JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • النتائج
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

في هذا العمل ، تم تحسين بروتوكول إزالة الخلايا للحصول على مصفوفات منزوعة الخلايا لعضلات الهيكل العظمي للفأر الجنيني. يمكن للخلايا العضلية C2C12 استعمار هذه المصفوفات والتكاثر والتمايز. يمكن استخدام هذا النموذج في المختبر لدراسة سلوك الخلية في سياق أمراض العضلات الهيكلية مثل ضمور العضلات.

Abstract

تلعب المصفوفة خارج الخلية (ECM) دورا مهما في توفير الدعم الهيكلي للخلايا ونقل الإشارات المهمة لمختلف العمليات الخلوية. تبالغ نماذج زراعة الخلايا ثنائية الأبعاد (2D) في تبسيط التفاعلات المعقدة بين الخلايا و ECM ، حيث أن عدم وجود دعم ثلاثي الأبعاد (3D) كامل يمكن أن يغير سلوك الخلية ، مما يجعلها غير كافية لفهم العمليات في الجسم الحي . تعد أوجه القصور في تكوين ECM وتفاعلات الخلايا ECM من المساهمين المهمين في مجموعة متنوعة من الأمراض المختلفة.

أحد الأمثلة على ذلك هو الحثل العضلي الخلقي LAMA2 (LAMA2-CMD) ، حيث يمكن أن يؤدي غياب أو تقليل اللامينين الوظيفي 211 و 221 إلى نقص شديد في التوتر ، يمكن اكتشافه عند الولادة أو بعدها بفترة وجيزة. يشير العمل السابق باستخدام نموذج فأر للمرض إلى أن ظهوره يحدث أثناء تكوين عضل الجنين. تهدف الدراسة الحالية إلى تطوير نموذج 3D في المختبر يسمح بدراسة التفاعلات بين خلايا العضلات وعضلة الجنين ECM ، ومحاكاة البيئة المكروية الأصلية. يستخدم هذا البروتوكول عضلات الظهر العميقة التي تم تشريحها من أجنة الفئران E18.5 ، ومعالجتها بمخزن مؤقت منخفض التوتر ، ومنظف أنيوني ، و DNase. احتفظت المصفوفات الناتجة عن إزالة الخلايا (dECMs) بجميع بروتينات ECM التي تم اختبارها (laminin α2 ، و laminins الكلي ، و fibronectin ، والكولاجين I ، والكولاجين IV) مقارنة بالأنسجة الأصلية.

عندما تم زرع الخلايا العضلية C2C12 فوق هذه dECMs ، اخترقت واستعمرت dECMs ، مما دعم انتشارها وتمايزها. علاوة على ذلك ، أنتجت خلايا C2C12 بروتينات ECM ، مما ساهم في إعادة تشكيل مكانتها داخل dECMs. يوفر إنشاء هذه المنصة في المختبر نهجا واعدا جديدا لكشف العمليات التي ينطوي عليها ظهور LAMA2-CMD ، ولديه القدرة على التكيف مع أمراض العضلات الهيكلية الأخرى حيث تساهم أوجه القصور في الاتصال بين ECM وخلايا العضلات الهيكلية في تطور المرض.

Introduction

المصفوفة خارج الخلية (ECM) هي مكون رئيسي للأنسجة ، تمثل مكونها غير الخلوي. لا يوفر هذا الهيكل ثلاثي الأبعاد (3D) الدعم المادي للخلايا فحسب ، بل يلعب أيضا دورا حاسما في العمليات الكيميائية الحيوية التي ينطوي عليها تطور الكائناتالحية 1. يحدث تكوين ECM خاص بالأنسجة أثناء التطور ، نتيجة للتفاعلات المعقدة بين الخلايا ومنافذها ، والتي تتأثر بمحفزات مختلفة داخل وخارج الخلية. ECM هو هيكل ديناميكي للغاية يخضع لإعادة ترتيب كيميائية وميكانيكية بطريقة زمنية مكانية ويؤثر بشكل مباشر على مصير الخلية2. واحدة من أبرز خصائص ECM هي تنوعها الوظيفي ، حيث يعرض كل نسيج ECM مزيجا فريدا من الجزيئات التي توفر طوبولوجيا وخصائص مختلفة مصممة خصيصا للخلايا التي تحتوي عليها1.

تعد إشارات ودعم ECM أمرا بالغ الأهمية للتطور والتوازن ، وعندما تتعطل يمكن أن تؤدي إلى حالات مرضية متعددة 3,4. أحد الأمثلة على ذلك هو الحثل الخلقي الناقص LAMA2 (LAMA2-CMD) ، وهو الشكل الأكثر شيوعا للضمور العضلي الخلقي. يشفر جين LAMA2 لسلسلة laminin α2 ، الموجودة في laminin 211 و laminin 221 ، وعندما يتحور يمكن أن يؤدي إلى LAMA2-CMD 5. Laminin 211 هو الشكل المتماثل الرئيسي الموجود في الغشاء القاعدي المحيط بألياف العضلات الهيكلية. عندما يكون laminin 211 غير طبيعي أو غائب ، يتم تعطيل الرابط بين الغشاء القاعدي وخلايا العضلات ، مما يؤدي إلى ظهور المرض6. يظهر المرضى الذين يعانون من LAMA2-CMD نمطا ظاهريا خفيفا إلى شديد اعتمادا على نوع الطفرة في جين LAMA2.

عندما تتأثر وظيفة بروتين laminin α2 ، يمكن للمرضى تجربة نقص التوتر العضلي الشديد عند الولادة وتطوير التهاب مزمن وتليف وضمور العضلات ، مما يؤدي إلى انخفاض متوسط العمر المتوقع. حتى الآن ، لم يتم تطوير أي علاجات مستهدفة وتقتصر الأساليب العلاجية على تخفيف أعراض المرض7. لذلك ، فإن فهم الآليات الجزيئية الأساسية التي ينطوي عليها ظهور هذا المرض أمر بالغ الأهمية لتطوير الاستراتيجيات العلاجية المناسبة 6,8. يشير العمل السابق باستخدام فأر dyW 9 ، وهو نموذج ل LAMA2-CMD ، إلى أن ظهور المرض يبدأ في الرحم ، وتحديدا أثناء تكوين عضل الجنين10. إن الفهم الأفضل لكيفية ظهور عيب تكوين عضل الجنين سيكون بمثابة تغيير لقواعد اللعبة في توليد مناهج علاجية جديدة ل LAMA2-CMD.

توفر الأنظمة في المختبر بيئة خاضعة للرقابة لدراسة تفاعلات الخلايا الخلوية والخلايا ECM ، لكن نماذج ثقافة 2D تفتقر إلى تعقيد الأنسجة الأصلية. ينتج عن إزالة الخلايا من الأنسجة سقالات ECM غير الخلوية الخاصة بالأنسجة ومرحلة النمو والتي تحاكي بدقة أكبر البيئة الدقيقة للخلايا الطبيعية مقارنة بنماذج 2D والسقالات الهندسية / الاصطناعية. المصفوفات منزوعة الخلايا (dECMs) لديها القدرة على الحفاظ على الإشارات الجزيئية والميكانيكية للأنسجة المضيفة ، مما يجعلها نماذج بديلة أفضل لفهم العمليات في الجسم الحي 11.

هناك العديد من التقنيات والكواشف والظروف التي يمكن استخدامها لإزالة الخلايا12,13. في هذه الدراسة ، تم تكييف بروتوكول إزالة الخلايا لقلب فأر الجنين ، الذي وصفه Silva et al.14،15 ، مع العضلات الهيكلية للفأر الجنيني ووجد أنه يحتفظ بجميع مكونات ECM المختبرة (laminin α2 ، الصفيحات الكلية ، الفبرونيكتين ، الكولاجين I ، والكولاجين IV). يتضمن البروتوكول ثلاث خطوات: تحلل الخلايا عن طريق الصدمة التناضحية (العازلة منخفضة التوتر) ، وانحلال غشاء البلازما وتفكك البروتين (0.05٪ كبريتات دوديسيل الصوديوم [SDS]) ، والتدمير الأنزيمي للحمض النووي (علاج DNase). على حد علمنا ، هذا هو أول بروتوكول تم إنشاؤه لإزالة الخلايا من العضلات الهيكلية الجنينية للفأر.

لاستخدام هذا النظام ثلاثي الأبعاد في المختبر لدراسة LAMA2-CMD ، من الضروري الحفاظ على سلسلة laminin α2 بعد إزالة الخلايا. لذلك ، تم تنفيذ بروتوكول التحسين حيث تم اختبار المنظفات المختلفة (SDS و Triton X-100) والتركيزات (0.02٪ و 0.05٪ و 0.1٪ و 0.2٪ و 0.5٪) (البيانات غير معروضة). تم العثور على الخيار الأمثل لإزالة الخلايا والحفاظ على بروتين laminin α2 ليكون 0.05 ٪ SDS. تم استخدام خلايا C2C12 ، وهي خط خلايا عضلية راسخة16,17 ، لزرع dECMs. تغزو هذه الخلايا dECM ، وتتكاثر ، وتتمايز داخل هذه السقالات ، وتوليف بروتينات ECM جديدة. يوفر الإنتاج الناجح لهذا النموذج ثلاثي الأبعاد في المختبر نهجا جديدا لفهم العمليات الجزيئية والخلوية التي ينطوي عليها تكوين عضل الجنين ، وبداية LAMA2-CMD ، ويمكن أن يمتد إلى أمراض العضلات الأخرى حيث يتم تعطيل الاتصال بين ECM وخلايا العضلات الهيكلية.

Protocol

تمت الموافقة على جميع المنهجيات الموصوفة من قبل لجنة رعاية الحيوان (ORBEA) التابعة لكلية العلوم ، جامعة لشبونة ، و Direção Geral de Veterinária (DGAV ؛ المرجع 0421/000/000/2022) ، وهي متوافقة مع التوجيه الأوروبي 2010/63 / EU.

1. إعداد المخازن المؤقتة لإزالة الخلايا والكواشف

ملاحظة: يجب تعقيم جميع المحاليل المستخدمة أثناء بروتوكول إزالة الخلايا عن طريق التعقيم وتخزينها لمدة تصل إلى 3 أشهر ما لم ينص على خلاف ذلك.

  1. تحضير محلول ملحي مخزن بالفوسفات 10x (10x PBS) بإضافة كلوريد الصوديوم (NaCl) عند 137 mM ، كلوريد البوتاسيوم (KCl) عند 2.68 mM ، فوسفات البوتاسيوم والهيدروجين (KH 2 PO 4) عند 8.1 mM ، وثنائي هيدرات ثنائي الصوديوم والهيدروجين والفوسفات (Na 2 HPO4) عند 1.47 mM إلى الماء منزوع المعادن (dH2O) وضبط الرقم الهيدروجيني إلى 6.8. أضف 100 مل من 10x PBS إلى 900 مل من H2O منزوع المعادن لتوليد 1x PBS. الأوتوكلاف وتخزينها في درجة حرارة الغرفة (RT). أضف محلول مخزون البنسلين / الستربتومايسين المعقم (10000 وحدة / مل من البنسلين و 10 مجم / مل من الستربتومايسين [قلم / بكتيريا العقدية]) إلى تركيز نهائي بنسبة 1٪ قبل الاستخدام.
  2. تحضير المخزن المؤقت منخفض التوتر عن طريق إذابة 1.21 جم من تريس (هيدروكسي ميثيل) أمينوميثان (قاعدة تريس) و 1 جم من حمض الإيثيلين ديامينيترايتيك (EDTA) في 1 لتر من dH2O (10 mM Tris base 0.1٪ EDTA). استخدم محرك مغناطيسي حتى يذوب واضبط الرقم الهيدروجيني على 7.8 باستخدام هيدروكسيد الصوديوم / حمض الهيدروكلوريك. تعقيم عن طريق التعقيم وتخزينها في RT. أضف القلم/البكتيريا العقدية إلى تركيز نهائي قدره 1٪ قبل الاستخدام.
  3. قم بإعداد المخزن المؤقت للغسيل منخفض التوتر عن طريق إذابة 1.21 جم من قاعدة Tris في 1 لتر من dH2O (قاعدة Tris 10 mM). استخدم محرك مغناطيسي حتى يذوب واضبط الرقم الهيدروجيني على 7.8 باستخدام NaOH / HCl. الأوتوكلاف وتخزينها في RT. أضف القلم/البكتيريا إلى 1٪ قبل الاستخدام.
  4. قم بإعداد معالجة المنظفات الأنيونية بإضافة 0.05 جم من كبريتات دوديسيل الصوديوم (SDS) إلى 100 مل من محلول الغسيل منخفض التوتر لإنتاج محلول معالجة SDS بنسبة 0.05٪. تصفية من خلال مرشح غشاء 0.22 ميكرومتر. تخزينها في RT لمدة تصل إلى 1 شهر.
    ملاحظة: لا ينبغي تعقيم محلول SDS ، حيث يترسب SDS ويتحلل عند التعقيم.
  5. تحضير محلول معالجة DNase عن طريق إذابة 1.21 g من قاعدة Tris في 0.5 mL من dH 2 O وإضافة 1مل من 1 M كلوريد المغنيسيوم (MgCl2). اضبط الرقم الهيدروجيني على 7.8 باستخدام NaOH / HCl. الأوتوكلاف وتخزينها في RT. أضف DNase I قبل الاستخدام (50 وحدة / مل).

2. جمع العينات

ملاحظة: تم استخدام الفئران من النوع البري C57 / BL6 في الدراسة. أجريت جميع التقنيات في غطاء التدفق الصفحي تحت ظروف معقمة.

  1. القتل الرحيم للإناث الحوامل البالغات في اليوم الجنيني (E) 18.5 من الحمل باستخدام استنشاق الأيزوفلوران متبوعا بخلع عنق الرحم. إخضاع الفئران للتشريح النهائي لاستخراج الأجنة.
    1. رش بطن الفأر بنسبة 70 ٪ من الإيثانول.
    2. باستخدام ملقط جراحي ومقص ، ارفع طية الجلد في أسفل البطن وقم بعمل شق على شكل حرف U لكشف تجويف البطن18.
    3. اجمع قرون الرحم التي تحتوي على الأجنة E18.5 عن طريق قطع قنوات البيض وعنق الرحم ونقلها على الفور إلى طبق بتري مع الثلج البارد 1x PBS مع 1٪ قلم / بكتيريا18.
    4. قم بإزالة الأجنة بسرعة من الرحم والأنسجة خارج الجنين والقتل الرحيم عن طريق قطع الرأس باستخدام المقص18.
  2. نقل جنين واحد في وقت واحد إلى طبق بتري مع الثلج البارد 1x PBS. باستخدام مجهر ستيريو ، قم بإزالة الجلد وقطع الأطراف. من الجانب البطني ، قطع من خلال القفص الصدري وإزالة القص والأعضاء الأساسية.
  3. اقلب الجانب الظهري لجذع الجنين لأعلى. قم بإزالة الجزء العنقي من العمود الفقري ، ورواسب الدهون الظهرية ، والنسيج الضام أعلى عضلات الظهر العميقة.
  4. استخدم الملقط الجراحي لتثبيت القفص الصدري وكشط عضلات الظهر العميقة بعناية وفصلها عن الأنسجة المحيطة باستخدام مشرط دقيق10. ينتج عن هذا الإجراء عزل قطعتين عضليتين لكل جنين (يسار ويمين) ، وكلاهما يتكون بشكل أساسي من عضلات لونجيسيموس وعضلات الحرقفية ، مع تضمين بعض العضلات المحورية الشوكية والرافعة الضلعية.
  5. قم بتخزين عينات العضلات في 1x PBS مع قلم / بكتيريا 1٪ عند 4 درجات مئوية للتخزين قصير المدى (<أسبوع واحد) ، أو عند -80 درجة مئوية لفترات أطول.
    ملاحظة: استخدم العينات التي تم جمعها حديثا للحصول على أفضل النتائج. تظهر العينات المجمدة لفترات طويلة (>3 أشهر) كفاءة أقل في إزالة الخلايا والمزيد من تدهور البروتين. تم استخدام كتل العضلات المحورية لتجارب إزالة الخلايا ، ولكن يمكن معالجة العضلات الأخرى (على سبيل المثال ، عضلات الأطراف) لإزالة الخلايا باستخدام نفس البروتوكول.

3. إزالة الخلايا من العضلات الهيكلية الجنينية

ملاحظة: تم إجراء جميع التقنيات في غطاء التدفق الصفحي في ظل ظروف معقمة. للحصول على تمثيل تخطيطي مفصل ، انظر الشكل 1 أ. تم تنفيذ جميع الخطوات مع التحريض في شاكر مداري بقطر 120 مم (165 دورة في الدقيقة) عند 25 درجة مئوية ما لم ينص على خلاف ذلك. أضف 1٪ قلم / بكتيريا إلى المحاليل قبل الاستخدام. عند إزالة المحاليل ، قم بالنضح بعناية لتجنب انحباس العينة في الماصة.

  1. اليوم الأول - تحضير ما يقرب من 2 مم × 1 مم × 1 مم (~ 3.5 مجم) شظايا الأنسجة من كتل العضلات المحورية. أضف 3 مل من المخزن المؤقت منخفض التوتر مع 1٪ قلم / بكتيريا إلى كل بئر من صفيحة 12 بئرا وأضف جزءا كاملا من الأنسجة العضلية لكل بئر.
    1. احتضان شظايا الأنسجة في العازلة منخفضة التوتر مع التحريض لمدة 18 ساعة (بين عشية وضحاها) (O / N).
  2. اليوم 2 - نضح المخزن المؤقت منخفض التوتر باستخدام ماصة دقيقة الطرف وغسل العينات 3 × 1 ساعة مع 3 مل من 1x PBS في كل مرة مع الإثارة.
    1. احتضان العينات لمدة 24 ساعة مع 3 مل من محلول منظف SDS 0.05٪ مع تحريك.
      ملاحظة: (نقطة تفتيش) بعد حضانة SDS ، يجب أن تكون العينات شفافة في المظهر. تظهر العينات تناسقا يشبه الجيلاتين ، وبالتالي فهي أكثر عرضة للالتصاق بالماصة عند إزالة السوائل.
  3. اليوم الثالث - قم بإزالة محلول منظف SDS باستخدام ماصة دقيقة الطرف واغسل شظايا الأنسجة 3 × 20 دقيقة مع 3 مل من محلول الغسيل منخفض التوتر في كل مرة مع التقليب.
    ملاحظة: (نقطة التوقف) يمكن الاحتفاظ بالعينات في مخزن مؤقت للغسيل منخفض التوتر عند 4 درجات مئوية لمدة 18 ساعة (O / N). تأكد من إزالة SDS جيدا أثناء خطوات الغسيل ، حيث يمكن أن تكون SDS المتبقية سامة للخلايا.
    1. احتضان شظايا الأنسجة لمدة 3 ساعات مع 2 مل من محلول DNase مع التقليب عند 37 درجة مئوية.
    2. قم بإزالة محلول DNase باستخدام ماصة ذات طرف دقيق واغسل شظايا الأنسجة 3 × 20 دقيقة مع 3 مل من 1x PBS في كل مرة مع التقليب. أخيرا ، اغسل O / N بالتحريك (60 دورة في الدقيقة).
      ملاحظة: بعد معالجة DNase ، تصبح dECMs لزجة بسبب وجود بقايا الحمض النووي. لذلك ، الغسيل الدقيق ضروري.
    3. قم بتخزين dECMs في 1x PBS مع 1٪ قلم / بكتيريا عند 4 درجات مئوية حتى إعادة التوصيل (< أسبوع واحد). للاستخدامات الأخرى، يحفظ في درجة حرارة -80 درجة مئوية.

4. تقييم جودة إزالة الخلايا

ملاحظة: تم إجراء قياس كمية الحمض النووي ، وتلطيخ DAPI / الميثيل الأخضر ، وتلطيخ القضيب لتقييم وجود محتويات الخلية المتبقية بعد إزالة الخلايا. تم إجراء الكيمياء الهيستولوجية المناعية وتحليلات اللطخة الغربية لتقييم الاحتفاظ ببروتينات ECM الرئيسية بعد إزالة الخلايا.

  1. القياس الكمي للحمض النووي الموجود في dECM
    ملاحظة: يجب مقارنة dECMs بالأنسجة الأصلية للكشف عن وجود الحمض النووي.
    1. قبل إزالة الخلايا ، قم بوزن أنبوب طرد مركزي دقيق سعة 1.5 مل على مقياس رقمي عالي الدقة. قبل نقل عينة العضلات إلى الأنبوب ، قم بإزالة كل ما تبقى من 1x PBS باستخدام منشفة ورقية. وزن الأنبوب مع العينة. احسب الوزن الرطب للعينات باستخدام المعادلة (1):
      عينة الوزنالرطب = أنبوب الوزنمع العينات -الوزن أنبوب فارغ (1)
    2. إزالة الخلايا من العينات باتباع البروتوكول الموضح في القسم 3.
    3. ضع العينات في أنابيب طرد مركزي دقيقة سعة 2 مل.
      ملاحظة: يمكن الاحتفاظ بالعينات عند -20 درجة مئوية حتى استخراج الحمض النووي وتحديده.
    4. قم بإجراء استخراج الحمض النووي ل dECMs وعينات الأنسجة الأصلية باستخدام مجموعة قائمة على عمود الدوران. أضف محلول الهضم وفقا لتعليمات الشركة الصانعة.
    5. تجانس العينات في مطحنة الخرز مرتين لمدة 2.5 دقيقة في كل مرة (قلب الحوامل) باستخدام حبة كربيد التنجستن واحدة لكل أنبوب (استخدم حوامل الأنبوب المبرد).
    6. أضف البروتيناز K واحتضان O / N مع التقليب البطيء عند 56 درجة مئوية.
    7. تابع البروتوكول كما هو موضح في تعليمات الشركة المصنعة.
    8. استخدم المخزن المؤقت الذي توفره الشركة المصنعة وأجهزة الطرد المركزي 2 × 1 دقيقة عند ≥6000 × جم ، في كل مرة عند 4 درجات مئوية لزيادة إنتاجية الحمض النووي.
      ملاحظة: يمكن تخزين الحمض النووي عند -20 درجة مئوية حتى القياس الكمي.
    9. حدد كمية الحمض النووي الموجود في العينات باستخدام مجموعة الكشف عن dsDNA الفلورية باتباع تعليمات الشركة المصنعة.
    10. تطبيع محتوى الحمض النووي على شكل نانوجرام من الحمض النووي لكل ملليغرام من الوزن الرطب الأصلي للعينة.
    11. قم بتحليل البيانات باستخدام اختبار t للطالب ثنائي الطرف والتعبير عنها كمتوسط ± الخطأ المعياري للمتوسط (SEM).
  2. الكيمياء الهيستولوجية المناعية
    ملاحظة: يجب تحضير المحاليل 1 و 2 و 3 والمحلول المثبت قبل الاستخدام ويمكن الاحتفاظ به مجمدا لمدة تصل إلى 6 أشهر. يتم سرد جميع الأجسام المضادة والأصباغ المستخدمة والتخفيفات ذات الصلة في الجدول 1.
    1. إعداد الحلول
      1. تحضير محلول مثبت بإضافة 2 جم من بارافورمالدهيد (PFA) و 8 جم من السكروز و 24 ميكرولتر من 1 M CaCl2 إلى 77 مل من 0.2 M Na 2 HPO 4 و 23 مل من 0.2 M NaH 2 PO 4 ، إلى حجم نهائي قدره 200 مل بإضافة dH2O. اضبطالرقم الهيدروجيني على7.4.
      2. تحضير 0.12 M فوسفات العازلة بإضافة 13.5 g من Na 2 HPO 4 و3.2 g من NaH 2 PO 4 إلى 1 L من dH2O. اضبط الرقم الهيدروجيني على7.4.
      3. تحضير المحلول 1 بإضافة 4 جم من السكروز إلى 100 مل من محلول فوسفات 0.12 M.
      4. تحضير المحلول 2 بإضافة 15 جم من السكروز إلى 100 مل من محلول فوسفات 0.12 M.
      5. تحضير المحلول 3 بإضافة 15 جم من السكروز و 7.5 جم من الجيلاتين إلى 100 مل من محلول الفوسفات 0.12 M. يسخن على حرارة 37 درجة مئوية حتى يذوب الجيلاتين.
      6. تحضير محلول مخزون الميثيل الأخضر (2٪ مسحوق أخضر ميثيل مذاب في dH2O) 19.
    2. الكشف المناعي
      1. ثبت العينات باستخدام المحلول المثبت لمدة 4 ساعات على الأقل عند 4 درجات مئوية.
      2. اغسل العينات 2x لمدة 10 دقائق باستخدام 1x PBS.
      3. احتفظ ب O / N ، أو أكثر من يوم واحد ، في المحلول 1 عند 4 درجات مئوية.
      4. اغسل واحتفظ ب O / N أو أكثر من يوم واحد في محلول 2 عند 4 درجات مئوية. دع العينات دافئة إلى RT.
      5. احتضان لمدة 3 ساعات في محلول 3 عند 37 درجة مئوية. احتفظ بالمحلول الإضافي 3 عند 37 درجة مئوية لاستخدامه لاحقا.
      6. قالب حاويات صغيرة (2 سم × 1 سم × 1 سم) في رقائق الألومنيوم. ضع طبقة رقيقة من المحلول 3 في الحاوية المقولبة واتركها ثابتة. ضع العينات على المحلول المتصلب 3 وقم بتغطيتها بمحلول دافئ 3. توجيه العينات والسماح لهم تصلب. ضع علامة على الموقع على المحلول المتصلب 3 بقلم ملون.
      7. قم بالتجميد عن طريق وضع الحاويات على سطح الأيزوبنتان الجاف المبرد بالثلج أو المبرد بالنيتروجين السائل.
      8. باستخدام مركب درجة حرارة القطع المثلى (O.C.T.) ، ثبت مكعبات الجيلاتين المجمدة التي تحتوي على العينات في حامل cryostat.
      9. قسم مكعبات الجيلاتين المجمدة وانقل أقسام الأنسجة إلى الشرائح. اتركيها تجف لمدة 60 دقيقة.
      10. استخدم علامة كارهة للماء لتتبع خط حول الأقسام.
      11. اغسل الشرائح 3 × 10 دقائق في 1x PBS.
      12. قم بتغطية الأقسام ب 1٪ من ألبومين مصل الأبقار (BSA) ، و 1٪ مصل الماعز ، و 0.05٪ Triton X-100 المخفف في 1x PBS (محلول مانع) لمدة 30 دقيقة (خطوة حجب).
      13. تمييع الأجسام المضادة الأولية في حل منع وتغطية الأقسام. احتضان O / N عند 4 درجات مئوية في صندوق مغلق ، بورق رطب ، لمنع المقاطع من الجفاف.
      14. اغسل الشرائح 3 × 10 دقائق باستخدام 1x PBS.
      15. تمييع الأجسام المضادة الثانوية في حل حجب وتغطية الأقسام. احتضان لمدة 1.5 ساعة في RT في الظلام.
        ملاحظة: تجنب التعرض للضوء لمنع تدهور الفلوروفور.
      16. اغسل الشرائح 3 × 10 دقائق باستخدام 4x PBS.
        ملاحظة: يمكن استخدام تركيز أعلى من PBS عند وجود خلفية قوية.
      17. اغمر الشرائح في محلول DAPI (5 ميكروغرام / مل 1،4-ديازابيسيكلو -2،2،2-أوكتان في 0.1٪ Triton X-100 / 1x PBS) لمدة 30 ثانية لكل منهما.
      18. شطف في 1x PBS.
      19. قم بتركيب الأقسام في وسط مضاد للبهتان (50 مجم / مل n-propyl-gallate في 1x PBS: الجلسرين [1: 9]) وأغلقها بغطاء سليب. يخزن في درجة حرارة 4 درجات مئوية حتى المراقبة والحصول على الصور في المجهر الفلوري20.
        ملاحظة: بالنسبة لتجارب الكيمياء الهيستولوجية المناعية الكاملة ، تم استخدام نفس البروتوكول (انظر الخطوات 4.2.2.12-4.2.2.18) ، باستثناء العينات التي تم تثبيتها مسبقا في 4٪ PFA مخففة في 1x PBS لمدة 3 ساعات في RT. تم إجراء تلطيخ الحمض النووي عن طريق إضافة الميثيل الأخضر إلى محلول الجسم المضاد الثانوي. يتم سرد جميع الأجسام المضادة والأصباغ المستخدمة ، والتخفيفات الخاصة بها ، في الجدول 1. ثم تم تركيب العينات في وسط مضاد للبهتان بين غطاءين مفصولين بحلقات فولاذية ، تم لصقها معا بشمع العسل ، وتم الحصول على مكدسات صور 100 ميكرومتر باستخدام مجهر متحد البؤر21.
  3. تحليل اللطخة الغربية
    ملاحظة: يتم سرد جميع الأجسام المضادة المستخدمة والتخفيفات ذات الصلة في الجدول 1.
    1. إعداد الحلول
      1. قم بإعداد المخزن المؤقت لتحميل 2x SDS-PAGE بإضافة 20 مل من الجلسرين و 4 جم من SDS و 0.2 مل من البروموفينول الأزرق إلى 80 مل من محلول قاعدة Tris 100 mM. اضبط الرقم الهيدروجيني على 6.8. أضف ديثيوثريتول الطازج (DTT) قبل الاستخدام.
      2. قم بإعداد محلول الغسيل الملحي المخزن Tris بمحلول Tween 20 (TBST) بإضافة 2.4 جم من قاعدة Tris ، و 8.8 جم من كلوريد الصوديوم ، و 1 مل من Tween-20 إلى dH2O إلى حجم نهائي قدره 1 لتر. اضبط الرقم الهيدروجيني على 7.4-7.6 باستخدام حمض الهيدروكلوريك.
      3. قم بإعداد المخزن المؤقت 10x (RB) بإضافة 30.2 جم من قاعدة Tris ، و 144.2 جم من الجلايسين ، و 10 جم من SDS إلى 1 لتر من dH2O. قبل الاستخدام ، أضف 100 مل من 10x RB إلى 900 مل من dH2O لتحضير 1x RB (حل العمل).
        ملاحظة: بينما يمكن تخزين 10x RB في RT لعدة أشهر ، يمكن إعادة استخدام 1x RB في عمليات تشغيل مختلفة.
      4. قم بإعداد المخزن المؤقت للنقل (TB) بإضافة 5.82 جم من قاعدة Tris ، و 2.93 جم من الجلايسين ، و 0.5 جم من SDS إلى 800 مل من dH2O. بعد إذابة المكونات ، أضف 200 مل من الميثانول. تبرد على حرارة 4 درجات مئوية.
        ملاحظة: يجب تحضير السل طازجا قبل كل استخدام.
    2. استخراج البروتين
      1. اجمع العضلات المحورية من الفئران E18.5 وضعها على الفور في أنبوب طرد مركزي دقيق (2 مل) يحتوي على 2x SDS-PAGE تحميل المخزن المؤقت مع DTT المضافة حديثا (100 mM DTT). معالجة E18.5 dECM بنفس الطريقة.
      2. أضف حبة كربيد التنجستن لكل أنبوب. تجانس 2x في مطحنة الخرز لمدة 2.5 دقيقة في كل مرة (اقلب الحوامل).
      3. قم بتقطيع العينات لمدة 5 دقائق في حمام الموجات فوق الصوتية.
      4. سخني العينات لمدة 10 دقائق عند 50 درجة مئوية.
      5. أجهزة الطرد المركزي العينات عند 12000 × جم لمدة 15 دقيقة عند 4 درجات مئوية.
      6. انقل المادة الطافية إلى أنبوب طرد مركزي جديد سعة 1.5 مل.
      7. تحديد كمية البروتين باستخدام مقياس الطيف الضوئي microvolume.
      8. يحفظ في درجة حرارة -20 درجة مئوية حتى الاستخدام مرة أخرى.
    3. بولي أكريلاميد جل الكهربائي
      1. استخدم جل التدرج الأكريلاميد مسبق الصب (4٪ -20٪)
      2. جبل الجل في خزان الكهربائي. قم بإزالة المشط بعناية. أضف 1x RB حتى الخط المعروض في خزان الكهربائي. تأكد من ملء الآبار ب RB.
      3. تحميل 100 ميكروغرام من البروتين لكل عينة في الآبار. تحميل 12 ميكرولتر من معيار البروتين عالي الوزن الجزيئي.
      4. تشغيل لمدة 100 دقيقة مع الجهد المستمر (10 دقائق في 150 فولت و 90 دقيقة في 185 فولت).
    4. نقل
      1. انقع ضمادات الفلتر والإسفنج بالسل المبرد (4 درجات مئوية) أثناء تشغيل الجل.
      2. قطع أغشية ثنائي فلوريد البولي فينيليدين إلى حجم الجل. تنشيطها بالميثانول واغسلها ب dH2O. نقع في السل.
      3. قم بتركيب كاسيت النقل باستخدام الإسفنج ووسادات الترشيح والمواد الهلامية والأغشية المنشطة وفقا لتعليمات الشركة المصنعة.
      4. ضع الكاسيت في خزان الكهربائي الذي يحتوي على السل المبرد (على طبقة من الثلج). أضف وحدة التبريد. اركض لمدة 90 دقيقة عند 100 فولت.
      5. بعد النقل ، تلطخ ببديل Coomassie الأزرق لتقييم جودة النقل.
    5. الكشف المناعي
      1. تحضير محلول الحجب (TBST مع 5 ٪ حليب قليل الدسم). احتضان الأغشية مع التحريض لمدة 1 ساعة في RT.
      2. شطف 3 × 5 ثانية مع TBST.
      3. احتضان الأغشية O / N مع الأجسام المضادة الأولية المخففة في TBST مع 2٪ BSA و 0.02٪ أزيد الصوديوم (3 مل لكل غشاء) في غرفة باردة (4 درجات مئوية) مع التقليب.
      4. في اليوم التالي ، اغسل 3 × 5 دقائق باستخدام TBST.
      5. احتضان الأغشية بالأجسام المضادة الثانوية المترافقة من بيروكسيديز الفجل (HRP) المخففة في TBST مع 5٪ حليب قليل الدسم (5 مل لكل غشاء) لمدة 1 ساعة في RT.
      6. اغسل الأغشية باستخدام TBST 3 × 5 دقائق. احتفظ في TBST حتى خطوة الكشف.
      7. تصور البروتين باستخدام مجموعة تطوير متاحة تجاريا. أضف كواشف الكشف وفقا لتعليمات الشركة المصنعة. الحصول على صور للفرق.
      8. لاختبار أكثر من جسم مضاد واحد لكل غشاء ، بعد خطوة الكشف ، قم بتجريد الأجسام المضادة السابقة بثلاث غسلات (5 دقائق لكل منها) باستخدام TBST وكرر الخطوات 4.3.5.2-4.3.5.7.

الجدول 1: الأجسام المضادة والأصباغ المستخدمة في الكيمياء الهيستولوجية المناعية وتحليل اللطخة الغربية والتخفيفات ذات الصلة. الرجاء الضغط هنا لتنزيل هذا الجدول.10,22

5. زراعة الخلايا في المصفوفات منزوعة الخلايا

ملاحظة: تم تنفيذ جميع التقنيات في ظل ظروف معقمة في غطاء التدفق الصفحي. تم إجراء جميع عمليات الحضانة عند 37 درجة مئوية وبنسبة 5٪ CO2.

  1. تحضير وسط زراعة الخلايا ، وسط النسر المعدل عالي الجلوكوز من Dulbecco مع الجلوتامين المستقر ومع بيروفات الصوديوم (DMEM) ، مع استكمال مصل بقري الجنين بنسبة 10٪ (FBS) و 1٪ قلم / بكتيريا (وسط زراعة كامل).
  2. ضع dECMs في طبق بتري في 1x PBS مع 1٪ قلم / بكتيريا في غطاء التدفق الصفحي وافصلها إلى قطع من حوالي 500 ميكرومتر × 500 ميكرومتر × 250 ميكرومتر ، باستخدام مشرط دقيق وملاقط.
    ملاحظة: تتميز dECMs بقوام ناعم ، وبالتالي غالبا ما يكون من الأسهل استخدام الملقط لفصلها إلى قطع بنفس الحجم تقريبا بدلا من تقطيعها بالمشرط الدقيق.
  3. انقل الشظايا إلى صفيحة مكونة من 96 بئرا (ثلاث أو أربع قطع لكل بئر) مع 200 ميكرولتر من وسط الاستزراع الكامل ، تم تسخينها مسبقا إلى 37 درجة مئوية. احتضان لمدة 2 ساعة في الحاضنة.
  4. أضف 500 ميكرولتر من التربسين إلى قارورة T25 المصنفة بخلايا C2C12 الفرعية (~ 70٪). أعد التعليق في 1 مل من الوسط الكامل.
  5. أضف 10 ميكرولتر من إعادة التعليق إلى صبغة تريبان الزرقاء 10 ميكرولتر وقم بتحميلها في مقياس الدم. عد وحساب رقم الخلية وتأكيد صلاحية الخلية.
  6. نضح الوسط من لوحة 96 بئرا تحتوي على dECMs وأضف 200 ميكرولتر من وسط الاستزراع الكامل الذي يحتوي على 50000 خلية C2C12 قابلة للحياة.
  7. احتضان لمدة 2 أيام وبعد ذلك ، باستخدام ملاقط ، ونقل dECMs (مع الخلايا) إلى لوحة 48 بئر مع 400 ميكرولتر من وسط الاستزراع الكامل. كل 2 أيام ، استنشاق الوسط بعناية باستخدام ماصة صغيرة لمنع dECMs من الانفصال عن قاع البئر وإضافة وسط جديد حتى اليوم 8.
    ملاحظة: يتم الاحتفاظ بالمصفوفات لمدة يومين في لوحات 96 بئرا لتعزيز التصاق الخلايا C2C12 ب dECMs ، ثم يتم نقلها إلى لوحة 48 بئرا للسماح بالوصول إلى حجم أكبر من الوسط مع العناصر الغذائية. يجب أن تلتصق dECMs بقاع الآبار.
  8. بالنسبة لتجربة التمايز، استبدل وسط الاستزراع الكامل بوسط التمايز (DMEM المكمل بمصل حصان 2٪ و 1٪ قلم / جرثم) في اليوم 8، يليه الحضانة في وسط التمايز لمدة 4 أيام حتى اليوم 12.

النتائج

الهدف من بروتوكول إزالة الخلايا هو إنتاج dECMs التي تشبه إلى حد كبير تكوين الأنسجة الأصلية. لتحديد فعالية عملية إزالة الخلايا ، تم استخدام طرق مختلفة ، بما في ذلك فحص مورفولوجيا الأنسجة ، وقياس مستويات الحمض النووي ، وتلطيخ F-actin ، وتحليل مكونات ECM الرئيسية باستخدام الكيمياء الهيستولوجية الم?...

Discussion

ECM عبارة عن شبكة معقدة من الجزيئات الكبيرة الموجودة في جميع الأنسجة وتلعب دورا حاسما في تنظيم سلوك الخلية ووظيفتها2. يعمل ECM بمثابة سقالة مادية للخلايا للالتصاق بها ويوفر إشارات تعدل بنشاط العمليات الخلوية مثل الانتشار والحركة والتمايز وموت الخلايا المبرمج. وبالتالي ، فإن ال?...

Disclosures

ليس لدى المؤلفين أي تضارب في المصالح للكشف عنه.

Acknowledgements

تم تمويل هذا العمل من قبل الجمعية الفرنسية لمكافحة الاعتلال العضلي (AFM-Téléthon ؛ عقد رقم 23049) ، ومشروع MATRIHEALTH ، وتمويل وحدة cE3c UIDB / 00329/2020. نود أن نشكر المتبرع هنريك ميريليس الذي اختار دعم مشروع MATRIHEALTH. استفاد هذا العمل من البنى التحتية لمرفق الفحص المجهري بكلية العلوم ، وهو عقدة تابعة للمنصة البرتغالية للتصوير الحيوي (المرجع PPBI-POCI-01-0145-FEDER-022122) ، ونشكر لويس ماركيز على مساعدته في الحصول على الصور ومعالجتها. أخيرا ، نشكر مارتا بالما على الدعم الفني وفريق البحث لدينا على مساهماتهم السخية.

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
12 Well Cell Culture Plate, Flat, TC, SterileAbdos LabwareP21021
4′,6-Diamidino-2-phenylindole dihydrochlorideMerckD8417
4–20% Mini-PROTEAN TGX Precast GelBio-Rad4561093
48 Well Cell Culture Plate, Flat, TC, SterileAbdos LabwareP21023
96 Well Cell Culture Plate, Flat, TC, SterileAbdos LabwareP21024
Bovine Serum Albumin, Fraction VNZYtechMB04601
BX60 fluorescence microscopeOlympus
Cryostat CM1860 UVLeica
DithiothreitolThermoFisherR0862
DMEM high glucose w/ stable glutamine w/ sodium pyruvateBiowestL0103-500
DNase IPanReac AppliChemA3778
DNeasy Blood & Tissue Kit Qiagen69506
Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA)Merck108418
Fetal bovine serumBiowestS1560-500
Fine tip transfer pipetteThermoFisher15387823
Goat serumBiowestS2000-100
Hera Guard Flow CabinetHeraeus
Heracell 150 CO2 IncubatorThermo Scientific
HiMark Pre-stained Protein StandardInvitrogen
Horse Serum, New Zealand originGibco16050122
HRP-α- Rabbit IgGabcamab205718
HRP-α- Rat IgGabcamab205720
HRP-α-Mouse IgGabcamab205719
ImageJ v. 1.53t
Methyl GreenSigma-Aldrich67060
MM400 Tissue LyserRetsch
NanoDrop ND-1000 Spectrophotometer ThermoFisher
Paraformaldehyde, 16% w/v aq. soln., methanol freeAlfa Aesar043368-9M
Penicillin-Streptomycin (100x) GRiSPGTC05.0100
Phalloidin Alexa 488 Thermo Fisher Sci.A12379
Polystyrene Petri dish 60x15mm with vents (sterile)Greiner Bio-One628161
Qubit dsDNA HS kitThermo ScientificQ32851
Qubit™ 3 FluorometerInvitrogen15387293
S6E Zoom Stereo microscopeLeica
Sodium Dodecyl SulfateMerck11667289001
SuperFrost® Plus adhesion slidesThermo Scientific631-9483
SuperSignal West Pico PLUS Chemiluminescent SubstrateThermo Scientific15626144
TCS SPE confocal microscopeLeica
Tris-(hidroximetil) aminometano (Tris base) ≥99%VWR Chemicals28811.295
Triton X-100Sigma-AldrichX100-100ML
Trypan Blue Solution, 0.4%Gibco15250061
Trypsin-EDTA (0.05%) in DPBS (1X)GRiSPGTC02.0100
TWEEN 20 (50% Solution)ThermoFisher3005
WesternBright PVDF-CL membrane roll (0.22µm)AdvanstaL-08024-001
α-Collagen Iabcamab21286
α-Collagen IVMilliporeAB756P
α-Collagen IVSanta Cruz Biotechnologysc-398655
α-FibronectinSigmaF-3648
α-Laminin α2 SigmaL-0663
α-MHCD.S.H.B.MF20
α-Mouse Alexa 488Molecular ProbesA11017
α-Mouse Alexa 568Molecular ProbesA11019
α-pan-LamininSigmaL- 9393
α-phospho-histone 3Merk Millipore06-570
α-Rabbit Alexa 568Molecular ProbesA21069
α-Rabbit Alexa 488Molecular ProbesA11070
α-Rat Alexa 488Molecular ProbesA11006

References

  1. Mecham, R. P. Overview of extracellular matrix. Current Protocols in Cell Biology. 10, 1-16 (2012).
  2. Frantz, C., Stewart, K. M., Weaver, V. M. The extracellular matrix at a glance. Journal of Cell Science. 123 (24), 4195-4200 (2010).
  3. Lamandé, S. R., Bateman, J. F. Genetic disorders of the extracellular matrix. Anatomical Record. 303 (6), 1527-1542 (2020).
  4. Ahmad, K., Shaikh, S., Ahmad, S. S., Lee, E. J., Choi, I. Cross-talk between extracellular matrix and skeletal muscle: implications for myopathies. Frontiers in Pharmacology. 11, 142 (2020).
  5. Tome, F. M., et al. Congenital muscular dystrophy with merosin deficiency. Comptes Rendus de l'Academie des Sciences. Serie III, Sciences de la Vie. 317 (4), 351-357 (1994).
  6. Gawlik, K. I., Durbeej, M. Skeletal muscle laminin and MDC1A: pathogenesis and treatment strategies. Skeletal Muscle. 1 (1), 9 (2011).
  7. van Ry, P. M., et al. ECM-related myopathies and muscular dystrophies: pros and cons of protein therapies. Comprehensive Physiology. 7 (4), 1519-1536 (2017).
  8. Gawlik, K. I., Durbeej, M. A family of laminin α2 chain-deficient mouse mutants: advancing the research on LAMA2-CMD. Frontiers in Molecular Neuroscience. 13, 59 (2020).
  9. Kuang, W., et al. Merosin-deficient congenital muscular dystrophy. Partial genetic correction in two mouse models. Journal of Clinical Investigation. 102 (4), 844-852 (1998).
  10. Nunes, A. M., et al. Impaired fetal muscle development and JAK-STAT activation mark disease onset and progression in a mouse model for merosin-deficient congenital muscular dystrophy. Human Molecular Genetics. 26 (11), 2018-2033 (2017).
  11. McCrary, M. W., Bousalis, D., Mobini, S., Song, Y. H., Schmidt, C. E. Decellularized tissues as platforms for in vitro modeling of healthy and diseased tissues. Acta Biomaterialia. 111, 1-19 (2020).
  12. Crapo, P. M., Gilbert, T. W., Badylak, S. F. An overview of tissue and whole organ decellularization processes. Biomaterials. 32 (12), 3233-3243 (2011).
  13. Philips, C., Terrie, L., Thorrez, L. Decellularized skeletal muscle: A versatile biomaterial in tissue engineering and regenerative medicine. Biomaterials. 283, 121436 (2022).
  14. Silva, A. C., et al. Comparable decellularization of fetal and adult cardiac tissue explants as 3D-like platforms for in vitro studies. Journal of Visualized Experiments. (145), e56924 (2019).
  15. Silva, A. C., et al. Three-dimensional scaffolds of fetal decellularized hearts exhibit enhanced potential to support cardiac cells in comparison to the adult. Biomaterials. 104, 52-64 (2016).
  16. Yaffe, D., Saxel, O. Serial passaging and differentiation of myogenic cells isolated from dystrophic mouse muscle. Nature. 270 (5639), 725-727 (1977).
  17. Burattini, S., et al. C2C12 murine myoblasts as a model of skeletal muscle development: morpho-functional characterization. European Journal of Histochemistry. 48 (3), 223-233 (2004).
  18. Murphy, D. Caesarean section and fostering. Methods in Molecular Biology. 18, 177-178 (1993).
  19. Prieto, D., Aparicio, G., Machado, M., Zolessi, F. R. Application of the DNA-specific stain methyl green in the fluorescent labeling of embryos. Journal of Visualized Experiments. (99), e52769 (2015).
  20. Lichtman, J. W., Conchello, J. -. A. Fluorescence microscopy. Nature Methods. 2 (12), 910-919 (2005).
  21. Jonkman, J., Brown, C. M., Wright, G. D., Anderson, K. I., North, A. J. Tutorial: guidance for quantitative confocal microscopy. Nature Protocols. 15 (5), 1585-1611 (2020).
  22. Paulsson, M. A.T.S. Biosynthesis, tissue distribution and isolation of laminins. The Laminins. , 1-26 (1994).
  23. Fedecostante, M., et al. Recellularized native kidney scaffolds as a novel tool in nephrotoxicity screening. Drug Metabolism and Disposition: the Biological Fate of Chemicals. 46 (9), 1338-1350 (2018).
  24. Wagner, D. E., et al. Comparative decellularization and recellularization of normal versus emphysematous human lungs. Biomaterials. 35 (10), 3281-3297 (2014).
  25. Brouki Milan, P., et al. Decellularization and preservation of human skin: A platform for tissue engineering and reconstructive surgery. Methods. 171, 62-67 (2020).
  26. Lamandé, S. R., Bateman, J. F. Collagen VI disorders: Insights on form and function in the extracellular matrix and beyond. Matrix Biology. 71, 348-367 (2018).
  27. Baptista, P. M., et al. The use of whole organ decellularization for the generation of a vascularized liver organoid. Hepatology. 53 (2), 604-617 (2011).
  28. White, L. J., et al. The impact of detergents on the tissue decellularization process: a ToF-SIMS study. Acta Biomaterialia. 50, 207-219 (2017).
  29. Nakayama, K. H., Batchelder, C. A., Lee, C. I., Tarantal, A. F. Renal tissue engineering with decellularized rhesus monkey kidneys: age-related differences. Tissue Engineering. Part A. 17 (23-24), 2891-2901 (2011).
  30. Ma, X., et al. Development and in vivo validation of tissue-engineered, small-diameter vascular grafts from decellularized aortae of fetal pigs and canine vascular endothelial cells. Journal of Cardiothoracic Surgery. 12 (1), 101 (2017).
  31. Wu Young, M. Y., et al. Decellularized fetal matrix suppresses fibrotic gene expression and promotes myogenesis in a rat model of volumetric muscle loss. Plastic and Reconstructive Surgery. 146 (3), 552-562 (2020).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

JoVE 193

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved