Hebei Medicine. 22 (7), 1147-1149 (2016).
  18. Yang, L., et al. Dengzhan Xixin injection derived from a traditional Chinese herb Erigeron breviscapusameliorates cerebral ischemia/reperfusion injury in rats via modulation of mitophagy and mitochondrial apoptosis. Journal of Ethnopharmacology. 288, 114988(2022).
  19. Liao, Y., Ni, X., Zhan, C., Cai, Y. Clinical research progress of Dengzhanhua preparation in prevention and treatment of ischemic stroke and transient ischemic attack. Guangdong Medical Journal. 41 (9), 963-967 (2020).
  20. Li, C., Li, J., Xu, G., Sun, H. Influence of chronic ethanol consumption on apoptosis and autophagy following transient focal cerebral ischemia in male mice. Scientific Reports. 10 (1), 6164(2020).
  21. El Khashab, I. H., Abdelsalam, R. M., Elbrairy, A. I., Attia, A. S. Chrysin attenuates global cerebral ischemic reperfusion injury via suppression of oxidative stress, inflammation and apoptosis. Biomedicine Pharmacotherapy. 112, 108619(2019).
  22. Su, X., He, S., Chen, Z., Xie, X. Effect of breviscapine aglycone on PI 3 K/Akt conduction pathway in neonatal rats with hypoxic-ischemic brain injury. Journal of Armed Police Logistics College (Medical Edition). 27 (2), 93-96 (2018).
  23. Wang, X., Shi, C., Pan, H., Meng, X., Ji, F. MicroRNA-22 exerts its neuroprotective and angiogenic functions via regulating PI3K/Akt signaling pathway in cerebral ischemia-reperfusion rats). Journal of Neural Transmission. 127 (1), 35-44 (2020).
  24. Luca, M., Luca, A., Calandra, C. The role of oxidative damage in the pathogenesis and progression of alzheimer's disease and vascular dementia. Oxidative Medicine and Cellular Longevity. 2015, 504678(2015).
  25. Wang, Z., et al. Lupeol alleviates cerebral ischemia-reperfusion injury in correlation with modulation of PI3K/Akt pathway. Neuropsychiatric Disease and Treatment. 16 (8), 1381-1390 (2020).
  26. Li, H., et al. Neuroprotective effect of phosphocreatine on oxidative stress and mitochondrial dysfunction induced apoptosis in vitro and in vivo: Involvement of dual PI3K/Akt and Nrf2/HO-1 pathways. Free Radical Biology and Medicine. 120, 228-238 (2018).
  27. Muñoz-Sánchez, J., Chánez-Cárdenas, M. E. The use of cobalt chloride as a chemical hypoxia model. Journal of Applied Toxicology. 39 (4), 556-570 (2019).
  28. Tang, Y., et al. Salidroside attenuates CoCl2-simulated hypoxia injury in PC12 cells partly by mitochondrial protection. European Journal of Pharmacology. 912 (10), 174617(2021).
  29. Yin, L., et al. Neuroprotective potency of Tofu bio-processed using Actinomucor elegans against hypoxic injury induced by cobalt chloride in PC12 cells. Molecules. 26 (10), 2983(2021).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

189 Erigeron breviscapus PC12 PI3K AKT Nrf2

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved