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Resumen

Este protocolo proporciona una estrategia de combinación de dos hierbas para tratar las células PC12 lesionadas. El protocolo proporciona una referencia para optimizar el mejor modo de aplicación de la medicina tradicional china (MTC).

Resumen

En vista de las ventajas de la combinación de la medicina tradicional china (MTC) en el tratamiento de la isquemia cerebral, estudiamos las diferencias en la eficacia y el mecanismo entre la combinación de preparación y la combinación de componentes para explorar la estrategia de combinación de dos hierbas para tratar las células PC12 lesionadas. El cloruro de cobalto (CoCl2) combinado con un medio libre de glucosa se empleó para inducir el daño oxidativo de las células PC12. Luego, se seleccionó la combinación óptima de inyección de Astragalus mongholicus (Ast) y Erigeron breviscapus (Eri) y se combinó siguiendo métodos de diseño uniformes después de evaluar su concentración segura y efectiva en células PC12. Además, la combinación de componentes cribados comprende 10 μM de astragalósido A, 40 μM de escutelarina y 75 μM de ácido clorogénico en dos hierbas. Luego, se utilizaron MTT, anexina V-FITC / PI, inmunofluorescencia y análisis de Western blot para evaluar la eficacia y el mecanismo de la combinación de preparación y la combinación de componentes en células PC12 lesionadas. Los resultados mostraron que la combinación óptima de preparación para la pro-supervivencia celular fue la inyección de Ast y la cápsula de Eri con una concentración de 6:1.8 (μM). La combinación de componentes (10 μM de astragalósido A, 40 μM de escutelarina y 75 μM de ácido clorogénico) fue más efectiva que la combinación de preparación. Ambas combinaciones redujeron notablemente la tasa apoptótica, la intensidad de fluorescencia de la caspasa-3 y el nivel de especies reactivas intracelulares de oxígeno (ROS); mientras tanto, reguló al alza los niveles de expresión de p-Akt/Akt, Bcl-2/Bax y Nrf2. Estos efectos fueron más evidentes en la combinación de componentes. En conclusión, ambas combinaciones pueden inhibir la lesión inducida por CoCl2 combinado con un medio libre de glucosa en células PC12, promoviendo así la supervivencia celular. Sin embargo, la eficiencia de la combinación de componentes sobre la combinación de preparación puede deberse a su regulación más fuerte de la vía de señalización PI3K / Akt / Nrf2 relacionada con el estrés oxidativo y la apoptosis.

Introducción

La isquemia cerebral crónica, causada por hipoperfusión cerebral, es una enfermedad común en personas de mediana edad y ancianos1. Como una enfermedad de isquemia oculta a largo plazo, puede conducir a una disfunción neurológica progresiva o persistente. Los principales mecanismos patológicos incluyen la apoptosis celular y el daño oxidativo, lo que lleva a una disfunción neurológica progresiva o persistente; esta es la base patológica de la enfermedad de Alzheimer, la demencia vascular y otras enfermedades, y afecta seriamente la calidad de vida de los pacientes. Sin embargo, todavía hay una falta de medicamentos ideales en la medicina moderna para tratar la isquemia cerebral crónica2. Al mismo tiempo, la combinación de Astrágalo mongholicus (Ast) y Erigeron breviscapus (Eri) ha sido ampliamente utilizada en la práctica clínica de la medicina tradicional china (MTC)4. La estrategia de combinación ha mejorado notablemente en la promoción de la recuperación de la función nerviosa después de la isquemia cerebral, que es mejor que la de un solo fármaco; Sin embargo, existen grandes diferencias en la relación de dosis en la combinación de los dos fármacos4. Los componentes efectivos y el mecanismo de acción no están bien definidos, que es la cuestión clave que restringe su aplicación clínica.

Estudios previos han demostrado el efecto sinérgico de la combinación de preparación de la inyección de Ast y la inyección de Eri en el tratamiento de la isquemia cerebral en ratas. Puede regular al alza la expresión de la proteína p-Akt y regular negativamente la expresión de la proteína 5,6 promotora de la muerte asociada a Bcl-2 (BAD), que es una de las proteínas de la familia del linfoblastoma B 2 (Bcl-2) y tiene el efecto de promover la apoptosis. Sin embargo, la base material y el mecanismo de su efecto sinérgico no están claros. Además, el modelo de lesión de las células PC12 se estableció con CoCl2 combinado de medio libre de glucosa, y la combinación óptima de componentes en Ast y Eri ha sido examinada y definida7.

En este estudio, las dosis efectivas de Ast y Eri se examinan utilizando el modelo de células PC12 lesionadas. La combinación óptima de los dos fármacos se examina utilizando este modelo combinado con el método de diseño homogéneo. El modelo celular se utiliza para evaluar más a fondo la diferencia en los efectos y mecanismos de la combinación de preparación y la combinación de componentes en células PC12 lesionadas. Esta estrategia tiene como objetivo explorar el efecto protector y el mecanismo regulador de los dos tipos de combinaciones en células PC12 lesionadas a través de la vía de señal PI3K / Akt / Nrf2 para determinar el mejor modo de combinación. Este estudio proporciona una referencia para optimizar el mejor modo de aplicación de TCM.

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Protocolo

1. Preparación del reactivo

  1. Preparar el medio completo añadiendo 90 ml de medio DMEM con alto contenido de azúcar, 10 ml de suero fetal bovino (FBS) y 1 ml de solución de penicilina-estreptomicina en un matraz de cultivo estéril de 125 ml. Mezclar todo el medio y conservar a 4 °C en condiciones cerradas.
  2. Preparar la solución de CoCl 2 añadiendo 0,02 g de polvo de CoCl2 (pesado con precisión) en 10 ml de medio sin azúcar DMEM (disuelto completamente) para obtener una solución madre de 8,4 mM. Filtrar la solución con un filtro bacteriano de 0,22 μm, sellarla y almacenarla a 4 °C protegida de la luz.
    NOTA: El CoCl2 es inestable y debe almacenarse en un recipiente hermético, protegido de la luz; el período de validez de la solución de CoCl2 es de 7 días.
  3. Prepare la solución salina tamponada Tris-Hcl (TBST).
    1. Pese con precisión 8 g de cloruro de sodio, 0,2 g de cloruro de potasio y 3 g de Tris-base. Agréguelos en un vaso de precipitados de 1 L y luego agregue 1,000 ml de agua RO para disolver la mezcla.
    2. Ajuste el pH a 7.4, agregue 1 ml de Tween 20 y mezcle bien para obtener la solución TBST.
      NOTA: Tween 20 actúa como un surfactante para reducir la unión no específica de anticuerpos a antígenos y funciona mejor a una concentración del 0,1%.
  4. Preparar la solución MTT (sal de bromuro de 3-(4,5-dimetiltiazol-2)-2,5-difeniltetrazolio) pesando 0,1 g de polvo de MTT en 20 ml de solución de PBS para obtener una solución madre de 5 mg/ml. Filtrar la solución con un filtro bacteriano de 0,22 μm, sellarla y almacenarla a 4 °C lejos de la luz, colocada en modo de espera.
    NOTA: El polvo MTT es inestable y absorbe fácilmente la humedad, por lo que debe almacenarse en un lugar cerrado y seco, lejos de la luz. La solución MTT caduca después de 7 días. MTT tiene un efecto cancerígeno, así que evite el contacto directo con la piel.
  5. Prepare la solución de cápsula de Eri retirando la cubierta de la cápsula y pesando con precisión 0,18 g del contenido en 10 ml de medio sin azúcar DMEM para preparar una solución madre de 100 μM (basada en la concentración de escutelarina). Filtrar la solución con un filtro bacteriano de 0,2 μm, sellarla y guardarla en un recipiente hermético a 4 °C.
    NOTA: Scutellarin es el principal ingrediente activo en Erigeron breviscapus. La concentración de escutelarina en las cápsulas ha sido determinada por HPLC-UV en 2,56 mg/g, es decir, 5,54 μmol/g8. La concentración de la preparación se calcula en función de la concentración de escutelarina. Esto es conveniente para evaluar la actividad farmacológica de la preparación y el componente.
  6. Preparar la solución de la inyección de Ast añadiendo 5 ml de inyección y 5 ml de medio DMEM sin azúcar en un tubo centrífugo estéril de 15 ml para preparar una solución madre de 60 μM (basada en la concentración de astragalósido A). Filtrar la solución a través de un filtro bacteriano de 0,2 μm y almacenarla en un recipiente hermético a 4 °C.
    NOTA: El volumen de inyección es de 10 ml cada uno, y la concentración de astragalósido A en la inyección ha sido determinada por HPLC-ELSD en 0,094 mg/ml (es decir, 120 μM)9. La preparación debe llevarse a cabo en un gabinete de bioseguridad y operar de manera a prueba de luz en todo momento. El volumen de la solución inyectable y el medio sin azúcar deben medirse con precisión y mezclarse bien.
  7. Preparar la solución de astragalósido A pesando con precisión 7,85 mg de patrón de astragalósido A y disolverla completamente en 2 ml de dimetilsulfóxido (DMSO) para preparar una solución madre de 5.000 μM. Filtrarlo con un filtro bacteriano de 0,22 μm y almacenarlo herméticamente a 4 °C.
    NOTA: El polvo de astragalósido A es insoluble en el medio sin azúcar. Al preparar la solución, disolverla con la cantidad adecuada de DMSO para mantener la concentración experimental final de DMSO por debajo del 0,1% para garantizar que no haya citotoxicidad.
  8. Prepare la solución de escutelarina pesando 11,56 mg de scutellarin patrón con precisión y disolviéndola completamente con 5 ml de medio DMEM sin azúcar para preparar una solución madre de 5.000 μM. Filtrarlo con un filtro bacteriano de 0,22 μm y almacenarlo herméticamente a 4 °C.
  9. Preparar la solución de ácido clorogénico pesando 8,86 mg de ácido clorogénico patrón con precisión y disolverla completamente con 5 ml de medio DMEM sin azúcar para preparar una solución madre de 5.000 μM. Filtrarlo con un filtro bacteriano de 0,22 μm y almacenarlo herméticamente a 4 °C.
    NOTA: El polvo de ácido clorogénico es inestable y absorbe fácilmente el agua. Debe sellarse y almacenarse a 4 °C protegido de la luz; El tiempo de exposición debe minimizarse durante el pesaje.

2. Ensayo de viabilidad celular

  1. Obtenga células PC12 y críquelas en DMEM suplementado con 10% de FBS, 100 U/mL de penicilina y 100 μg/mL de estreptomicina.
    NOTA: En este estudio, las células se obtienen de la Academia China de Ciencias. Las células PC12 son células adherentes que tienen las características generales de las células neuroendocrinas y son ampliamente utilizadas en neurofisiología y neurofarmacología.
  2. Cultivar las células a 37 °C en una incubadora suplementada con 5% deCO2 y subcultivarlas cada 2-3 días. Use celdas en los pasajes 4-8 para todos los experimentos.
  3. Cultivo celular
    1. Tratar las células PC12 en la fase de crecimiento logarítmico (70%-80% de confluencia celular) con 1 mL de tripsina (0,25%) y observar las células bajo un microscopio. Cuando las células se vuelven redondas, detenga la digestión de tripsina agregando 3 ml del medio completo.
    2. Transfiera las células a un tubo centrífugo estéril de 15 ml y centrifugue las células a 840 x g durante 5 min. Deseche el sobrenadante, vuelva a suspender con el medio completo y transfiera la suspensión celular a un tubo de microcentrífuga de 1,5 ml. Luego cuente el número de células usando un citómetro de flujo.
      1. Inicie el software de citometría de flujo, seleccione el múltiplo de dilución correspondiente de la solución celular en la configuración de conteo y haga clic en Gráfico de densidad después de cargar la muestra de células desde el tubo de microcentrífuga de 1,5 ml.
      2. Encierre en un círculo la población de celdas lejos de los ejes X e Y, haga clic con el botón derecho en la tabla de datos situada debajo de la figura y seleccione X, Y, Recuento y Recuento de abdominales. Los datos bajo Recuento de Abs en la tabla de datos proporcionan el resultado del recuento de celdas.
    3. Ajustar la concentración celular a 1 x 10 5 células/ml, inocular 100 μL/pocillo en placas de 96 pocillos y cultivar a 37 °C y5 % deCO2 en una incubadora durante 24 h.
  4. Detección de concentraciones seguras de dos fármacos en células PC12 normales
    1. Cultive las células como se describe en los pasos 2.1-2.2. Deseche el sobrenadante y trate las células normales con diferentes concentraciones finales de inyección de Ast (4, 8, 12, 16, 20 y 24 μM) y cápsula de Eri (0.625, 1.25, 2.5, 5, 10 y 20 μM). Tratar seis pocillos replicados de cada grupo durante 24 h.
      NOTA: Los medicamentos se agregan a los medios para lograr la concentración final del medicamento (mencionada en el paso 2.4.1), y luego se agrega un volumen igual de medios a cada pocillo. Al aspirar el sobrenadante, la punta de la pipeta debe colocarse suavemente contra la pared del pozo para evitar el contacto con las células en el fondo del pozo. Al agregar diferentes soluciones, agréguelas suave y rápidamente a lo largo de los bordes de los pocillos, y preste atención al cambiar el cabezal de la pistola de pipetas para evitar afectar los resultados experimentales.
    2. Desechar el sobrenadante, añadir 120 μL de solución MTT (1 mg/ml) a cada pocillo e incubar las células durante 4 h a 37 °C.
    3. Después de la incubación, deseche nuevamente el sobrenadante y agregue 150 μL de DMSO a cada pocillo. Agite la placa durante 10 minutos a una velocidad de 240 veces/min (número de vibraciones horizontales por minuto) utilizando un oscilador de vórtice.
    4. Mida la absorbancia de cada muestra a 490 nm utilizando un lector de microplacas. Calcular la viabilidad celular (%), que es la absorbancia del grupo tratado/absorbancia del grupo normal (control) x 100.
      NOTA: Asegúrese de que la solución MTT esté dentro del período de validez; Si el color ha cambiado (a verde oscuro), no se puede utilizar. Al probar la absorbancia de las células, se debe configurar un pocillo en blanco (medio de cultivo y MTT, sin células ni fármacos) para eliminar la interferencia de otros reactivos. Se agrega un volumen de 150 μL de DMSO a cada pocillo y se agita durante 10 minutos para disolver mejor los cristales azul-púrpura. La absorbancia debe detectarse lo antes posible para garantizar la precisión de los resultados.
  5. Cribado de concentraciones efectivas de dos fármacos en células PC12 lesionadas
    1. Cultivar las células durante 24 h como se mencionó en los pasos 2.1-2.2, desechar el sobrenadante y luego tratar las células con 20 μL/pocillo de CoCl2 (0,4 mM) combinado con el medio sin azúcar.
    2. Tratar simultáneamente las células con 100 μL/pocillo de inyección de Ast (las concentraciones finales son 2, 6, 8, 10 y 12 μM) o 100 μL de cápsula de Eri (las concentraciones finales son 1, 2, 3, 4 y 5 μM) a 37 °C durante otras 24 h. Añadir 120 μL/pocillo de medio completo al grupo control.
      NOTA: CoCl2 induce condiciones hipóxicas en las células.
    3. Medir la absorbancia de cada muestra mediante el método MTT y calcular la viabilidad celular descrita anteriormente en los pasos 2.4.2 y 2.4.3.
  6. Cribado de la combinación óptima de dos fármacos basada en el método de diseño homogéneo
    NOTA: Después de obtener el rango de concentración efectiva de la inyección de astrágalo y la cápsula de breviscapus, se utilizó el método de diseño uniforme U 7 (7 4) para obtener seis combinaciones diferentes de los dos fármacos. Inyección de Ast: Cápsula de Eri: 1) 2:2.6 μM, 2) 4:5 μM, 3) 6:1.8 μM, 4) 8:4.2 μM, 5) 10:1 μM, y 6)12:3.4 μM.
    1. Cultive las células como se describió anteriormente en el paso 2.3.1 y trate las células PC12 lesionadas con seis concentraciones proporcionadas de Ast inyectable:Eri cápsula como se mencionó anteriormente.
    2. Tratar las células durante 24 h y calcular la viabilidad celular como se ha descrito anteriormente en los pasos 2.4.2 y 2.4.3.
  7. Evaluación del efecto protector de dos combinaciones óptimas en células PC12 lesionadas
    NOTA: Después de obtener la combinación de preparación óptima (inyección de Ast: cápsula de Eri de 6:1.8 μM) y la combinación óptima de componentes7 (10 μM de astragalósido A, 40 μM de escutelarina y 75 μM de ácido clorogénico), se realiza una evaluación adicional para verificar sus efectos protectores en las células PC12 lesionadas.
    1. Cultive las células como se describió anteriormente en el paso 2.3.1 y trate las células PC12 lesionadas con los dos tipos de combinaciones de fármacos como se discutió en la NOTA anterior.
    2. Tratar las células durante 24 h y calcular la viabilidad celular como se ha descrito anteriormente en los pasos 2.4.2 y 2.4.3.

3. Ensayo de anexina V-FITC/PI para la tasa de apoptosis

  1. Sembrar las células PC12 en una placa de 12 pocillos a una concentración de 1,3 x 105 células/pocillo y cultivarlas a 37 °C durante 24 h.
  2. Agrupe las células: grupo control, grupo modelo y dos combinaciones de fármacos. Agregue 1,2 ml/pocillo de medio completo al grupo control, agregue 1,2 ml/pocillo de medios que contengan 0,4 mM de CoCl 2 al grupo modelo y agregue 1,2 ml/pocillo de cada una de las dos combinaciones que contengan 0,4 mM de CoCl2. Incubar las células a 37 °C durante otras 24 h.
  3. Después del tratamiento farmacológico, tratar las células con 250 μL/pocillo de tripsina, transferir las células en un tubo de centrífuga de 15 ml y centrifugar a 840 xg durante 5 min a temperatura ambiente (RT). Desechar el sobrenadante y resuspender el pellet en 500 μL del tampón de unión.
    1. Incubar las células en la oscuridad con 5 μL de anexina V-FITC y 10 μL de yoduro de propidio (PI) durante 15 min en RT, y luego verificar la apoptosis por citometría de flujo. Establezca tres pozos replicados en cada grupo.
      NOTA: La tripsina utilizada en esta prueba no puede contener EDTA porque el EDTA es un agente quelante de iones metálicos que compite con la anexina V para unirse a los iones de calcio y afecta la afinidad de la anexina por PI. Cuando ocurre la apoptosis, la fosfoserina, originalmente en el lado interno de la membrana celular, gira hacia afuera hacia la superficie celular, y la anexina V-FITC se une selectivamente a la fosfoserina fuera de la membrana para mostrar fluorescencia verde.
    2. Haga clic en Compensación automática en el menú Inicio , seleccione FITC, PE, PerCP y APC en el canal Seleccionar y seleccione Compensación en: Altura. Haga clic en Aceptar en el elemento estadístico: Mediana. Con el mismo método de recuento de células mencionado en el paso 2.3.2, recoja las muestras de células, haga clic en el Mapa de densidad y encierre en un círculo la población de células efectiva.
    3. Con la fluorescencia FITC como parámetro del eje X y otros parámetros de fluorescencia como parámetro del eje Y, cree un mapa de densidad. Haga clic en Matriz de compensación en el menú Inicio y Coeficiente en la matriz de desbordamiento. La información del mapa de densidad se muestra para el análisis de la tasa de apoptosis.

4. Detección por inmunofluorescencia de la generación de caspasa-3

  1. Sembrar las células PC12 en cubreobjetos a una densidad de 8 x 104 células/cubreobjetos y colocarlas en placas de 24 pocillos a 37 °C durante 24 h. Agrupe las celdas como se mencionó anteriormente en el paso 3.2; Configure tres cubreobjetos replicados para cada grupo.
  2. Después del tratamiento farmacológico, enjuague los cubreobjetos dos veces con PBS (37 °C) durante 5 minutos cada uno, fíjelos con paraformaldehído al 4% durante 15 minutos y permeabilice con Triton X-100 al 0,5% durante 20 minutos a RT.
  3. Enjuague las células nuevamente y bloquéelas con suero de cabra al 10% durante 1 h en RT.
  4. Incubar cada cuba con 200 μL de anticuerpo primario caspasa-3 (una proteína ejecutiva clave de la apoptosis) diluida a una concentración de 1:250 en 1x TBST, durante la noche a 4 °C. Lavar con 1x TBST (tres veces durante 3 min cada una) e incubar con 200 μL de anticuerpo secundario (dilución 1:300 en 1x TBST) durante 1 h a RT en la oscuridad.
    NOTA: La fluorescencia se apaga fácilmente; Por lo tanto, después de la incubación del anticuerpo secundario, los portaobjetos deben mantenerse alejados de la luz. Los anticuerpos primarios y secundarios deben almacenarse a 4 °C lejos de la luz.
  5. Agregue 300 μL de DAPI (0,5 μg/ml) a los cubreobjetos (para detectar los núcleos) durante 10 minutos y lave las células tres veces con 1x TBST durante 5 minutos cada una.
  6. Observe los cubreobjetos bajo el microscopio de fluorescencia y capture imágenes10. Realice un análisis estadístico de la intensidad de fluorescencia utilizando el software de imágenes.
    NOTA: Los portaobjetos y cubreobjetos utilizados deben estar limpios y ser estériles. Al teñir, preste atención al pH, la concentración y la temperatura de la solución de teñido, y evite el enfriamiento de la fluorescencia. El microscopio fluorescente debe encenderse con al menos 15 minutos de anticipación para precalentar la lámpara de mercurio y apagarse durante 30 minutos antes de volver a encenderse. Al adquirir imágenes, los parámetros de exposición del mismo tinte en el mismo lote de experimentos deben ser consistentes para garantizar la precisión de los resultados.

5. Ensayo de inmunofluorescencia del nivel de ROS

  1. Cultivar y tratar las células como se explica en el paso 4.1.
  2. Después del tratamiento farmacológico, lavar cada cubreobjetos tres veces con PBS durante 3 min e incubar con 400 μL de DCFH-DA (10 μM) a 37 °C durante 20 min.
    NOTA: DCFH-DA es un indicador universal de estrés oxidativo. Tiene permeabilidad a la membrana celular y no tiene fluorescencia. Una vez que entra en la célula, es hidrolizada por la esterasa para producir 2',7'-diclorodihidrofluoresceína (DCFH) y luego se oxida rápidamente para producir un producto fluorescente fuerte.
  3. Lave las células nuevamente con DMEM sin suero (dos veces durante 3 minutos cada una) e inmediatamente observe el cubreobjetos después de agregar el agente de extinción de fluorescencia bajo el microscopio de fluorescencia. Calcule la intensidad relativa de fluorescencia mediante el software de imágenes.
    NOTA: Después de cargar la sonda DCFH-DA, asegúrese de limpiar la sonda residual que no entra en la celda, de lo contrario el fondo se volverá alto.

6. Detección de Western blot de la expresión proteica de Nrf2, p-Akt, Akt, Bcl-2 y Bax11,12

  1. Inocular células PC12 en placas de 6 pocillos a una concentración de 1 x 106 células/pocillo y cultivar a 37 °C durante 24 h. Agrupe y trate las células como se mencionó en el paso 4.1, y establezca tres pocillos replicados en cada grupo.
  2. Después del tratamiento farmacológico durante 24 h, lavar las células tres veces con PBS durante 5 minutos cada una e incubar en hielo durante 30 minutos en tampón de lisis preparado. Después de la lisis, centrifugar las células durante 20 min a 16.000 x g y 4 °C y recoger los sobrenadantes.
  3. Detecte la concentración de proteína y ajuste de acuerdo con las instrucciones a través del ensayo de Bradford. Diluir las muestras y desnaturalizar a 100 °C durante 10 min.
    NOTA: El tampón de lisis está compuesto por inhibidor de fosfatasa, inhibidor de proteasa y lisado RIPA en una relación de volumen de 1:1:50. En el grupo control, se requieren 200 μL/pocillo de tampón de lisis, y 100 μL/pocillo de tampón de lisis en los otros grupos. En general, las concentraciones de proteínas de los grupos control, modelo y dos tipos de combinaciones son 0.45 mg / ml, 0.25 mg / ml y 0.32-0.39 mg / ml respectivamente; sus concentraciones de proteína después de la dilución con el tampón de carga son 0.36, 0.2 y 0.256-0.312 mg / ml, respectivamente.
  4. Para detectar proteínas con diferentes pesos moleculares, cargue 25 μg de proteína en cada carril, ejecute una electroforesis SDS-PAGE al 12% y transfiera el gel a las membranas de PVDF.
    NOTA: Durante la preparación del gel SDS, debe mezclarse completamente sin burbujas ni partículas insolubles; de lo contrario, pueden producirse bandas desiguales o irregulares. Al transferir las membranas, asegúrese de que no haya burbujas entre la membrana de PVDF y el gel; de lo contrario, aparecerán manchas blancas en la tira. Además, este paso debe realizarse a bajas temperaturas, y la bolsa de hielo debe cambiarse cada 30 minutos.
  5. Bloquear las membranas con leche descremada al 5% durante 1,5 h en RT e incubar con 5 mL de los anticuerpos primarios correspondientes (Nrf2 1:1.000, Akt 1:2.000, p-Akt 1:2.000, Bcl-2 1:5.000 y Bax 1:1.000) durante 24 h a 4 °C. Usar anticuerpos β-actina (1:5,000) como control interno.
  6. Lave las membranas con TBST (tres veces durante 10 minutos cada una), luego incubar con 5 ml de anticuerpos secundarios conjugados con HPR (1:5.000) a RT durante 2 h.
    NOTA: La relación de dilución de los anticuerpos no debe cambiarse arbitrariamente, y las membranas deben lavarse con TBST lo suficientemente en estricta conformidad con los requisitos para evitar que el color de fondo de la banda sea demasiado negro.
  7. Finalmente, lave la membrana con TBST nuevamente y trátela con sustrato HRP quimioluminiscente (según las instrucciones del fabricante) para la detección de bandas de proteínas. Capture las imágenes utilizando el sistema de imágenes de quimioluminiscencia y cuantifique los valores de gris de las proteínas utilizando el software de imagen, con β-actina como control interno comparativo.

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Resultados

El cribado de la combinación óptima de Ast inyectable y Eri cápsula se muestra en la Figura 1. La tasa de supervivencia celular de la inyección de Ast y la cápsula de Eri en las células PC12 normales se muestra en la Figura 1A. La viabilidad celular fue inferior al 95% con la inyección de Ast a concentraciones superiores a 12 μM (Figura 1A) y la cápsula de Eri a concentraciones superiores a 5 μM (Figura 1A), lo que indica...

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Discusión

Todavía hay una falta de fármacos ideales para el tratamiento de la isquemia cerebral en la práctica clínica moderna2. Bajo la guía de suplementar qi y activar el método de circulación sanguínea, Ast, Eri y otras preparaciones se han utilizado en combinación en la práctica clínica de la MTC y han logrado buenas ventajas integrales13,14,15. Un gran número de estudios han demostrado que Ast pued...

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Divulgaciones

Los autores declaran no tener conflictos de intereses.

Agradecimientos

Esta investigación fue financiada por proyectos clave de investigación y desarrollo del Departamento Provincial de Ciencia y Tecnología de Sichuan (2020YFS0325).

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Materiales

NameCompanyCatalog NumberComments
1300 series class II biosafety cabinetThermo Fisher Scientific Instruments Company1374
3-(4,5-Dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromideGuangzhou saiguo biotech Company1334GR001MTT
ACEA NovoExpress 1.4.0ACEA Biosciences, Inc-
AktWuhan Three Eagles Proteintech Group, Inc10176-2-AP
Analytical flow cytometryThermo Fisher Scientific Instruments Company62-2-1810-1027-0
Annexin V-FITC apoptosis detection kitBeyotime Biotechnology CompanyC1062L
Astragalus injectionHeilongjiang Zhenbao Island Pharmaceutical CompanyA03190612144Ast injection
Astragaloside AChongqing Gao Ren Biotechnology Company84687-43-4
BaxWuhan Three Eagles Proteintech Group, Inc60267-1-Ig
BCA protein quantification kitBeyotime Biotechnology CompanyP0012
Bcl-2Wuhan Three Eagles Proteintech Group, Inc26593-1-AP
Carbon dioxide incubatorsThermo Fisher Scientific Instruments Company0816-2014
Caspase-3Wuhan Three Eagles Proteintech Group, Inc19677-1-AP
Chlorogenic acidChongqing Gao Ren Biotechnology Company327-97-9
Cobalt chloride hexahydrateMerck Biotechnology, Inc.7791-13-1CoCl2
Dimethyl sulfoxideGuangzhou saiguo biotech Company2020112701DMSO
Disodium hydrogen phosphate dodecahydrateChengdu Kolon Chemical Company2020090101
DMEM high sugar mediumThermo scientific Hyclone2110050
DMEM sugar free mediumBeijing Solarbio life sciences Company2029548
ECL luminous fluidLianshuo Biological CompanyWBKLS0500
Electronic balanceHaozhuang Hengping Scientific Instrument Co., Ltd., Shanghai, ChinaFA1204
Electrophoresis instrumentBio-Rad Laboratories (Shanghai) Co., Ltd1658026
Erigeron breviscapus capsuleYunnan Biogu Pharmaceutical CompanyZ53021671Eri capsule
Fetal bovine serumFour Seasons Institute of Biological Engineering20210402FBS
Fluorescent microscopeOlympms CorporationIX71-F32PH
Gel imagerBio-Rad Laboratories (Shanghai) Co., Ltd1708265
Goat anti-mouse secondary antibodyWuhan Three Eagles Proteintech Group, IncSA00001-1
Goat anti-rabbit secondary antibodyWuhan Three Eagles Proteintech Group, IncSA00001- 2
IBM SPSS Statistics version 26.0International Business Machines Corporation, USA-
ImageJ 1.8.0National Institutes of Health, USA-imaging software
Immunol fluorescence staining kitBeyotime Biotechnology CompanyP0196
KClChengdu Kolon Chemical Company2021070901
MarkerThermo Fisher Scientific Instruments Company26616
Microplate readerPerkin Elmer Corporate Management (Shanghai) Co.HH35L2018296
Motic Inverted microscopeNanda Scientific Instruments Co.AE2000LED
NaClChengdu Kolon Chemical Company2014081301
Nonfat milkBeyotime Biotechnology CompanyP0216
Nrf2Wuhan Three Eagles Proteintech Group, Inc16396-1-AP
P-AktWuhan Three Eagles Proteintech Group, Inc66444-1-Ig
PC12 cellsChinese Academy of SciencesCBP60430
Penicillin-Streptomycin solutionThermo scientific HycloneSV30010
Phosphatase protease inhibitor mixtureBeyotime Biotechnology CompanyP1045
Potassium dihydrogen phosphateChengdu Kolon Chemical Company2015082901
Reactive oxygen species assay kitBeyotime Biotechnology CompanyS0033S
RI-PA lysis solutionBeyotime Biotechnology CompanyP0013B
ScutellarinChongqing Gao Ren Biotechnology Company27740-01-8
SDS-PAGE sample loading buffer, 5xBeyotime Biotechnology CompanyP0015L
Sterile filter tips (0.22 µm)Merck Biotechnology, Inc.SLGP033RB
Tris-baseGuangzhou saiguo biotech Company1115GR500 TBS
TrypsinThermo scientific HycloneJ190013
Tween-20Chengdu Kolon Chemical Company2021051301
Vortex oscillatorOHAUS International Co., Ltd., Shanghai, ChinaVXMNAL
β-actinWuhan Three Eagles Proteintech Group, Inc66009-1-Ig

Referencias

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