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In diesem Artikel

  • Zusammenfassung
  • Zusammenfassung
  • Einleitung
  • Protokoll
  • Ergebnisse
  • Diskussion
  • Offenlegungen
  • Danksagungen
  • Materialien
  • Referenzen
  • Nachdrucke und Genehmigungen

Zusammenfassung

In dieser Arbeit wurde ein Dezellularisierungsprotokoll optimiert, um dezellularisierte Matrices des fetalen Mausskelettmuskels zu erhalten. C2C12-Myoblasten können diese Matrices besiedeln, sich vermehren und differenzieren. Mit diesem In-vitro-Modell kann das Zellverhalten im Kontext von Skelettmuskelerkrankungen wie Muskeldystrophien untersucht werden.

Zusammenfassung

Die extrazelluläre Matrix (EZM) spielt eine entscheidende Rolle bei der strukturellen Unterstützung von Zellen und der Übertragung von Signalen, die für verschiedene zelluläre Prozesse wichtig sind. Zweidimensionale (2D) Zellkulturmodelle vereinfachen die komplexen Interaktionen zwischen Zellen und der EZM zu sehr, da das Fehlen eines vollständigen dreidimensionalen (3D) Trägers das Zellverhalten verändern kann, so dass sie für das Verständnis von In-vivo-Prozessen nicht ausreichen. Defizite in der EZM-Zusammensetzung und Zell-EZM-Interaktionen tragen wesentlich zu einer Vielzahl unterschiedlicher Erkrankungen bei.

Ein Beispiel ist die LAMA2-kongenitale Muskeldystrophie (LAMA2-CMD), bei der das Fehlen oder die Verringerung der funktionellen Laminine 211 und 221 zu einer schweren Hypotonie führen kann, die bei oder kurz nach der Geburt nachweisbar ist. Frühere Arbeiten mit einem Mausmodell der Krankheit deuten darauf hin, dass sie während der fetalen Myogenese ausbricht. Ziel der vorliegenden Studie war es, ein 3D-In-vitro-Modell zu entwickeln, das es ermöglicht, die Interaktionen zwischen Muskelzellen und der fetalen Muskel-EZM zu untersuchen und die native Mikroumgebung nachzuahmen. Bei diesem Protokoll werden tiefe Rückenmuskeln verwendet, die von E18.5-Mausföten präpariert und mit einem hypotonen Puffer, einem anionischen Detergens und DNase behandelt wurden. Die resultierenden dezellularisierten Matrices (dECMs) behielten alle getesteten EZM-Proteine (Laminin α2, Gesamtlaminine, Fibronektin, Kollagen I und Kollagen IV) im Vergleich zum nativen Gewebe bei.

Wenn C2C12-Myoblasten auf diese dEZMs gesät wurden, drangen sie in die dEZMs ein und besiedelten sie, was ihre Proliferation und Differenzierung unterstützte. Darüber hinaus produzierten die C2C12-Zellen ECM-Proteine, die zum Umbau ihrer Nische innerhalb der dECMs beitrugen. Die Etablierung dieser In-vitro-Plattform bietet einen neuen vielversprechenden Ansatz zur Entschlüsselung der Prozesse, die an der Entstehung von LAMA2-CMD beteiligt sind, und hat das Potenzial, an andere Skelettmuskelerkrankungen angepasst zu werden, bei denen Defizite in der Kommunikation zwischen der EZM und den Skelettmuskelzellen zum Fortschreiten der Krankheit beitragen.

Einleitung

Die extrazelluläre Matrix (EZM) ist ein Hauptbestandteil von Geweben und stellt deren nicht-zelluläre Komponente dar. Diese dreidimensionale (3D) Struktur bietet nicht nur physikalischen Halt für Zellen, sondern spielt auch eine entscheidende Rolle bei den biochemischen Prozessen, die an der Entwicklung von Organismen beteiligt sind1. Die Bildung einer gewebespezifischen EZM erfolgt während der Entwicklung durch die komplexen Wechselwirkungen zwischen Zellen und ihren Nischen, die durch verschiedene intra- und extrazelluläre Reize beeinflusst werden. Die EZM ist eine hochdynamische Struktur, die chemisch und mechanisch zeitlich-räumlich umgelagert wird und sich direkt auf das Zellschicksalauswirkt 2. Eines der bemerkenswertesten Merkmale der EZM ist ihre funktionelle Vielfalt, da jede Gewebe-EZM eine einzigartige Kombination von Molekülen aufweist, die unterschiedliche Topologien und Eigenschaften bieten, die auf die darin enthaltenen Zellen zugeschnitten sind1.

Die Signalübertragung und Unterstützung der EZM ist entscheidend für die Entwicklung und Homöostase und kann, wenn sie gestört ist, zu multiplen pathologischen Zuständen führen 3,4. Ein Beispiel ist die LAMA2-defiziente kongenitale Dystrophie (LAMA2-CMD), die häufigste Form der angeborenen Muskeldystrophie. Das LAMA2-Gen kodiert für die Laminin-α2-Kette, die in Laminin 211 und Laminin 221 vorkommt und bei Mutation zu LAMA2-CMD 5 führen kann. Laminin 211 ist die Hauptisoform, die in der Basalmembran vorkommt, die die Skelettmuskelfasern umgibt. Wenn Laminin 211 abnormal ist oder fehlt, ist die Verbindung zwischen der Basalmembran und den Muskelzellen gestört, was zum Ausbruch der Krankheit führt6. Patienten mit LAMA2-CMD zeigen einen leichten bis schweren Phänotyp, abhängig von der Art der Mutation im LAMA2-Gen.

Wenn die Funktion des Laminin-α2-Proteins beeinträchtigt ist, kann es bei der Geburt zu einer schweren Muskelhypotonie kommen und chronische Entzündungen, Fibrose und Muskelatrophie entwickeln, was zu einer verkürzten Lebenserwartung führt. Bisher wurden keine zielgerichteten Therapien entwickelt und die therapeutischen Ansätze beschränken sich auf die Linderung der Krankheitssymptome7. Daher ist das Verständnis der zugrunde liegenden molekularen Mechanismen, die an der Entstehung dieser Krankheit beteiligt sind, von entscheidender Bedeutung, um geeignete therapeutische Strategien zu entwickeln 6,8. Frühere Arbeiten mit der dy-W-Maus9, einem Modell für LAMA2-CMD, deuten darauf hin, dass der Ausbruch der Krankheit in utero beginnt, insbesondere während der fetalen Myogenese10. Ein besseres Verständnis der Entstehung des fetalen Myogenesedefekts wäre ein entscheidender Faktor bei der Entwicklung neuer therapeutischer Ansätze für LAMA2-CMD.

In-vitro-Systeme bieten eine kontrollierte Umgebung für die Untersuchung von Zell-Zell- und Zell-EZM-Interaktionen, aber 2D-Kulturmodellen fehlt die Komplexität nativer Gewebe. Die Dezellularisierung von Geweben erzeugt gewebe- und entwicklungsstadienspezifische azelluläre ECM-Gerüste, die im Vergleich zu 2D-Modellen und technischen/synthetischen Gerüsten die natürliche Mikroumgebung der Zellen genauer nachahmen. Dezellularisierte Matrices (dEZMs) haben das Potenzial, die molekularen und mechanischen Signale des Wirtsgewebes zu erhalten, was sie zu besseren alternativen Modellen für das Verständnis von In-vivo-Prozessen macht11.

Es gibt verschiedene Techniken, Reagenzien und Bedingungen, die für die Dezellularisierung verwendet werden können12,13. In dieser Studie wurde ein Dezellularisierungsprotokoll für das fetale Mausherz, das von Silva et al.14,15 beschrieben wurde, an die fetale Mausskelettmuskulatur angepasst und es wurde festgestellt, dass alle getesteten EZM-Komponenten (Laminin α2, Gesamtlaminine, Fibronektin, Kollagen I und Kollagen IV) erhalten bleiben. Das Protokoll umfasst drei Schritte: Zelllyse durch osmotischen Schock (hypotoner Puffer), Auflösung der Plasmamembran und Proteindissoziation (0,05 % Natriumdodecylsulfat [SDS]) und enzymatische Zerstörung der DNA (DNase-Behandlung). Unseres Wissens ist dies das erste etablierte Protokoll zur Dezellularisierung des fetalen Skelettmuskels der Maus.

Um dieses 3D-In-vitro-System für die Untersuchung von LAMA2-CMD zu verwenden, ist es entscheidend, die Laminin-α2-Kette nach der Dezellularisierung beizubehalten. Daher wurde ein Optimierungsprotokoll implementiert, bei dem verschiedene Detergenzien (SDS und Triton X-100) und Konzentrationen (0,02 %, 0,05 %, 0,1 %, 0,2 % und 0,5 %) getestet wurden (Daten nicht gezeigt). Die optimale Wahl für die Zellentfernung und Konservierung des Laminin-α2-Proteins war 0,05 % SDS. C2C12-Zellen, eine gut etablierte Myoblasten-Zelllinie16,17, wurden verwendet, um die dEZMs zu besiedeln. Diese Zellen dringen in das dEZM ein, vermehren sich und differenzieren sich innerhalb dieser Gerüste, wobei sie neue EZM-Proteine synthetisieren. Die erfolgreiche Herstellung dieses 3D-In-vitro-Modells bietet einen neuen Ansatz zum Verständnis der molekularen und zellulären Prozesse, die an der fetalen Myogenese und dem Auftreten von LAMA2-CMD beteiligt sind, und kann auf andere Muskelerkrankungen ausgeweitet werden, bei denen die Kommunikation zwischen der EZM und den Skelettmuskelzellen gestört ist.

Protokoll

Alle beschriebenen Methoden wurden vom Tierschutzausschuss (ORBEA) der Fakultät für Naturwissenschaften der Universität Lissabon und der Direção Geral de Veterinária (DGAV; Ref. 0421/000/000/2022) genehmigt und entsprechen der europäischen Richtlinie 2010/63/EU.

1. Herstellung von Dezellularisierungspuffern und Reagenzien

Anmerkungen: Alle Lösungen, die während des Dezellularisierungsprotokolls verwendet werden, sollten durch Autoklavieren sterilisiert und bis zu 3 Monate gelagert werden, sofern nicht anders angegeben.

  1. Bereiten Sie 10x phosphatgepufferte Kochsalzlösung (10x PBS) durch Zugabe von Natriumchlorid (NaCl) bei 137 mM, Kaliumchlorid (KCl) bei 2,68 mM, Kaliumdihydrogenphosphat (KH 2 PO 4) bei 8,1 mM und Dinatriumhydrogenphosphatdihydrat (Na 2 HPO4) bei 1,47 mM zu demineralisiertem Wasser (dH2O) her und stellen Sie den pH-Wert auf 6,8 ein. Fügen Sie 100 ml 10x PBS zu 900 mL demineralisiertemH2Ohinzu, um 1x PBS zu erzeugen. Autoklavieren und bei Raumtemperatur (RT) lagern. Fügen Sie sterile Penicillin/Streptomycin-Stammlösung (10.000 E/ml Penicillin und 10 mg/ml Streptomycin [Pen/Streptokokken]) vor der Anwendung zu einer Endkonzentration von 1 % hinzu.
  2. Bereiten Sie den hypotonen Puffer vor, indem Sie 1,21 g Tris(hydroxymethyl)aminomethan (Tris-Base) und 1 g Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA) in 1 ldH2O(10 mM Tris-Base 0,1 % EDTA) auflösen. Verwenden Sie einen Magnetrührer, bis er sich aufgelöst hat, und stellen Sie den pH-Wert mit NaOH/HCl auf 7,8 ein. Sterilisieren Sie es durch Autoklavieren und lagern Sie es bei RT. Fügen Sie Pen/Streptokokken vor Gebrauch in einer Endkonzentration von 1% hinzu.
  3. Bereiten Sie den hypotonen Waschpuffer vor, indem Sie 1,21 g Trisbase in 1 LdH2O (10 mM Trisbase) auflösen. Verwenden Sie einen Magnetrührer, bis er sich aufgelöst hat, und stellen Sie den pH-Wert mit NaOH/HCl auf 7,8 ein. Autoklavieren und bei RT lagern. Fügen Sie Pen/Streptokokken vor Gebrauch zu 1% hinzu.
  4. Bereiten Sie die anionische Waschmittelbehandlung vor, indem Sie 0,05 g Natriumdodecylsulfat (SDS) zu 100 ml hypotonem Waschpuffer hinzufügen, um eine 0,05%ige SDS-Behandlungslösung herzustellen. Filtern Sie durch einen 0,22 μm Membranfilter. Bei RT bis zu 1 Monat lagern.
    Anmerkungen: Die SDS-Lösung sollte nicht autoklaviert werden, da SDS beim Autoklavieren ausfällt und sich zersetzt.
  5. Bereiten Sie die DNase-Behandlungslösung vor, indem Sie 1,21 g Trisbase in 0,5 ml dH2O auflösen und 1 ml 1 M Magnesiumchlorid (MgCl2) hinzufügen. Stellen Sie den pH-Wert mit NaOH/HCl auf 7,8 ein. Autoklavieren und bei RT lagern. Fügen Sie vor Gebrauch DNase I hinzu (50 U/ml).

2. Probenentnahme

HINWEIS: In der Studie wurden Wildtyp-C57/BL6-Mäuse verwendet. Alle Techniken wurden in einer Laminar-Flow-Haube unter sterilen Bedingungen durchgeführt.

  1. Euthanasieren Sie erwachsene schwangere weibliche Mäuse am Embryonaltag (E) 18,5 der Schwangerschaft mittels Isofluran-Inhalation, gefolgt von einer Zervixluxation. Unterziehen Sie die Mäuse einer terminalen Dissektion, um die Föten zu extrahieren.
    1. Besprühen Sie den Bauch der Maus mit 70% Ethanol.
    2. Heben Sie mit einer chirurgischen Zange und einer Schere eine Hautfalte im Unterbauch an und machen Sie einen U-förmigen Schnitt, um die Bauchhöhlefreizulegen 18.
    3. Sammeln Sie die Gebärmutterhörner mit den E18.5-Föten durch Durchtrennen der Eileiter und des Gebärmutterhalses und übertragen Sie sie sofort in eine Petrischale mit eiskaltem 1x PBS mit 1% Pen/Streptokokken18.
    4. Entfernen Sie die Föten schnell aus der Gebärmutter und dem extraembryonalen Gewebe und euthanasieren Sie sie durch Enthauptung mit einer Schere18.
  2. Übertragen Sie einen Fötus nach dem anderen in eine Petrischale mit eiskaltem 1x PBS. Entfernen Sie mit einem Stereomikroskop die Haut und schneiden Sie die Gliedmaßen ab. Schneiden Sie von der ventralen Seite den Brustkorb durch und entfernen Sie das Brustbein und die darunter liegenden Organe.
  3. Drehen Sie den fetalen Rumpf mit der dorsalen Seite nach oben. Entfernen Sie den zervikalen Teil der Wirbelsäule, die dorsalen Fettdepots und das Bindegewebe über der tiefen Rückenmuskulatur.
  4. Verwenden Sie eine chirurgische Pinzette, um den Brustkorb zu verankern, und kratzen und lösen Sie die tiefe Rückenmuskulatur vorsichtig mit einem Mikroskalpell10 vom umgebenden Gewebe. Dieses Verfahren führt zur Isolierung von zwei Muskelstücken pro Fötus (links und rechts), die beide hauptsächlich aus dem Musculus longissimus und dem Musculus iliocostalis bestehen, wobei einige der Musculus transversospinalis und des Musculus levator costarum eingeschlossen sind.
  5. Lagern Sie die Muskelproben in 1x PBS mit 1% Pen/Streptokokken bei 4 °C zur kurzfristigen Lagerung (<1 Woche) oder bei -80 °C für längere Zeiträume.
    HINWEIS: Verwenden Sie frisch entnommene Proben, um beste Ergebnisse zu erzielen. Proben, die über einen längeren Zeitraum (>3 Monate) eingefroren wurden, zeigen eine geringere Dezellularisierungseffizienz und einen stärkeren Proteinabbau. Für die Dezellularisierungsexperimente wurden epaxiale Muskelmassen verwendet, aber auch andere Muskeln (z. B. Extremitätenmuskeln) können mit dem gleichen Protokoll für die Dezellularisierung verarbeitet werden.

3. Dezellularisierung der fetalen Skelettmuskulatur

HINWEIS: Alle Techniken wurden in einer Laminar-Flow-Haube unter sterilen Bedingungen durchgeführt. Eine detaillierte schematische Darstellung finden Sie in Abbildung 1A. Alle Schritte wurden, sofern nicht anders angegeben, mit Rühren in einem Orbitalschüttler mit einem Durchmesser von 120 mm (165 U/min) bei 25 °C durchgeführt. Fügen Sie den Lösungen vor der Anwendung 1% Pen/Streptokokken hinzu. Wenn Sie die Lösungen entfernen, saugen Sie vorsichtig ab, um ein Einfangen der Probe in der Pipette zu vermeiden.

  1. Tag 1 - Präparation von ca. 2 mm x 1 mm x 1 mm (~3,5 mg) Gewebefragmenten aus den epaxialen Muskelmassen. Geben Sie 3 ml hypotonen Puffer mit 1 % Pen/Streptokokken in jede Vertiefung einer 12-Well-Platte und fügen Sie ein ganzes Muskelgewebefragment pro Well hinzu.
    1. Inkubieren Sie die Gewebefragmente in hypotonem Puffer unter Rühren für 18 h (über Nacht) (O/N).
  2. Tag 2 - Saugen Sie den hypotonen Puffer mit einer Feinpipette ab und waschen Sie die Proben 3 x 1 h mit jeweils 3 ml 1x PBS unter Rühren.
    1. Die Proben werden 24 h lang mit 3 ml 0,05%iger SDS-Reinigungslösung unter Rühren inkubiert.
      HINWEIS: (PRÜFPUNKT) Nach der SDS-Inkubation sollten die Proben transparent aussehen. Die Proben weisen eine gelatineartige Konsistenz auf und neigen daher beim Entfernen der Flüssigkeiten eher dazu, an der Pipette zu haften.
  3. Tag 3 - Entfernen Sie die SDS-Reinigungslösung mit einer Feinpipette und waschen Sie die Gewebefragmente 3 x 20 min mit jeweils 3 ml hypotonem Waschpuffer unter Rühren.
    ANMERKUNG: (PAUSENPUNKT) Die Proben können 18 h (O/N) in hypotonem Waschpuffer bei 4 °C aufbewahrt werden. Stellen Sie sicher, dass SDS während der Waschschritte gut entfernt wird, da SDS-Reste zytotoxisch sein können.
    1. Inkubieren Sie die Gewebefragmente 3 h lang mit 2 mL DNase-Lösung unter Rühren bei 37 °C.
    2. Entfernen Sie die DNase-Lösung mit einer Feinpipette und waschen Sie die Gewebefragmente 3 x 20 min mit jeweils 3 mL 1x PBS unter Rühren. Zum Schluss O/N mit Rühren (60 U/min) waschen.
      HINWEIS: Nach der DNase-Behandlung werden die dECMs aufgrund des Vorhandenseins von DNA-Resten klebrig. Daher ist sorgfältiges Waschen notwendig.
    3. Lagern Sie die dEZMs in 1x PBS mit 1% Pen/Streptokokken bei 4 °C bis zur Rezellularisierung (<1 Woche). Für andere Zwecke bei -80 °C lagern.

4. Qualitätsbewertung der Dezellularisierung

HINWEIS: DNA-Quantifizierung, DAPI/Methylgrün-Färbung und Phalloidin-Färbung wurden durchgeführt, um das Vorhandensein von Restzellinhalten nach der Dezellularisierung zu bewerten. Immunhistochemie und Western-Blot-Analysen wurden durchgeführt, um den Verbleib von Schlüsselproteinen der EZM nach der Dezellularisierung zu beurteilen.

  1. Quantifizierung der im dECM vorhandenen DNA
    HINWEIS: Die dEZMs sollten mit dem nativen Gewebe verglichen werden, um das Vorhandensein von DNA nachzuweisen.
    1. Vor der Dezellularisierung wird ein 1,5-ml-Mikrozentrifugenröhrchen auf einer hochpräzisen Digitalwaage gewogen. Bevor Sie die Muskelprobe in das Röhrchen übertragen, entfernen Sie alle verbleibenden 1x PBS mit einem Papiertuch. Wiegen Sie das Röhrchen mit der Probe. Berechnen Sie das Nassgewicht der Proben mit Gleichung (1):
      Nassgewicht der Probe =Gewichtsröhrchen mit Proben - Gewichtleeres Röhrchen (1)
    2. Dezellularisieren Sie die Proben gemäß dem in Abschnitt 3 beschriebenen Protokoll.
    3. Legen Sie die Proben in 2-ml-Mikrozentrifugenröhrchen.
      HINWEIS: Die Proben können bis zur DNA-Extraktion und -Quantifizierung bei -20 °C aufbewahrt werden.
    4. Führen Sie die DNA-Extraktion der dECMs und nativer Gewebeproben mit einem Spinsäulen-basierten Kit durch. Fügen Sie den Aufschlusspuffer gemäß den Anweisungen des Herstellers hinzu.
    5. Homogenisieren Sie die Proben in einer Perlmühle zweimal für jeweils 2,5 Minuten (Umdrehen der Halterungen) mit einer Wolframkarbidperle pro Röhrchen (verwenden Sie gekühlte Röhrchenhalterungen).
    6. Proteinase K zugeben und O/N unter langsamem Rühren bei 56 °C inkubieren.
    7. Fahren Sie mit dem Protokoll fort, wie es in der Anleitung des Herstellers beschrieben ist.
    8. Mit dem vom Hersteller bereitgestellten Puffer eluieren und 2 x 1 min bei ≥6.000 x g zentrifugieren, jeweils bei 4 °C, um die DNA-Ausbeute zu erhöhen.
      HINWEIS: Die DNA kann bis zur Quantifizierung bei -20 °C gelagert werden.
    9. Quantifizieren Sie die in den Proben vorhandene DNA mit einem fluoreszierenden dsDNA-Detektionskit gemäß den Anweisungen des Herstellers.
    10. Normalisieren Sie den DNA-Gehalt als Nanogramm DNA pro Milligramm des ursprünglichen Nassgewichts der Probe.
    11. Analysieren Sie die Daten mit einem zweiseitigen Student-t-Test und drücken Sie als Mittelwert ± Standardfehler des Mittelwerts (SEM) aus.
  2. Immunhistochemie
    Anmerkungen: Die Lösungen 1, 2 und 3 sowie die Fixierlösung sollten vor Gebrauch zubereitet werden und können bis zu 6 Monate eingefroren aufbewahrt werden. Alle verwendeten Antikörper und Farbstoffe sowie die entsprechenden Verdünnungen sind in Tabelle 1.
    1. Aufbereitung von Lösungen
      1. Stellen Sie eine Fixierlösung her, indem Sie 2 g Paraformaldehyd (PFA), 8 g Saccharose und 24 μl 1 M CaCl 2 auf 77 ml 0,2 M Na 2 HPO 4 und 23 ml0,2M NaH2 PO 4 zu einem Endvolumen von 200 mL durch Zugabe vondH2Ozugeben. Stellen Sie den pH-Wert auf7,4 ein.
      2. Bereiten Sie 0,12 M Phosphatpuffer vor, indem Sie 13,5 g Na2 HPO4 und 3,2 gNaH2PO4 auf 1 LdH2Ozugeben. Stellen Sie den pH-Wert auf7,4 ein.
      3. Bereiten Sie Lösung 1 zu, indem Sie 4 g Saccharose zu 100 ml 0,12 M Phosphatpuffer hinzufügen.
      4. Lösung 2 wird durch Zugabe von 15 g Saccharose zu 100 ml 0,12 M Phosphatpuffer hergestellt.
      5. Lösung 3 wird durch Zugabe von 15 g Saccharose und 7,5 g Gelatine zu 100 ml 0,12 M Phosphatpuffer hergestellt. Bei 37 °C erhitzen, bis sich die Gelatine aufgelöst hat.
      6. Methylgrüne Stammlösung (2%iges Methylgrünpulver, gelöst indH2O)19 herstellen.
    2. Immundetektion
      1. Fixieren Sie die Proben mit der Fixierlösung für mindestens 4 h bei 4 °C.
      2. Waschen Sie die Proben 2x für 10 min mit 1x PBS.
      3. Bewahren Sie O/N oder länger als 1 Tag in Lösung 1 bei 4 °C auf.
      4. Waschen und O/N oder länger als 1 Tag in Lösung 2 bei 4 °C aufbewahren. Lassen Sie die Proben auf RT erwärmen.
      5. 3 h in Lösung 3 bei 37 °C inkubieren. Bewahren Sie die zusätzliche Lösung 3 bei 37 °C auf, um sie später verwenden zu können.
      6. Kleine (2 cm x 1 cm x 1 cm) Behälter aus Alufolie formen. Geben Sie eine dünne Schicht Lösung 3 in den geformten Behälter und lassen Sie sie aushärten. Die Proben werden auf die erstarrte Lösung 3 gelegt und mit warmer Lösung 3 bedeckt. Richten Sie die Proben aus und lassen Sie sie erstarren. Markieren Sie die Stelle auf der erstarrten Lösung 3 mit einem Farbstift.
      7. Frieren Sie die Behälter ein, indem Sie sie auf die Oberfläche von trockeneisgekühltem oder mit flüssigem Stickstoff gekühltem Isopentan stellen.
      8. Fixieren Sie die gefrorenen Gelatinewürfel mit den Proben unter Verwendung der optimalen Schneidtemperatur (O.C.T.) auf der Kryostathalterung.
      9. Schneiden Sie die gefrorenen Gelatinewürfel und übertragen Sie die Gewebeschnitte auf die Objektträger. 60 Minuten trocknen lassen.
      10. Verwenden Sie einen hydrophoben Marker, um eine Linie um die Abschnitte zu ziehen.
      11. Waschen Sie die Objektträger 3 x 10 min in 1x PBS.
      12. Bedecken Sie die Abschnitte mit 1 % Kälberserumalbumin (BSA), 1 % Ziegenserum und 0,05 % Triton X-100, verdünnt in 1x PBS (Blockierungslösung) für 30 min (Blockierungsschritt).
      13. Verdünnen Sie die primären Antikörper in Blockierlösung und decken Sie die Abschnitte ab. Inkubieren Sie O/N bei 4 °C in einer geschlossenen Box mit feuchtem Papier, um ein Austrocknen der Abschnitte zu verhindern.
      14. Waschen Sie die Objektträger 3 x 10 min mit 1x PBS.
      15. Verdünnen Sie die sekundären Antikörper in Blockierlösung und decken Sie die Abschnitte ab. 1,5 h bei RT im Dunkeln inkubieren.
        Anmerkungen: Vermeiden Sie Lichteinstrahlung, um den Abbau von Fluorophoren zu verhindern.
      16. Waschen Sie die Objektträger 3 x 10 min mit 4x PBS.
        HINWEIS: Eine höhere PBS-Konzentration kann verwendet werden, wenn ein starker Hintergrund vorhanden ist.
      17. Tauchen Sie die Objektträger für jeweils 30 s in DAPI-Lösung (5 μg/ml 1,4-Diazabicyclo-2,2,2-Oktan in 0,1 % Triton X-100/1x PBS).
      18. In 1x PBS ausspülen.
      19. Montieren Sie die Abschnitte in einem lichtbeständigen Medium (50 mg/ml n-Propylgallat in 1x PBS:Glycerin [1:9]) und verschließen Sie sie mit einem Deckglas. Bei 4 °C bis zur Betrachtung und Bildaufnahme in einem Fluoreszenzmikroskop20 lagern.
        ANMERKUNG: Für die immunhistochemischen In-toto-Experimente wurde das gleiche Protokoll (siehe Schritte 4.2.2.12-4.2.2.18) verwendet, mit der Ausnahme, dass die Proben zuvor in 4% PFA, verdünnt in 1x PBS, für 3 h bei RT fixiert wurden. Die DNA-Färbung wurde durch Zugabe von Methylgrün zur sekundären Antikörperlösung durchgeführt. Alle verwendeten Antikörper und Farbstoffe sowie ihre jeweiligen Verdünnungen sind in Tabelle 1 aufgeführt. Die Proben wurden dann in einem lichtbeständigen Medium zwischen zwei Deckgläsern montiert, die durch Stahlringe getrennt waren, mit Bienenwachs zusammengeklebt, und es wurden 100 μm-Bildstapel mit einem konfokalen Mikroskop21 aufgenommen.
  3. Western-Blot-Analyse
    HINWEIS: Alle verwendeten Antikörper und die entsprechenden Verdünnungen sind in Tabelle 1.
    1. Aufbereitung von Lösungen
      1. Bereiten Sie den 2x SDS-PAGE-Ladepuffer vor, indem Sie 20 ml Glycerin, 4 g SDS und 0,2 ml Bromphenolblau zu 80 ml 100 mM Tris-Basenlösung hinzufügen. Stellen Sie den pH-Wert auf 6,8 ein. Fügen Sie vor Gebrauch frisches Dithiothreitol (DTT) hinzu.
      2. Bereiten Sie den Tris-gepufferten Kochsalzlösung-Waschpuffer mit Tween-20-Lösung (TBST) vor, indem Sie 2,4 g Tris-Base, 8,8 g NaCl und 1 ml Tween-20 zu dH2O zu einem Endvolumen von 1 l hinzufügen. Stellen Sie den pH-Wert mit HCl auf 7,4-7,6 ein.
      3. Bereiten Sie den 10-fachen Laufpuffer (RB) vor, indem Sie 30,2 g Tris-Base, 144,2 g Glycin und 10 g SDS zu 1 l dH2O hinzufügen. Vor Gebrauch 100 ml 10x RB zu 900 ml dH2O hinzufügen, um 1x RB (Arbeitslösung) herzustellen.
        HINWEIS: Während 10x RB mehrere Monate bei RT gelagert werden kann, kann 1x RB für verschiedene Läufe wiederverwendet werden.
      4. Bereiten Sie den Transferpuffer (TB) vor, indem Sie 5,82 g Trisbase, 2,93 g Glycin und 0,5 g SDS zu 800 mldH2Ohinzufügen. Nachdem die Komponenten aufgelöst sind, fügen Sie 200 ml Methanol hinzu. Bei 4 °C kalt stellen.
        HINWEIS: Der TB sollte vor jedem Gebrauch frisch zubereitet werden.
    2. Protein-Extraktion
      1. Sammeln Sie epaxiale Muskeln von E18.5-Mäusen und legen Sie sie sofort in ein Mikrozentrifugenröhrchen (2 ml), das 2x SDS-PAGE-Ladepuffer mit frisch zugegebenem DTT (100 mM DTT) enthält. Verarbeiten Sie E18.5 dECM auf die gleiche Weise.
      2. Fügen Sie eine Wolframkarbidperle pro Rohr hinzu. 2x in einer Perlmühle jeweils 2,5 min homogenisieren (Halterungen umdrehen).
      3. Beschallen Sie die Proben 5 Minuten lang in einem Ultraschallbad.
      4. Die Proben werden 10 min bei 50 °C erhitzt.
      5. Zentrifugieren Sie die Proben bei 12.000 × g für 15 min bei 4 °C.
      6. Übertragen Sie den Überstand in ein frisches 1,5-ml-Mikrozentrifugenröhrchen.
      7. Quantifizieren Sie das Protein mit einem Mikrovolumen-Spektralphotometer.
      8. Bis zur weiteren Verwendung bei -20 °C lagern.
    3. Polyacrylamid-Gelelektrophorese
      1. Verwenden Sie vorgefertigtes Acrylamid-Gradientengel (4%-20%)
      2. Montieren Sie das Gel im Elektrophoresetank. Entfernen Sie den Kamm vorsichtig. Fügen Sie 1x RB hinzu, bis die Linie im Elektrophoresebehälter angezeigt wird. Stellen Sie sicher, dass die Vertiefungen mit RB gefüllt sind.
      3. Laden Sie 100 μg Protein pro Probe in die Vertiefungen. Laden Sie 12 μl hochmolekularen Proteinstandard.
      4. Insgesamt 100 min mit konstanter Spannung laufen lassen (10 min bei 150 V und 90 min bei 185 V).
    4. Übertragung
      1. Tränken Sie die Filtermatten und Schwämme mit gekühltem TB (4 °C), während das Gel läuft.
      2. Schneiden Sie die Polyvinyliden-Difluorid-Membranen auf die Größe des Gels zu. Aktivieren Sie sie mit Methanol und waschen Sie sie mit dH2O. In TB einweichen.
      3. Montieren Sie die Transferkassette mit den Schwämmen, Filtermatten, Gelen und aktivierten Membranen gemäß den Anweisungen des Herstellers.
      4. Legen Sie die Kassette in den Elektrophoresebehälter mit dem gekühlten TB (auf ein Eisbett). Fügen Sie die Kühleinheit hinzu. 90 Minuten bei 100 V laufen lassen.
      5. Nach dem Transfer mit einem Coomassie-Blau-Ersatz färben, um die Transferqualität zu beurteilen.
    5. Immundetektion
      1. Bereiten Sie die Blockierlösung vor (TBST mit 5% fettarmer Milch). Inkubieren Sie die Membranen unter Rühren für 1 h bei RT.
      2. 3 x 5 s mit TBST ausspülen.
      3. Inkubieren Sie die Membranen O/N mit den in TBST verdünnten Primärantikörpern mit 2 % BSA und 0,02 % Natriumazid (3 ml pro Membran) in einer Kältekammer (4 °C) unter Rühren.
      4. Am nächsten Tag 3 x 5 min mit TBST waschen.
      5. Die Membranen werden mit Meerrettichperoxidase (HRP)-konjugierten Sekundärantikörpern, die in TBST mit 5%iger fettarmer Milch (5 ml für jede Membran) verdünnt wurden, für 1 h bei RT inkubiert.
      6. Waschen Sie die Membranen mit TBST 3 x 5 min. Bleiben Sie bis zum Erkennungsschritt in TBST.
      7. Visualisieren Sie das Protein mit einem handelsüblichen Entwicklungskit. Fügen Sie Nachweisreagenzien gemäß den Anweisungen des Herstellers hinzu. Erfassen Sie Bilder der Bands.
      8. Um mehr als einen Antikörper pro Membran zu testen, werden die ehemaligen Antikörper nach dem Nachweisschritt mit drei Waschgängen (je 5 Minuten) mit TBST abgestreift und die Schritte 4.3.5.2 bis 4.3.5.7 wiederholt.

Tabelle 1: Antikörper und Farbstoffe, die in der Immunhistochemie und Western-Blot-Analyse verwendet werden, und die entsprechenden Verdünnungen. Bitte klicken Sie hier, um diese Tabelle herunterzuladen.10,22

5. Zellkultur in dezellularisierten Matrices

HINWEIS: Alle Techniken wurden unter sterilen Bedingungen in einer Laminar-Flow-Haube durchgeführt. Alle Inkubationen wurden bei 37 °C und 5% CO2 durchgeführt.

  1. Bereiten Sie das Zellkulturmedium Dulbecco's Modified Eagle Medium mit hohem Glukosegehalt mit stabilem Glutamin und Natriumpyruvat (DMEM) vor, ergänzt mit 10 % fötalem Kälberserum (FBS) und 1 % Pen/Streptokokken (komplettes Nährmedium).
  2. Legen Sie die dECMs in eine Petrischale in 1x PBS mit 1% Pen/Streptokokken in eine Laminar-Flow-Haube und trennen Sie sie mit einem Mikroskalpell und einer Pinzette in Stücke von ca. 500 μm x 500 μm x 250 μm.
    HINWEIS: dECMs haben eine weiche Textur und daher ist es oft einfacher, sie mit einer Pinzette in ungefähr gleich große Stücke zu trennen, anstatt sie mit dem Mikroskalpell zu schneiden.
  3. Die Fragmente werden in eine 96-Well-Platte (drei oder vier Stück pro Well) mit 200 μl vollständigem Nährmedium überführt, das zuvor auf 37 °C erwärmt wurde. 2 h im Inkubator inkubieren.
  4. Geben Sie 500 μl Trypsin in einen T25-Kolben, der mit subkonfluenten (~70%) C2C12-Zellen besiedelt ist. Resuspendieren in 1 ml des vollständigen Mediums.
  5. Geben Sie 10 μl der Resuspension zu 10 μl Trypanblau-Farbstoff und laden Sie sie in ein Hämozytometer. Zählen und berechnen Sie die Zellzahl und bestätigen Sie die Zelllebensfähigkeit.
  6. Saugen Sie das Medium von der 96-Well-Platte mit den dEZMs ab und fügen Sie 200 μl vollständiges Nährmedium hinzu, das 50.000 lebensfähige C2C12-Zellen enthält.
  7. Inkubieren Sie 2 Tage lang und übertragen Sie dann die dECMs (mit den Zellen) mit einer Pinzette auf eine 48-Well-Platte mit 400 μl vollständigem Nährmedium. Saugen Sie das Medium alle 2 Tage vorsichtig mit einer Mikropipette ab, um zu verhindern, dass sich die dECMs vom Boden der Vertiefung lösen, und fügen Sie bis zum 8. Tag frisches Medium hinzu.
    HINWEIS: Die Matrizen werden 2 Tage lang in 96-Well-Platten aufbewahrt, um die C2C12-Zelladhäsion an den dEZMs zu fördern, und dann auf eine 48-Well-Platte übertragen, um den Zugang zu einem größeren Volumen des Mediums mit Nährstoffen zu ermöglichen. dECMs sollten am Boden der Vertiefungen haften.
  8. Für das Differenzierungsexperiment wird das komplette Nährmedium am 8. Tag durch Differenzierungsmedium (DMEM ergänzt mit 2 % Pferdeserum und 1 % Pen/Streptokokken) ersetzt, gefolgt von einer Inkubation im Differenzierungsmedium für 4 Tage bis zum 12. Tag.

Ergebnisse

Das Ziel des Dezellularisierungsprotokolls ist es, dEZMs herzustellen, die der Zusammensetzung von nativem Gewebe sehr ähnlich sind. Um die Wirksamkeit des Dezellularisierungsprozesses zu bestimmen, wurden verschiedene Methoden eingesetzt, darunter die Untersuchung der Gewebemorphologie, die Messung des DNA-Spiegels, die Färbung auf F-Aktin und die Analyse von Schlüsselkomponenten der EZM mittels Immunhistochemie und Western-Blotting-Techniken. Konkret wurden fünf Hauptkomponenten der EZM des Skelettmuskelgewebes ana...

Diskussion

Die EZM ist ein komplexes Netzwerk von Makromolekülen, das in allen Geweben vorhanden ist und eine entscheidende Rolle bei der Regulierung des Zellverhaltens und der Zellfunktion spielt2. Die EZM fungiert als physikalisches Gerüst für Zellen, an das sie sich anheften können, und liefert Hinweise, die zelluläre Prozesse wie Proliferation, Motilität, Differenzierung und Apoptose aktiv modulieren. Daher ist die ordnungsgemäße Bildung und Aufrechterhaltung der EZM sowohl für die Entwicklung a...

Offenlegungen

Die Autoren haben keine Interessenkonflikte offenzulegen.

Danksagungen

Diese Arbeit wurde von der Association Française contre les Myopathies (AFM-Téléthon; Vertrags-Nr. 23049), dem MATRIHEALTH-Projekt und der cE3c-Unit-Finanzierung UIDB/00329/2020 finanziert. Wir möchten uns bei unserem Spender Henrique Meirelles bedanken, der sich entschieden hat, das MATRIHEALTH-Projekt zu unterstützen. Diese Arbeit profitierte von den Infrastrukturen der Mikroskopie-Einrichtung der Fakultät für Naturwissenschaften, einem Knotenpunkt der portugiesischen Plattform für BioBildgebung (Referenz PPBI-POCI-01-0145-FEDER-022122), und wir danken Luís Marques für seine Unterstützung bei der Bildaufnahme und -verarbeitung. Abschließend danken wir Marta Palma für die technische Unterstützung und unserem Forschungsteam für die großzügigen Beiträge.

Materialien

NameCompanyCatalog NumberComments
12 Well Cell Culture Plate, Flat, TC, SterileAbdos LabwareP21021
4′,6-Diamidino-2-phenylindole dihydrochlorideMerckD8417
4–20% Mini-PROTEAN TGX Precast GelBio-Rad4561093
48 Well Cell Culture Plate, Flat, TC, SterileAbdos LabwareP21023
96 Well Cell Culture Plate, Flat, TC, SterileAbdos LabwareP21024
Bovine Serum Albumin, Fraction VNZYtechMB04601
BX60 fluorescence microscopeOlympus
Cryostat CM1860 UVLeica
DithiothreitolThermoFisherR0862
DMEM high glucose w/ stable glutamine w/ sodium pyruvateBiowestL0103-500
DNase IPanReac AppliChemA3778
DNeasy Blood & Tissue Kit Qiagen69506
Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA)Merck108418
Fetal bovine serumBiowestS1560-500
Fine tip transfer pipetteThermoFisher15387823
Goat serumBiowestS2000-100
Hera Guard Flow CabinetHeraeus
Heracell 150 CO2 IncubatorThermo Scientific
HiMark Pre-stained Protein StandardInvitrogen
Horse Serum, New Zealand originGibco16050122
HRP-α- Rabbit IgGabcamab205718
HRP-α- Rat IgGabcamab205720
HRP-α-Mouse IgGabcamab205719
ImageJ v. 1.53t
Methyl GreenSigma-Aldrich67060
MM400 Tissue LyserRetsch
NanoDrop ND-1000 Spectrophotometer ThermoFisher
Paraformaldehyde, 16% w/v aq. soln., methanol freeAlfa Aesar043368-9M
Penicillin-Streptomycin (100x) GRiSPGTC05.0100
Phalloidin Alexa 488 Thermo Fisher Sci.A12379
Polystyrene Petri dish 60x15mm with vents (sterile)Greiner Bio-One628161
Qubit dsDNA HS kitThermo ScientificQ32851
Qubit™ 3 FluorometerInvitrogen15387293
S6E Zoom Stereo microscopeLeica
Sodium Dodecyl SulfateMerck11667289001
SuperFrost® Plus adhesion slidesThermo Scientific631-9483
SuperSignal West Pico PLUS Chemiluminescent SubstrateThermo Scientific15626144
TCS SPE confocal microscopeLeica
Tris-(hidroximetil) aminometano (Tris base) ≥99%VWR Chemicals28811.295
Triton X-100Sigma-AldrichX100-100ML
Trypan Blue Solution, 0.4%Gibco15250061
Trypsin-EDTA (0.05%) in DPBS (1X)GRiSPGTC02.0100
TWEEN 20 (50% Solution)ThermoFisher3005
WesternBright PVDF-CL membrane roll (0.22µm)AdvanstaL-08024-001
α-Collagen Iabcamab21286
α-Collagen IVMilliporeAB756P
α-Collagen IVSanta Cruz Biotechnologysc-398655
α-FibronectinSigmaF-3648
α-Laminin α2 SigmaL-0663
α-MHCD.S.H.B.MF20
α-Mouse Alexa 488Molecular ProbesA11017
α-Mouse Alexa 568Molecular ProbesA11019
α-pan-LamininSigmaL- 9393
α-phospho-histone 3Merk Millipore06-570
α-Rabbit Alexa 568Molecular ProbesA21069
α-Rabbit Alexa 488Molecular ProbesA11070
α-Rat Alexa 488Molecular ProbesA11006

Referenzen

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