جهاز التسريب المباشر لتوصيل الجزيئات في النباتات

Summary

تصف هذه المخطوطة جهازا جديدا للتسريب المباشر للنبات لفحص فعالية الجزيئات ضد البكتيريا (Candidatus Liberibacter asiaticus) أو ناقلها للحشرات (Diaphorina citri، Kuwayama) المرتبطة مجتمعة بمرض هوانغ لونغبينغ الحمضيات.

Abstract

يعد اختبار وظيفة المركبات العلاجية في النباتات مكونا مهما في البحوث الزراعية. تعتبر طرق النقع الورقي والتربة روتينية ولكن لها عيوب ، بما في ذلك الامتصاص المتغير والانهيار البيئي للجزيئات المختبرة. إن حقن جذع الأشجار راسخ ، لكن معظم الطرق لذلك تتطلب معدات باهظة الثمن وخاصة. لفحص العلاجات المختلفة ل Huanglongbing ، هناك حاجة إلى طريقة بسيطة ومنخفضة التكلفة لتوصيل هذه المركبات إلى الأنسجة الوعائية لأشجار الحمضيات الصغيرة المزروعة في البيوت الزجاجية المصابة ببكتيريا Candidatus Liberibacter asiaticus (CLas) المحدودة اللحاء أو المصابة بناقل الحشرات CLas الذي يتغذى على اللحاء Diaphorina citri Kuwayama (D. citri).

لتلبية متطلبات الفحص هذه ، تم تصميم جهاز التسريب المباشر للنبات (DPI) الذي يتصل بجذع المصنع. الجهاز مصنوع باستخدام نظام طباعة 3D قائم على النايلون ومكونات مساعدة يمكن الحصول عليها بسهولة. تم اختبار فعالية امتصاص المركب لهذا الجهاز في نباتات الحمضيات باستخدام علامة الفلورسنت 5،6-كربوكسي فلوريسئين-دياسيتات. لوحظ بشكل روتيني توزيع مركب موحد للعلامة في جميع أنحاء النباتات.

علاوة على ذلك ، تم استخدام هذا الجهاز لتوصيل جزيئات مضادة للميكروبات ومبيدات الحشرات لتحديد آثارها على CLas و D. citri على التوالي. تم تسليم الستربتومايسين المضاد الحيوي أمينوغليكوزيد إلى نباتات الحمضيات المصابة ب CLas باستخدام الجهاز ، مما أدى إلى انخفاض عيار CLas من 2 أسابيع إلى 4 أسابيع بعد العلاج. أدى توصيل مبيد الحشرات النيونيكوتينويد إيميداكلوبريد إلى نباتات الحمضيات الموبوءة ب D. citri إلى زيادة كبيرة في وفيات سيلليد بعد 7 أيام. تشير هذه النتائج إلى أن جهاز DPI هذا يمثل نظاما مفيدا لتوصيل الجزيئات إلى النباتات لاختبارها وتسهيل أغراض البحث والفحص.

Introduction

غالبا ما تتطلب إدارة النباتات في البيئات التجارية والمناظر الطبيعية استخدام المركبات الكيميائية لتحسين نمو النبات وصحته. تعتمد كيفية توصيل هذه الجزيئات على نوع الجزيء ووظيفة الجزيء ونوع النبات ونظام الإدارة المعمول به. التطبيقات الورقية والتربة هي أسهل استراتيجيات التسليم ، لكن القيود في امتصاص بعض الجزيئات تتطلب التسليم المباشر. مثال على هذه الجزيئات هو الجزيئات العلاجية التي تعمل بشكل أفضل عندما تتحرك بشكل منتظم داخل النبات ولكن لا يمكن توصيلها بشكل فعال عن طريق التطبيقات الموضعية البسيطة¹. هذا هو الحال مع Huanglongbing (HLB) ، وتسمى أيضا مرض تخضير الحمضيات. HLB هو مرض مرتبط ببكتيريا محدودة اللحاء ، Candidatus Liberibacter asiaticus (CLas) ، والتي لا يمكن زراعتها خارج النبات ، أو ناقل الحشرات ، Diaphorina citri Kuwayama (D. citri) ².

إذا كانت الجزيئات العلاجية المفترضة عبارة عن منتجات جينية ، فيمكن اختبارها عن طريق إنشاء نباتات محورة وراثيا تعبر عن هذه المركبات. ومع ذلك ، يمكن أن يكون إنتاج النباتات المعدلة وراثيا كثيف الوقت والموارد ، ويعتمد بشكل كبير على النمط الجيني ، ويمكن تثبيطه عن طريق إسكات الجينات³. بالإضافة إلى ذلك ، حتى لو أظهرت هذه الجينات المحورة نتائج واعدة ، فإن قيود الإدراك التنظيمي والعام تقلل من احتمال قبولها التجاري ^4,5. ومع ذلك ، فإن التطبيق الخارجي للمركبات يبسط اختبار الجزيئات البيولوجية والاصطناعية لأنه لا يتطلب إنتاج نباتات محورة وراثيا مستقرة أو عابرة ، مما يقلل من الوقت والموارد لاختبار تأثيرات الجزيء. يمكن استخدام طريقة لتوصيل النباتات النظامية الفعالة والكفؤة للمركبات الخارجية لمجموعة واسعة من أغراض البحث والفرز.

أحد هذه التطبيقات هو تحليل حركة الجزيئات الجهازية داخل نظام الأوعية الدموية للنبات ، والذي يمكن إجراؤه باستخدام علامات قابلة للتتبع ، سواء كانت نظائر كيميائية فلورية أو مرئية أو فريدة من نوعها⁶،^7،8،9. إحدى علامات الفلورسنت شائعة الاستخدام هي 5,6-carboxyfluorescein-diacetate (CFDA) ، وهي صبغة منفذة للغشاء تتحلل بواسطة الإسترات داخل الخلايا إلى 5,6-carboxyfluorescein (CF) ، وبالتالي تصبح فلورية وغير منفذة^{للغشاء 10}. تم استخدام CFDA على نطاق واسع لمراقبة انتقال اللحاء ، وعلاقات الحوض والمصدر ، وأنماط الأوعية الدموية في الأنسجة النباتية^11،12.

بالإضافة إلى هذه العلامات ، قد تغير بعض المركبات بشكل مباشر فسيولوجيا النبات لزيادة الإنتاجية أو قتل النبات في حالة مبيدات الأعشاب. كل من المبيدات الحشرية والمركبات المضادة للميكروبات هي وسيلة لزيادة إنتاجية النبات ، وخاصة في وجود HLB. مثال على جزيء مضاد للميكروبات يستخدم للتحكم في CLas هو الستربتومايسين. الستربتومايسين هو مضاد حيوي أمينوغليكوزيد تم عزله في الأصل من Streptomyces griseus وقد ثبت أنه يمنع نمو البكتيريا من خلال تثبيط التخليق الحيوي للبروتين¹³. من حيث المبيدات الحشرية ، فإن الهدف الرئيسي لأبحاث HLB هو D. citri ، الذي ينقل CLas من شجرة إلى^{شجرة 14}. لهذا الغرض ، يشيع استخدام مبيدات النيونيكوتينويد ، مثل إيميداكلوبريد ، لأنها المعيار الذهبي لمكافحة الآفات الحشرية¹⁵. كل هذه الاستخدامات المتنوعة هي جوانب مهمة لاستراتيجيات إدارة المصنع الحالية ، ويعتمد تطوير منتجات جديدة على فحوصات الفحص الفعالة.

إحدى الطرق المستخدمة لإدخال المركبات في النباتات الخشبية هي الحقن المباشر في الجذع. تم تصميم مجموعة متنوعة من الأنظمة التي تختلف في احتياجاتها لمواقع الحقن مسبقة الحفر ، وتستخدم هذه الأنظمة إما الحقن القائم على الضغط أو التدفق السلبي¹⁶. على الرغم من أن الأنظمة القائمة على الضغط تسمح بالإدخال السريع لمركب معين ، إلا أنه يجب النظر في الضرر المادي المحتمل الناجم عن إجبار السائل من خلال الأوعية الدموية المسدودة أو الانصمام¹⁷. على الرغم من أن التطبيق الورقي أو الغمر للمركبات أقل استهلاكا للوقت في التنفيذ ، إلا أن الحقن المباشر للنبات يقلل من هدر المركب محل الاهتمام بسبب الخسائر في الهواء أو التربة ويمكن أيضا إطالة الوقت الذي تكون فيه المركبات في حالة نشطة عن طريق تقليل التعرض للبيئة الخارجية¹⁸. كلا هذين الجانبين مهمان للحفاظ على الكواشف باهظة الثمن وضمان الاتساق بين النسخ المتماثلة في إعدادات البحث.

تصف هذه الدراسة تصميم وبناء واستخدام جهاز مبتكر للتسريب المباشر للنبات (DPI) ، والذي يمكن استخدامه لتقييم كيفية تأثير المركبات ذات الأهمية على النبات المضيف. تم استخدام طابعة 3D قياسية لتصنيع كل من الجهاز نفسه والعديد من المكونات المرتبطة ببنائه. تسمح طريقة البناء الداخلية هذه للباحثين بتعديل الجهاز ومكونات الجهاز بناء على احتياجاتهم التجريبية المحددة وتقلل من الاعتماد على أجهزة حقن النباتات المتاحة تجاريا. إعداد الجهاز بسيط وفعال ، وجميع المكونات الإضافية متاحة بسهولة وغير مكلفة. على الرغم من أن النظام مصمم للاستخدام مع مجموعة متنوعة من الأنواع النباتية ، إلا أن الأمثلة المقدمة هنا تتعلق بنباتات الحمضيات المحفوظة بوعاء. بالإضافة إلى ذلك ، توضح هذه الدراسة أن هذا الجهاز قادر على توصيل أنواع متعددة من المركبات بكفاءة بشكل منهجي إلى نباتات الحمضيات الصغيرة دون التسبب في الفتك. وشملت المركبات التي تم اختبارها CFDA ، الذي تم استخدامه لتقييم توزيع المركبات في النبات ، والستربتومايسين والإيميداكلوبريد ، والتي تم استخدامها للتحقق من أن التأثيرات المضادة للميكروبات والمبيدات الحشرية لهذه المركبات قد لوحظت عند تسليمها عبر DPI.

Protocol

1. إنتاج نباتات الحمضيات للحقن المركب التجريبي

1. انشر أشجار الحمضيات الصغيرة المحفوظة بوعاء إما من قصاصات نباتية أو بذور متجذرة. قم بزراعة خطوط الحمضيات المحفوظة بوعاء تحت 16 ساعة / 8 ساعات بطول يوم فاتح / مظلم وعند 28 درجة مئوية.
2. حدد نباتات الحمضيات ذات الحجم المناسب للتجربة. تطلبت التطبيقات الموصوفة أن يتراوح ارتفاع النباتات بين 12 سم و 100 سم مع أقطار جذع 4-14 مم. إذا كانت هناك حاجة إلى نمو تدفق جديد ، فقم بقص النباتات قبل التجربة.

2. طباعة ثلاثية الأبعاد لجهاز DPI ومكونات القالب

1. ضع طبقة رقيقة من الغراء القائم على أسيتات البولي فينيل على سرير الطباعة.
2. قم بتحميل خيوط النايلون في طابعة 3D ، وقم بإعداد الطابعة وفقا لتعليمات الشركة المصنعة. استيراد المطلوب. STL (الملف التكميلي 1، الملف التكميلي 2، الملف التكميلي 3، الملف التكميلي 4، الملف التكميلي 5، الملف التكميلي 6، الملف التكميلي 7، الملف التكميلي 8، الملف التكميلي 9، الملف التكميلي 10، الملف التكميلي 11، الملف التكميلي 12، الملف التكميلي 13، الملف التكميلي 14)، قم بإعداد وبدء الطباعة.
3. أخرج القطعة من فراش الطباعة. اشطف الغراء القائم على أسيتات البولي فينيل من قاعدة المكون المطبوع بالماء ، وقم بإزالة أي هياكل دعم.
4. رش مكون DPI بطبقتين من طلاء الرش اللامع الشفاف.

3. تصنيع قالب حلقة البلاستيسول

1. قم بتجميع شكل قالب كبير بما يكفي لحمل قطع النقش عن طريق بناء حاوية مستطيلة باستخدام كتل بلاستيكية مدمجة على قاعدة (الشكل التكميلي S1A).
2. امزج مونومر السيليكون RTV والمحفز معا بنسبة 10: 1 ، وحركه دون إدخال فقاعات لمدة دقيقة واحدة. التلوين بإضافة تلوين الطعام (3 قطرات / 25 مل من خليط السيليكون) وصابون اليد (1 مل من الصابون / 25 مل من خليط السيليكون) (الشكل التكميلي S1B).
3. صب طبقة رقيقة من السيليكون في شكل قالب يكفي لتغطية الجزء السفلي بالكامل. قم بسدادة السطح لتسطيح السطح ، وانتظر 24 ساعة حتى يتم ضبط السيليكون (الشكل التكميلي S1C).
4. صب طبقة ثانية من السيليكون ، كما هو موضح أعلاه ، تكون عميقة بما يكفي لتغطية الطباعة الأساسية للفتحة المركزية على النموذج (مرئية في الجزء العلوي من النموذج في الشكل التكميلي S1D). أدخل النمط في السيليكون السائل بحيث تكون الطباعة الأساسية للفتحة المركزية متجهة لأسفل. تأكد من عدم وجود فقاعات محاصرة وأن الأنماط منفصلة جيدا ولا تلامس (الشكل التكميلي S1E).
5. قم بتأمين الأنماط إما بجسم ثقيل و / أو شريط لمنعها من الخروج من السيليكون أثناء تثبيته. انتظر 24 ساعة حتى يتم ضبط الطبقة المصبوبة حديثا (الشكل التكميلي S1F).
6. صب طبقات إضافية من السيليكون حتى يتدفق المستوى مع الجزء العلوي من النمط. انتظر 24 ساعة للعلاج (الشكل التكميلي S1G).
7. قم بتفكيك الكتل البلاستيكية المجمعة معا لتحرير القالب. إزالة الأنماط (الشكل التكميلي S1H). افحص العفن بحثا عن التمزقات أو التشوهات (الشكل التكميلي S1I).

4. صب حلقات البلاستيسول

1. قم بتغطية الجزء الداخلي من القالب وجميع المكونات الأساسية والحلقات O بزيت الطهي (الشكل التكميلي S2A ، B). ضع حلقة O حول الشق في منتصف قلب العمود المركزي ، وضع القلب في الفتحة المركزية لقالب حلقة البلاستيسول (الشكل التكميلي S2C).
2. أدخل قلب قناة التوصيل في الفتحة الموجودة على جانب قالب حلقة البلاستيسول. قم بتوجيه الطرف على شكل حرف V في نهاية قلب قناة التسليم ليتماشى مع الحلقة O الموجودة في قلب العمود المركزي (الشكل التكميلي S2D ، E).
3. قم بتسخين البلاستيسول في الميكروويف لمدة 10 ثوان قصيرة (الشكل التكميلي S2F ، G). حرك البلاستيسول برفق لتجنب الفقاعات (الشكل التكميلي S2H). كرر التسخين والتحريك حتى يصل المحلول إلى درجة حرارة تتراوح بين 160 درجة مئوية و 170 درجة مئوية (الشكل التكميلي S2I).
   تنبيه: ارتفاع درجة حرارة البلاستيسول يمكن أن يؤدي إلى إطلاق أبخرة سامة. نفذ الإجراء في منطقة جيدة التهوية أو غطاء دخان. لا تسخن البلاستيسول فوق 170 درجة مئوية.
4. صب البلاستيسول المنصهر في قالب حلقة البلاستيسول بالقرب من الحافة الخارجية للقالب دون إدخال فقاعات (الشكل التكميلي S2J). انتظر 1 ساعة حتى تبرد حلقات البلاستيسول (الشكل التكميلي S2K). إزالة الحلقات من القالب. تأكد من الملاءمة المناسبة لجهاز DPI قبل الاستخدام في المقايسات التجريبية (الشكل التكميلي S2L).

5. إرفاق جهاز DPI بالمصنع

1. ابحث عن موقع سلس وصحي على صندوق السيارة لمرفق الجهاز. تجنب أي نتوءات أو عقدة ، لأنها يمكن أن تسهم في تسرب الجهاز.
2. استخدم مثقاب بقطر 2 مم لحفر ثقب أفقيا عبر مركز الجذع بزاوية 90 درجة مع سطح الجذع (الشكل التكميلي S3A). قم بتشغيل مثقاب الحفر من خلال الفتحة عدة مرات لتنظيفه وتنعيمه لإنشاء ثقب دون عائق (الشكل التكميلي S3B).
3. قم بإنشاء شريحة عمودية في حلقة البلاستيسول على الجانب الآخر من قناة توصيل المركب (الشكل التكميلي S3C). قم بتركيب الحلقة حول المصنع ، وقم بتبطين قناة التسليم مع الفتحة المحفورة مسبقا (الشكل التكميلي S3D).
   ملاحظة: يجب أن تتلاءم الحلقة بشكل مريح حول الجذع لتجنب التسرب ؛ يمكن استخدام التجميعات الأساسية بأقطار مختلفة لصنع حلقات البلاستيسول لسيقان النباتات ذات الأحجام المختلفة.
4. أضف جهاز DPI إلى حلقة البلاستيسول ، وتأكد من ملاءمتها معا بشكل مريح. قم بمحاذاة صنبور جهاز DPI مع قناة توصيل حلقة البلاستيسول والفتحة المحفورة (الشكل التكميلي S3E).
   ملاحظة: يمكن أن يكون استخدام مثقاب لمحاذاة الفتحة وفوهة جهاز DPI مفيدا.
5. لف بإحكام بشريط سيليكون لتثبيت الجهاز في مكانه (الشكل التكميلي S3F). افحص الجهاز المجمع والمرفق بالكامل لضمان المحاذاة والتوجيه المناسبين للمصنع.

6. تطبيق مركب الفائدة باستخدام جهاز DPI

1. استخدم حقنة أو ماصة لملء جهاز DPI بمحلول الاهتمام (الشكل التكميلي S3G). استخدم حقنة لاختراق شريط السيليكون وحلقة البلاستيسول على الجانب الآخر من جهاز DPI لسحب الهواء من القناة الداخلية وتجنب إدخال فقاعات الهواء في الأوعية الدموية للنبات (الشكل التكميلي S3H). استبدل أي مركب مستخرج مرة أخرى في جهاز DPI.
2. أضف رقعة صغيرة إضافية من شريط السيليكون فوق الفتحة التي أنشأتها المحقنة لتقوية المنطقة ومنع التمزق. افحص الجهاز بحثا عن تسربات مرئية عند نقطة التعلق ، وافحص خزان الجهاز بحثا عن مستوى سائل ثابت.
   ملاحظة: يمكن استخدام الماء في البداية لاختبار التسريبات لتجنب إهدار محلول الاختبار.
3. قم بتغطية الطرف المفتوح لجهاز DPI بغشاء مانع للتسرب بالشمع ، واسحبه لأسفل لتشكيل ختم وتقليل تبخر المركب التجريبي. قم بعمل ثقب واحد في فيلم الشمع بطرف حقنة لمنع تطور الفراغ ، ثم أعد ملء الجهاز (الشكل التكميلي S3I).
4. افحص الجهاز يوميا للتأكد من المحاذاة الصحيحة للمكونات (الشكل التكميلي S3J) ، وقم بتعبئة السائل باستخدام حقنة لتجنب جفاف الخزان. كرر هذه العملية حتى يتم تقديم الكمية المطلوبة من الحل التجريبي.
   ملاحظة: يمكن إدخال المركبات بنجاح من جهاز معين لمدة تصل إلى 1 شهر. يجب اختبار فترات امتصاص الحل التي تتجاوز هذا الإطار الزمني تجريبيا قبل الإعداد التجريبي.

7. استخدام CFDA لمراقبة حركة الأوعية الدموية مع نباتات الحمضيات

1. قم بتوصيل جهاز DPI بنباتات السترون (Citrus medica L.) التي يبلغ طولها 25 سم ، وقم بتطبيق علاج واحد سعة 2.0 مل إما بنسبة 20٪ DMSO في عنصر التحكم H₂O أو CFDA بجهاز DPI ، واتركه يمتص لمدة 24 ساعة. لاتباع هذا البروتوكول ، قم بإعداد حل CFDA العامل عن طريق إضافة 1.6 مل من H 2 O إلى 400 ميكرولتر من محلول مخزون CFDA (يحتوي محلول المخزون على 10 mM CFDA مذاب في 100٪ ثنائي ميثيل سلفوكسيد [DMSO]) لتوليد تركيز CFDA نهائي يبلغ₂mM و 20٪ DMSO.
2. اصنع مقاطع عرضية لأنسجة مختلفة من النبات ، واستخدم مجهرا مجسما أو مجهرا مركبا مع مرشح فلورسنت يتضمن الطول الموجي 498 نانومتر لتصور CFDA في الأنسجة النباتية. قارن الصور ب 20٪ DMSO في عناصر التحكم H₂O لحساب التألق الذاتي في الأنسجة.

8. قياس التغيرات في عيار CLas في عينات الأوراق بعد العلاج بالستربتومايسين

1. باستخدام نباتات فالنسيا (Citrus sinensis (L.) Osbeck "Valencia") التي يبلغ ارتفاعها 0.75 مترا ، اجمع سويقات ووسط ورقتين من أعراض HLB من كل نبات ، وقم بتقطيعهما إلى أقسام صغيرة ، وتجميع كل نوع من الأنسجة ، وتخزينها بشكل منفصل في أنابيب عينة مقاومة للصدمات سعة 2 مل تحتوي على كرة فولاذية بقطر 6.35 مم.
2. اطحن العينة باستخدام خالط مبرمج لدورتين مدة كل منهما 15 ثانية بسرعة 3.4 m/s. استخراج إجمالي الحمض النووي كما هو موضح سابقا¹⁹.
3. إجراء qPCR على عينات الأوراق المصابة ب CLas باستخدام مزيج qPCR المحدد في الجدول 1 وظروف التفاعل المحددة في الجدول 2. استخدم النباتات التي تظهر عدوى CLas قوية (يتم تعريف العدوى القوية عموما على أنها قيم Ct المستندة إلى qPCR < 30 لمجموعة CLas 16S LasLong (LL) التمهيدية) لمزيد من التحليل.
   ملاحظة: يتم تقدير العيار البكتيري باستخدام CLas 16S Las Long (LL) وبادئات الحمض النووي لديهيدرين الحمضيات لتقدير مكافئات الجينوم النسبية ، كما هو موضح سابقا²⁰.
4. قم بتجهيز نباتات الحمضيات التي تلبي الحد الأدنى من عيار العدوى الموضح أعلاه بأجهزة DPI ، وأخضعها لعلاج لمرة واحدة بمقدار 2.0 مل من محلول H₂O أو محلول الستربتومايسين بالتركيز المطلوب. لمتابعة هذه الدراسة ، استخدم علاجا واحدا سعة 2.0 مل من 9.5 مجم / مل (19 مجم في المجموع) من الستربتومايسين المذاب في H₂O.
5. اجمع عينات الأوراق في 7 أيام و 14 يوما و 28 يوما بعد المعالجة. فحص أوراق العينة لعيار CLas باستخدام نفس البروتوكول كما هو موضح أعلاه.
6. في 60 يوما بعد العلاج ، احصل على صور للنباتات المعالجة ب H₂O أو الستربتومايسين. استخدم الملاحظات المرئية لعدوى CLas لتسجيل شدة العدوى. ابحث عن <50٪ من الأوراق التي تظهر داء الاخضرار بين الأوردة والفلين الوريدي جنبا إلى جنب مع نمو تدفق الأوراق كعلامات على عدوى خفيفة وأكثر من 50٪ من الأوراق المصابة بالكلور بين الأوردة والفلين الوريدي بالإضافة إلى انقطاعات الأوراق وتقزم نمو النبات كعلامات على عدوى أكثر حدة.

9. قياس معدل وفيات D. citri بعد العلاج بالإيميداكلوبريد

1. تقليم نباتات السترون بطول 0.5 متر (Citrus medica L.) على ارتفاع 12 سم لتشجيع نمو تدفق جديد.
   ملاحظة: يمكن أن تعتمد سرعة نمو التدفق على صحة النبات والوقت من السنة ؛ لذلك ، ضع ذلك في الاعتبار أثناء التصميم التجريبي.
2. بعد >6 تدفق ، طوله 1-2 سم ، وضعت ، أدخل النباتات في أقفاص تحتوي على D. citri البالغ.اترك النباتات في الأقفاص لمدة 24 ساعة للسماح بترسب البيض.
3. قم بإجراء عدد البيض التمثيلي على ثلاث براعم دافقة بعد 1-2 أيام من وضعها ، ثم قم بتطبيق أجهزة DPI. املأ هذه الأجهزة ب 2.0 مل من التحكم في الماء أو التركيز المطلوب من إيميداكلوبريد (21.8٪ مكون نشط). لاتباع هذا البروتوكول ، استخدم 528 ميكرولتر / لتر و 52.8 ميكرولتر / لتر و 5.28 ميكرولتر / لتر من إيميداكلوبريد.
   ملاحظة: يعد تعداد البيض مقياسا مدمرا ، لذلك يتم استخدام العد في هذه المرحلة لتقدير عدد البيض على التدفق غير المحسوب لنفس النبات والمساعدة في توفير خط أساس لأعداد ظهور الحوريات اللاحقة التي يتم إجراؤها في نهاية التجربة.
4. اجمع معدل ظهور D. citri على ثلاثة على الأقل من براعم التدفق المتبقية. الحصول على صور تمثيلية للنبات بعد 7 أيام من إدخال المركب.

النتائج

مكونات جهاز التسريب المباشر
يبلغ طول النسخة الأساسية لجهاز التسريب المباشر 8 سم وعرضها 3.3 سم في الأمام والجانب (الشكل 1 أ). يحتوي على خزان مركزي واحد مجاور للصنبور ، والحجم الإجمالي الذي يمكن احتواؤه داخل هذه المكونات هو 2.0 مل (الشكل 1 د). يبلغ طول حلقة البلاستيسول 1.8 سم وقطرها 2.7 سم (الشكل 1 ج). تحتوي هذه الحلقة أيضا على قناتين: واحدة لاستيعاب صنبور جهاز DPI والأخرى ذات قطر متغير يتناسب مع جذع الشجرة التي تتم معالجتها. بالإضافة إلى ذلك ، يوجد أخدود حول القناة الرأسية لتوجيه المعالجة الزائدة لإحاطة الشجرة ، مما يسمح بامتصاص مركب إضافي من خلال اللحاء (الشكل 1F). عند تجميعها بشكل صحيح ، يجب أن تكون حلقة البلاستيسول متدفقة على جهاز DPI ، ويجب أن يصطف الفوهة مع الفتحة المحفورة في الشجرة (الشكل 1B والشكل 1E).

سي اف دا
للتحقق من فعالية جهاز DPI لإدخال مواد كيميائية خارجية في نباتات الحمضيات ، تم اختراق 2.0 مل من 2 mM CFDA باستخدام الجهاز. تم الكشف عن إشارة مضان في الأوعية الدموية للنبات المعالج (الشكل 2 أ) ولكنها كانت غائبة في محطات التحكم المعالجة بنسبة 20٪ DMSO في H₂O (الشكل 2B). لوحظت هذه الإشارة في جميع أنواع الأنسجة النباتية التي تم تشريحها ، بما في ذلك ميزوفيل الأوراق ، والأوعية الدموية للسويقات ، والأوعية الدموية الجذعية ، والأوعية الدموية الجذرية (الشكل 2C). لوحظت هذه الإشارة في النبات خلال 24 ساعة من العلاج وتم توزيعها بالتساوي نسبيا في جميع أنحاء الأنسجة.

الستربتومايسين
لاختبار ما إذا كانت المركبات المدخلة لها تأثير علاجي على مرض HLB ، تم إدخال 2.0 مل من مركب مبيد للجراثيم ، الستربتومايسين ، في نباتات البرتقال الحلو إيجابية CLas Valencia (Citrus sinensis) بتركيز 9.5 مجم / مل (19 مجم في المجموع). تم الحفاظ على هذه النباتات في أواني الدفيئة ، وتم مراقبة عيار CLas (المقاس بمكافئات جينوم CLas لكل مكافئات جينوم الحمضيات) بمرور الوقت باستخدام qPCR (الشكل 3 أ). كان المتوسط الأولي لعيار DNA CLas للنباتات المعالجة بالستربتومايسين و H₂O 0.562 CLas جينوم / جينوم الحمضيات و 0.49 CLas جينوم / جينوم الحمضيات ، على التوالي. تم الكشف عن الانخفاضات في متوسط العيار البكتيري بواسطة qPCR بعد 7-28 يوما من العلاج بالستربتومايسين مقارنة بضوابط H₂O في نفس النقطة الزمنية. بالإضافة إلى ذلك ، كان الفرق بين الوقت 0 واليوم 28 متوسط التتر البكتيري 0.314 و 0.117 للنباتات المعالجة بالستربتومايسين والنباتات المعالجة H₂O ، على التوالي.

صممت هذه التجربة لقياس استجابة النبات للمعالجات المختلفة خلال فترات زمنية مختلفة. تم استخدام تصميم سطح استجابة تربيعية ثنائية ، مع معالجة الوقت كعامل منفصل كمي بأربعة مستويات (0 أيام و 7 أيام و 14 يوما و 28 يوما) والمعاملة كعامل فئوي بمستويين (H₂O والستربتومايسين). تم استخدام خمس مكررات لكل من مجموعات العلاج الثمانية ، وتم قياس عيار CLas كمتغير استجابة. تم تحويل البيانات باستخدام السجل₁₀ بناء على تحليل مخطط Box-Cox. تم إجراء تخفيض النموذج عن طريق الاختيار الأمامي باستخدام معيار معلومات Akaike (AICc) ²¹ ، مما أدى إلى إزالة كل من تأثيرات الوقت والتفاعل. كان العامل المتبقي ، المعالجة ، معنويا (p = 0.0252) ، حيث أظهرت النباتات المعالجة بالستربتومايسين متوسط عيار CLas أقل (0.349) من النباتات المعالجة H₂O (0.496) على مدار جميع النقاط الزمنية مجتمعة (الشكل 3B). يتوافق هذا الانخفاض في عيار CLas مع الزيادات العرضية في نمو التدفق الصحي الجديد بعد 60 يوما في النباتات المعالجة بالستربتومايسين ، كما يتضح من صور الأشجار التمثيلية المعالجة ب H₂O (الشكل 3C) مقابل 19 ملغ من الستربتومايسين (الشكل 3D).

إيميداكلوبريد
تم إدخال إيميداكلوبريد في نباتات السترون الموبوءة بسيلليد الحمضيات الآسيوية (ACP) باستخدام جهاز DPI لاختبار إمكاناته كفحص لفحص مبيدات الحشرات D. citri. تم اختبار معالجة واحدة 2.0 مل لمحلول مبيد حشري تجاري إيميداكلوبريد بثلاثة تركيزات مختلفة (5.28 ميكرولتر / لتر ، 52.8 ميكرولتر / لتر ، و 528 ميكرولتر / لتر) ، جنبا إلى جنب مع التحكم في الماء. تراوح متوسط إجمالي عدد البيض لكل ثلاث براعم تدفق قبل المعالجة من 280.5 إلى 321 ، ولم تكن هناك فروق ذات دلالة إحصائية بين النباتات التي سيتم استخدامها لكل مجموعة معالجة (الشكل 4 أ). كان متوسط إجمالي الحوريات الباقية على قيد الحياة في ثلاث براعم دافقة بعد 7 أيام من المعالجة 293.75 و 268 و 97.5 و 2 للتحكم في الماء و 5.28 ميكرولتر / لتر و 52.8 ميكرولتر / لتر و 528 ميكرولتر / لتر محاليل إيميداكلوبريد ، على التوالي (الشكل 4 ب). يمثل هذا انخفاضا كبيرا في ظهور حورية سيلليد عند مستويات محلول إيميداكلوبريد 52.8 ميكرولتر / لتر (p = 0.029) و 528 ميكرولتر / لتر (p = 0.002) عند مقارنتها بالتحكم في المياه وفقا ل ANOVA أحادي الاتجاه متبوعا بتحليل توكي اللاحق. بالإضافة إلى ذلك ، كانت هذه الزيادة في وفيات حوريات سيلليد عند أعلى مستوى من محلول إيميداكلوبريد واضحة بصريا من خلال انخفاض إنتاج الحورية على الخطوط المعالجة بالإيميداكلوبريد (الشكل 4 د) عند مقارنتها بالتحكم في المياه (الشكل 4 ج).

الشكل 1: جهاز التسريب المباشر للنبات وحلقة البلاستيسول. أ: جهاز التسريب المباشر السليم للنبات، و(ج) حلقة البلاستيسول مع أبعادها. (ب) جهاز التسريب المباشر للنبات وحلقة البلاستيسول متصلان ومتصلان بشجرة حمضيات. المقاطع العرضية الرأسية لجهاز التسريب المباشر للنبات (د) ، (F) حلقة البلاستيسول ، (ه) هذان المكونان متصلان ومتصلان بشجرة حمضيات. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل 2: المقطع العرضي للورقة الوسطى لنبات حمضيات طوله 25 سم. صور تظهر 24 ساعة بعد العلاج ب (A) 2 mM CFDA أو (B) 20٪ DMSO في H₂O باستخدام جهاز التسريب المباشر للنبات. (ج) المقاطع العرضية للأنسجة النباتية المختلفة بعد 24 ساعة من معالجة 2 mM CFDA ، بما في ذلك الجذع 5 سم فوق جهاز التسريب المباشر للنبات (أعلى اليسار) ، والجذع 5 سم أسفل جهاز التسريب المباشر للنبات (وسط اليسار) ، والجذر (أسفل اليسار) ، ووسط الورقة (أعلى اليمين) ، وسويقات الأوراق (وسط اليمين) ، وميزوفيل الأوراق (أسفل اليمين). قضبان المقياس = 1 مم. الاختصارات: CFDA = 5،6-كربوكسي فلوريسئين-ثنائي الأسيتات. DMSO = ثنائي ميثيل سلفوكسيد. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل 3: مراقبة عيار CLas (يقاس بمكافئات جينوم CLas لكل مكافئات جينوم الحمضيات) بمرور الوقت باستخدام qPCR. (أ) دورة زمنية توضح التغيرات في عيار الحمض النووي CLas بمقارنة النباتات الخمسة المعالجة ب 19 مجم من الستربتومايسين مع النباتات الخمسة المعالجة بعنصر تحكم H₂O. تمثل النقاط متوسط علاج معين في نقطة زمنية معينة. تمثل أشرطة الخطأ الخطأ القياسي للمتوسط. (ب) رسم بياني بالأعمدة يوضح متوسط عيار CLas للنباتات المعالجة H₂O والستربتومايسين عبر جميع النقاط الزمنية. تمثل أشرطة الخطأ فترة الثقة 95٪ ، وتشير العلامات النجمية إلى اختلافات كبيرة (* = p < 0.05) بين متوسط عيار CLas للنباتات المعالجة بالستربتومايسين و H₂O وفقا ل ANOVA. (ج) صور تمثيلية لنباتات الحمضيات بعد 0 شهر وشهرين من المعالجة المباشرة بالتسريب المباشر للنبات إما ب (C) H₂O أو (D) الستربتومايسين. تظهر النباتات المعالجة بالستربتومايسين نموا جديدا لتدفق الأوراق الخضراء الفاتحة بعد 2 أشهر ، مما يشير إلى انخفاض في عيار CLas. اختصار: CLas = المبيضات الليبيرية الآسيوية. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل 4: رصد وفيات حوريات سيلليد في نباتات السترون اليافعة الموبوءة ب ACP. رسوم بيانية شريطية توضح (أ) عدد البيض الأولي المقدر و (ب) حوريات D. citri الباقية على قيد الحياة على ثلاثة تدفق للحمضيات بعد 7 أيام من المعالجة باستخدام التحكم في الماء والتخفيفات المختلفة للإيميداكلوبريد. تمثل أشرطة الخطأ الخطأ القياسي للمتوسط ، وتشير العلامات النجمية إلى اختلافات كبيرة (* = p < 0.05 ، ** = p < 0.01) بين مستوى معالجة معين والتحكم في المياه وفقا ل ANOVA أحادي الاتجاه متبوعا بتحليل Tukey اللاحق. صور تدفق الحمضيات الموبوءة بحوريات D. citri بعد 7 أيام من المعالجة إما باستخدام (C) التحكم في الماء أو (D) 528 ميكرولتر / لتر إيميداكلوبريد باستخدام جهاز التسريب المباشر للنبات. الاختصارات: ACP = سيلليد الحمضيات الآسيوية. D. citri = ديافورينا سيتري كواياما. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الحجم لكل عينة (ميكرولتر)	مكون
12.5	2x GoTaq qPCR مع BRYT Green Dye Master Mix
5	قالب الحمض النووي (20 نانوغرام / ميكرولتر)
0.5	10 ميكرومتر التمهيدي F و R ل CLas		كلاس: CTTACCAGCCCTTGACATGTATAGG (إلى الأمام); TCCCTATAAAGTACCCAACATCTAGGTAAA (عكس)
0.5	10 ميكرومتر التمهيدي F و R للتدبير المنزلي للحمضيات		الحمضيات ديهيدرين: TGAGTACGAGCCGAGTTG (إلى الأمام) ؛ AAAACTTCACCGATCCACCAG (عكس)
6.5	H2O

الجدول 1: مزيج qPCR المستخدم لتحديد عيار CLas في خطوط الحمضيات المعالجة بالستربتومايسين. يظهر تسلسل البادئات 16S Las Long وبادئات الحمضيات ديهيدرين لقياس كمية الحمض النووي CLas وقياس الحمض النووي للحمضيات.

درج		درجة الحرارة (°C)	الوقت
1	التشوه الأولي	95	2 دقيقة
2	تشويه	95	15 ثانية
3	الصلب	60	20 ثانية
4	امتداد	72	20 ثانية
5	انتقل إلى الخطوة 2 ، كرر 39x
6	منحنى الذوبان	60 منحدرا إلى 95 عند 0.2 درجة مئوية / ثانية	3 دقائق

الجدول 2: ظروف التفاعل ل qPCR المستخدمة لتحديد عيار CLas في خطوط الحمضيات المعالجة بالستربتومايسين.

الشكل التكميلي S1: صور توضح عملية تجميع القالب لتوليد حلقة البلاستيسول. (أ) تم استخدام كتل بلاستيكية مدمجة معا لتوليد الطبقة الأولى من قالب حلقة البلاستيسول. (ب) محلول مختلط بشكل موحد يحتوي على مطاط السيليكون RTV والمحفز وملون الطعام والصابون. (ج) صب الطبقة الأولى بالتساوي من قالب حلقة البلاستيسول. (د) صورة لأنماط حلقات البلاستيسول مع وجود الطباعة الأساسية في المنتصف في الأعلى. (ه) أنماط حلقات البلاستيسول التي يتم إدخالها في الطبقة الثانية غير المعالجة من القالب. (و) شريط لاصق ومطرقة مطاطية تستخدم لتأمين الأنماط مع علاج الطبقة الثانية. (ز) تضاف الطبقة الثالثة من القالب حتى تتدفق مع الجزء العلوي من الأنماط. (ح) إزالة الأنماط من القالب. (I) قالب حلقة بلاستيسول مبني بالكامل. الرجاء الضغط هنا لتنزيل هذا الملف.

الشكل التكميلي S2: صور توضح عملية تجميع حلقة البلاستيسول المرتبطة بجهاز التسريب المباشر للنبات . (أ) مكونات تجميع حلقة البلاستيسول ، بما في ذلك القالب ، والنواة المركزية مع الحلقة O ، وقلب قناة التسليم. (ب) طلاء النوى بزيت طهي غير لاصق لتسهيل إزالة حلقة البلاستيسول بعد التصلب. (ج) إدخال قلب المركز والحلقة O في القالب. (د) إدخال قلب قناة التوصيل بشكل عمودي على قلب المركز. (ه) التجميع السليم للمكونات الأساسية لحلقة البلاستيسول في تجويف القالب. (و) البلاستيسول المستخدم لتوليد حلقة البلاستيسول. (ز) تسخين البلاستيسول في الميكروويف. H: تقليب البلاستيسول بعد التسخين. ط: فحص درجة حرارة البلاستيسول. ي: صب البلاستيسول المسخن في اللب المجمع. (ك) السماح بتبريد البلاستيسول حول اللب المجمع. (L) حلقات البلاستيسول المجمعة بالكامل متصلة بجهاز التسريب المباشر للنبات. الرجاء الضغط هنا لتنزيل هذا الملف.

الشكل التكميلي S3: صور توضح عملية تجميع جهاز التسريب المباشر للنبات. أ: حفر حفرة في مركز نبات الموالح لإنشاء قناة لتوصيل المركب. (ب) منظر أمامي للفتحة المحفورة. (ج) التقطيع من خلال حلقة البلاستيسول بشفرة حلاقة مقابل قناة التوصيل المركبة. د: تركيب حلقة البلاستيسول بإحكام حول الساق في موقع الثقب الذي سبق حفره. (ه) تركيب جهاز التسريب المباشر للنبات في حلقة البلاستيسول، مع إدخال حنفية التوصيل المركبة الموجودة على الجهاز في قناة حلقة البلاستيسول. (F) استخدام شريط سيليكون لتأمين جهاز التسريب المباشر للنبات إلى حلقة البلاستيسول وتثبيت الجهاز بأكمله في مكانه. (ز) ملء حجرة جهاز التسريب المباشر للنبات بالمركب محل الفائدة. (ح) استخدام حقنة لسحب الهواء من الفتحة المحفورة في النبات وبدء سريان المركب. (ط) وضع فيلم ختم الشمع على الفتحة في غرفة جهاز التسريب المباشر للنبات وإحداث ثقب لمنع حدوث فراغ. (ي) جهاز التسريب المباشر للنبات المجمع بالكامل على نبات الحمضيات. الرجاء الضغط هنا لتنزيل هذا الملف.

الملف التكميلي 1: مركز حلقة البلاستيسول بعد النواة. STL لشجرة 4 مم. الرجاء الضغط هنا لتنزيل هذا الملف.

الملف التكميلي 2: مركز حلقة البلاستيسول بعد النواة. STL لشجرة 6 مم. الرجاء الضغط هنا لتنزيل هذا الملف.

الملف التكميلي 3: مركز حلقة البلاستيسول بعد النواة. STL لشجرة 8 مم. الرجاء الضغط هنا لتنزيل هذا الملف.

الملف التكميلي 4: مركز حلقة البلاستيسول بعد النواة. STL لشجرة 10 مم. الرجاء الضغط هنا لتنزيل هذا الملف.

الملف التكميلي 5: مركز حلقة البلاستيسول بعد النواة. STL لشجرة 12 ملم. الرجاء الضغط هنا لتنزيل هذا الملف.

الملف التكميلي 6: مركز حلقة البلاستيسول بعد النواة. STL لشجرة 14 ملم. الرجاء الضغط هنا لتنزيل هذا الملف.

الملف التكميلي 7: قلب قناة توصيل حلقة البلاستيسول. STL لشجرة 4 مم. الرجاء الضغط هنا لتنزيل هذا الملف.

الملف التكميلي 8: قلب قناة توصيل حلقة البلاستيسول. STL لشجرة 6 مم. الرجاء الضغط هنا لتنزيل هذا الملف.

الملف التكميلي 9: قلب قناة توصيل حلقة البلاستيسول. STL لشجرة 8 مم. الرجاء الضغط هنا لتنزيل هذا الملف.

الملف التكميلي 10: قلب قناة توصيل حلقة البلاستيسول. STL لشجرة 10 مم. الرجاء الضغط هنا لتنزيل هذا الملف.

الملف التكميلي 11: قلب قناة توصيل حلقة البلاستيسول. STL لشجرة 12 ملم. الرجاء الضغط هنا لتنزيل هذا الملف.

الملف التكميلي 12: قلب قناة توصيل حلقة البلاستيسول. STL لشجرة 14 ملم. الرجاء الضغط هنا لتنزيل هذا الملف.

الملف التكميلي 13: جهاز التسريب المباشر للنبات. STL. الرجاء الضغط هنا لتنزيل هذا الملف.

الملف التكميلي 14: النمط المستخدم لإنشاء قالب لحلقة البلاستيسول. STL. الرجاء الضغط هنا لتنزيل هذا الملف.

Discussion

لكي يعتبر جهاز DPI طريقة قابلة للتطبيق لتوصيل المركبات الخارجية إلى النباتات ، يجب أن يساهم في امتصاص مركب قوي ومتسق في مجموعة متنوعة من أنواع الأنسجة. أظهرت التجربة التي استخدمت CFDA بوضوح حركة كل من المركب acropetal و basipetal ، وكذلك في كل من نظام الأوعية الدموية وخلايا mesophyll من الورقة. بالإضافة إلى ذلك ، ومن المفترض أن يكون الثقب بالملل المستخدم في جهاز DPI هذا يوفر مساحة كبيرة من السطح لامتصاص المركب ، كان CFDA موجودا بكميات متساوية نسبيا في جميع أقسام الساق ، وليس فقط في مجموعة فرعية صغيرة من الأوعية الدموية المجاورة للجهاز ، كما شوهد في دراسات امتصاص الصبغة السابقة في النباتات باستخدام حقن الجذع⁶. بالإضافة إلى ذلك ، تم اختبار توصيل البروتين الفلوري الأخضر وصبغة الأزهار باستخدام جهاز DPI ، ولوحظ توزيع لهذه المركبات مشابه ل CFDA (البيانات غير معروضة). تشير هذه البيانات إلى أنه يمكن استخدام الجهاز لتقديم مجموعة متنوعة من المركبات التي تختلف في الحجم والتركيب الجزيئي بشكل منهجي. ومع ذلك ، تجدر الإشارة إلى وجود اختلافات في امتصاص المركب بناء على مرحلة نمو الأوراق ، حيث تأخذ الأوراق النامية الأصغر سنا مركبا أكثر من الأوراق القديمة. قد يكون هذا بسبب التغيرات في خصائص الأوعية الدموية الموجودة في أنسجة الحوض مقابل المصدر ويجب تحسينها لتجربة معينة.

أظهر جهاز DPI امتصاصا كافيا للمركب لتصور CFDA و GFP وصبغة الأزهار ، كما أنه استغرق ما يكفي لإظهار التأثيرات المضادة للبكتيريا والمبيدات الحشرية للستربتومايسين والإيميداكلوبريد ، على التوالي. أدى كل من هذه المركبات إلى تغييرات في صلاحية الكائن المستهدف بعد أسبوع واحد من علاج واحد 2.0 مل. تشير هذه البيانات إلى أنه يمكن استخدام جهاز DPI في فحوصات النبات بالكامل لاختبار صلاحية مجموعة واسعة من المركبات لمكافحة الآفات الميكروبية والحشرية. علاوة على ذلك ، نظرا لاتصاله المباشر بنظام الأوعية الدموية ، قد يوفر هذا الجهاز فرصة لاختبار المركبات التي لا تمتصها الجذور أو خلايا البشرة بكفاءة. سيكون تداخل الحمض النووي الريبي (RNAi) ذا أهمية خاصة ، حيث يمكن استخدامه لتعديل التعبير الجيني داخل النبات المضيف أو مسبب المرض أو ناقل مسببات الأمراض. أظهرت الأبحاث السابقة التي أدخلت الحمض النووي الريبي دبوس الشعر من خلال ثقب محفور في جذع نباتات التفاح والعنب أن جزيئات الحمض النووي الريبي كانت مقتصرة على نسيج الخشب ، مما يشير إلى أن هذه الجزيئات قد تكون فعالة فقط ضد الكائنات الحية التي تتغذى على عصارة نسيج^{الخشب 22.} وبالنظر إلى أن جهاز DPI يستخدم نظاما مماثلا لتوصيل الثقوب المحفورة، فمن المنطقي أن الحمض النووي الريبوزي (RNA) ذو الدبوس الشعري الذي يتم توصيله باستخدام هذا الجهاز قد يقتصر أيضا على نسيج الخشب. ومع ذلك ، فإن الانخفاض الملحوظ في عيار CLas المحدود باللحاء بعد علاج الستربتومايسين من جهاز DPI يشير بقوة إلى أن هذا المضاد الحيوي كان موجودا في اللحاء. لذلك ، من المحتمل أن يعتمد التوزيع الوعائي للمركبات التي يتم تسليمها باستخدام جهاز DPI على حجمها وكيمياءها ، ويجب تقييم كل جزيء على أساس فردي.

على الرغم من وجود عدد من أجهزة DPI المتاحة تجاريا في السوق ، إلا أن الجهاز الموصوف هنا يمكن تصنيعه داخليا وقابل للتعديل. وبهذه الطريقة ، يمكن إجراء تحسينات وتغييرات في الحجم بناء على الأنواع النباتية والتصميم التجريبي المستخدم ، ولا تعتمد على المنتجات التجارية. بالإضافة إلى ذلك ، يتم توصيل الجهاز بشكل شبه دائم بالنبات ، مما يعني أنه يمكن إجراء معالجات متعددة لمركب معين في وقت واحد دون الحاجة إلى إعادة إصابة النبات بحقن مركبة متعددة. في ملاحظة تحذيرية ، يمكن أن يتسرب الجهاز إذا لم يتم تثبيته بشكل صحيح. نتيجة لذلك ، يتم فقدان المركب في البيئة بدلا من تسليمه إلى المصنع. لذلك ، يجب توخي الحذر لفحص الجهاز بحثا عن أي علامات تسرب أثناء الإعداد والأيام القليلة الأولى بعد ذلك. على الرغم من أن حفر حفرة في الشجرة قد يكون ضارا ، فقد تم اختيار هذه الطريقة لضمان امتصاص مركب قوي ومتسق. بالإضافة إلى ذلك ، لم يلاحظ أي آثار ضارة على صحة النبات من ربط جهاز DPI في هذه التجارب. ومع ذلك ، يجب تضمين نباتات إضافية في التصميم التجريبي لتحل محل تلك التي قد تفقد قوتها طوال فترة تجربة معينة. أخيرا ، نظرا لأن هذا الجهاز يستخدم التدفق السلبي لإدخال المركبات ، فقد يكون من الصعب التنبؤ بمعدل الامتصاص عبر أنواع نباتية مختلفة أو مراحل نمو نفس النوع. قد يؤدي هذا إلى تعقيد التجارب إذا كانت سرعة امتصاص المركب عاملا مقيدا. للحصول على أفضل النتائج ، يجب التخطيط للتجارب بحيث يتم توفير وقت كاف للمصنع لامتصاص 2.5 مل من المركب بالكامل ، الأمر الذي قد يستغرق ما يصل إلى أسبوع واحد. في الختام ، يعد جهاز DPI هذا أداة فعالة للتقييم السريع لنشاط المركبات المضادة للميكروبات أو المبيدات الحشرية في النبات ضد CLas وناقله ، D. citri ، وبالتالي توفير مزيد من المعلومات حول الفعالية النظامية والتأثير على أداء النبات من مقايسة الأوراق المنفصلة المقدمة سابقا²³. مما لا شك فيه أن تنوع التطبيقات لهذا النظام يتجاوز الاستخدامات المحددة الموضحة في هذه الدراسة.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.5 cm Diameter Steel Balls	Ballistic Products Inc.	#SHT #T
10 mL Luer-Lok Syringe	Becton Dickinson	382903029952
20 G 1 Syringe Needle	Becton Dickinson	305175
2 mL Screw Cap Tubes	USA Scientific	1420-9710
3/32nd Inch Black Oxide Drill Bit	Sears	964077
3D Printer	Markforged	F-PR-2027
3D Printing Software	Markforged	F-SW-FDVX
3D Printing Software	Markforged	S-FW-OEVX
5(6)-CFDA (5-(and-6)-Carboxyfluorescein Diacetate)	Invitrogen	C195
5/64th Inch Black Oxide Drill Bit	Sears	964502
96 Well qPCR Machine	Roche	5815916001
Centrifuge	Eppendorf	22621408
Fluorescent Microscope	Olympus	SP-BX43-BI
Fluorescent Microscope Filter	Chroma	69401-ET
Gloss Clear Spray Paint	Rustoleum	249117
Grey Lego Baseplate	Lego	11024
Handheld Cordless Drill	Makita	6349D
Homogenizer	Fisher Scientific	15-340-163
Imidacloprid 2F	Quali-Pro	83080133
Liquid Plastisol Medium Hardness	Fusion X Fishing Lures	XSOL-505
Red Silicone 70 Shore A O-Ring	Grainger	Varies by Size
Non-Stick Cooking Spray	PAM	64144030217
NucleoSpin Plant II	Macherey-Nagel	740770.5
Parafilm	Bemis	HS234526A
Poly Viyl Acetate Based Glue	Elmers	E301
qPCR Master Mix	Promega	A6001
qPCR Primers	Integrated DNA Technologies	Varies by DNA sequence
Reverse Transcriptase	Promega	A5003
Single Edge Razor Blade	Garvey	40475
Translucent Silicone RTV Rubber	Aero Marine Products	AM 115T
Transparent Silicone Tape	Maxwell	KE30S
Truncated Oncocin 112	Genscript	Varies by peptide sequence
White 1 x 6 Lego Piece	Lego	300901
White Nylon	Markforged	F-MF-0003