用于植物分子输送的直接输液装置

摘要

这份手稿描述了一种新型的直接植物输液装置，用于筛选分子对细菌（亚洲念珠菌 ）或其昆虫载体（柸橘假丝菌，Kuwayama）的有效性，这些细菌与黄龙冰柑橘病有关。

摘要

测试植物中治疗性化合物的功能是农业研究的重要组成部分。叶面喷洒和土壤浸泡方法是常规方法，但也有缺点，包括可变吸收和测试分子的环境分解。树木的树干注入已经很成熟，但大多数方法都需要昂贵的专有设备。为了筛选黄龙冰的各种治疗方法，需要一种简单、低成本的方法将这些化合物输送到感染韧皮部限制性细菌亚洲 念珠菌 （CLas） 或被韧皮部摄食 CLas 昆虫载体 Diaphorina citri Kuwayama （D. citri） 感染的小型温室种植柑橘树的维管组织中。

为了满足这些筛选要求，设计了一种连接到植物树干的直接植物输液（DPI）装置。该设备使用尼龙基3D打印系统和易于获得的辅助组件制成。使用荧光标记物5，6-羧基荧光素二乙酸酯在柑橘植物中测试了该装置的化合物吸收功效。常规观察到标记在整个植物中的均匀化合物分布。

此外，该装置用于递送抗菌和杀虫分子，以确定它们分别对CLas和 D. citri 的影响。使用该设备将氨基糖苷类抗生素链霉素输送到CLas感染的柑橘植物中，导致CLas滴度从处理后2周降低到4周。将新烟碱类杀虫剂吡虫啉输送到 柑橘类植物中，导致7天后木虱死亡率显着增加。这些结果表明，这种DPI装置代表了一种有用的系统，用于将分子输送到植物中进行测试，并促进研究和筛选目的。

引言

商业和景观环境中的植物管理通常需要使用化合物来优化植物生长和健康。这些分子如何传递取决于分子的类型、分子的功能、植物的类型以及现有的管理系统。叶面和土壤施用是最简单的输送策略，但某些分子吸收的局限性需要直接输送。这些分子的一个例子是治疗性分子，当它们在植物内系统性移动时功能最佳，但不能通过简单的^{局部应用有效}传递1。黄龙病（HLB）就是这种情况，也称为柑橘绿化病。HLB是一种与韧皮部限制性细菌亚洲念珠菌（CLas）相关的疾病，该细菌不能在植物或其昆虫载体Diaphorina citri Kuwayama（D. citri^）2之外培养。

如果假定的治疗分子是基因产物，则可以通过创建表达这些化合物的转基因植物来测试它们。然而，转基因植物生产可能是时间和资源密集型的，高度依赖于基因型，并且可以通过基因沉默来抑制³。此外，即使这些转基因显示出有希望的结果，监管和公众认知的限制也会降低其商业接受的可能性^4，5。然而，化合物的外源应用简化了生物和合成分子的测试，因为它不需要生产稳定或瞬时表达的转基因植物，从而减少了测试分子效果的时间和资源。一种有效和高效地系统性植物递送外源化合物的方法可用于各种研究和筛选目的。

这些应用之一是分析植物维管系统内的全身分子运动，这可以使用可追踪的标记来完成，无论它们是荧光、可见光还是独特的化学同位素⁶，⁷，^8，9。一种常用的荧光标记物是5，6-羧基荧光素-二乙酸酯（CFDA），它是一种透膜染料，被细胞内酯酶降解为5，6-羧基荧光素（CF），随后变成荧光和膜不透性¹⁰。CFDA已被广泛用于监测植物组织中的韧皮部运输，汇和源关系以及脉管系统模式^11，12。

除了这些标记物外，某些化合物可能直接改变植物的生理机能，以提高生产力或在除草剂的情况下杀死植物。杀虫剂和抗菌化合物都是提高植物生产力的一种手段，尤其是在存在HLB的情况下。用于控制CLas的抗菌分子的一个例子是链霉素。链霉素是一种氨基糖苷类抗生素，最初是从 灰链霉菌 中分离出来的，已被证明可以通过抑制蛋白质生物合成来抑制细菌生长¹³。在杀虫剂方面，HLB研究的主要目标是 柑橘杜鹃，它将CLas从一棵树传播到另一棵树¹⁴。为此，通常使用新烟碱类药物，例如吡虫啉，因为它们是控制害虫的黄金标准¹⁵。所有这些不同的用途都是当前工厂管理策略的重要方面，新产品的开发取决于有效的筛选分析。

用于将化合物引入木本植物的一种方法是直接注射到树干中。已经设计了各种系统，这些系统对预钻孔注射部位的需求各不相同，这些系统利用基于压力的喷射或被动流动¹⁶。尽管基于压力的系统允许快速引入给定化合物，但需要考虑强迫液体通过阻塞或栓塞的脉管系统造成的潜在物理损伤¹⁷。尽管叶面喷施化合物或淋水施用的时间较少，但直接植物注射可减少由于空气或土壤损失而导致的目标化合物的浪费，并且还可以通过减少暴露于外部环境来延长化合物处于活性状态的时间¹⁸。这两个方面对于保存昂贵的试剂和确保研究环境中重复之间的一致性都很重要。

本研究描述了创新的直接植物输注（DPI）装置的设计，构造和使用，该设备可用于评估感兴趣的化合物如何影响寄主植物。标准3D打印机用于制造设备本身和与其结构相关的几个组件。这种内部构建方法允许研究人员根据其特定的实验需求修改设备和设备组件，并减少对市售植物注射设备的依赖。设备设置简单高效，所有辅助组件都很容易获得且价格低廉。尽管该系统设计用于各种植物物种，但此处介绍的示例与盆栽柑橘类植物有关。此外，这项研究表明，该设备能够有效地将多种类型的化合物系统地输送到年轻的柑橘植物中，而不会造成致死。测试的化合物包括CFDA，用于评估植物中的化合物分布，以及链霉素和吡虫啉，用于验证通过DPI 输送 时观察到这些化合物的抗菌和杀虫作用。

研究方案

1. 实验性复方注射用柑橘植株的生产

1. 从有根的植物插条或种子中繁殖小型盆栽柑橘树。在16小时/ 8小时光照/黑暗日照长度和28°C下种植盆栽柑橘系。
2. 选择适当大小的柑橘类植物进行实验。所描述的应用要求植物的高度在12厘米到100厘米之间，树干直径在4-14毫米之间。如果需要新的冲洗生长，请在实验前减少植物。

2. DPI器件和模具组件的三维打印

1. 在打印床上涂上一层薄薄的聚醋酸乙烯酯胶水。
2. 将尼龙长丝装入3D打印机，并根据制造商的说明准备打印机。导入所需的 .STL 文件（补充文件 1、补充文件 2、补充文件 3、补充文件 4、补充文件 5、补充文件 6、补充文件 7、补充文件 8、补充文件 9、补充文件 10、补充文件 11、补充文件 12、补充文件 13 和补充文件 14），设置并开始打印。
3. 从打印床上取下该片。用水冲洗打印组件底部的聚醋酸乙烯酯胶水，并去除任何支撑结构。
4. 用两层透明光泽喷漆喷涂DPI组件。

3.塑溶胶环模的制作

1. 通过在底座上使用卡扣在一起的塑料块构建矩形外壳来组装足够大的模具形状以固定图案件（补充图 S1A）。
2. 以10：1的比例将RTV有机硅单体和催化剂混合在一起，搅拌1分钟而不引入气泡。通过添加食用色素（3滴/ 25 mL硅胶混合物）和洗手液（1 mL肥皂/ 25 mL硅胶混合物）进行着色（补充图S1B）。
3. 在模具形式中倒入一层薄薄的硅胶，足以完全覆盖底部。夯实使表面变平，并等待24小时以使硅胶凝固（补充图S1C）。
4. 如上所述，倒入第二层硅胶，其深度足以覆盖图案上的中心孔芯印刷（ 在补充图S1D中图案的顶部可见）。将图案插入液体硅胶中，中心孔芯打印朝下。确保没有气泡被捕获，并且图案分离良好且不接触（补充图S1E）。
5. 用重物和/或胶带固定图案，以防止它们在凝固时从硅胶中漂浮出来。等待24小时以使新浇注的层凝固（补充图S1F）。
6. 倒入额外的硅胶层，直到水平与图案顶部齐平。等待24小时固化（补充图S1G）。
7. 拆卸卡扣在一起的塑料块以释放模具。删除图案（补充图S1H）。检查模具是否有撕裂或畸形（补充图S1I）。

4. 塑溶胶环的铸造

1. 用食用油涂覆模具内部、所有核心部件和 O 形圈（补充图 S2A、B）。在中心柱芯中间的凹口周围放置一个O形圈，并将芯放在塑料溶胶环模具的中心孔中（补充图S2C）。
2. 将输送通道芯插入塑溶胶环模具侧面的孔中。将输送通道芯末端的 V 形尖端定向到与中心柱芯上的 O 形圈对齐（补充图 S2D，E）。
3. 在微波中加热增塑溶胶短10秒（补充图S2F，G）。轻轻搅拌塑料溶胶以避免气泡（补充图S2H）。重复加热和搅拌，直到溶液达到160°C至170°C之间的温度（补充图S2I）。
   注意：增塑溶胶过热会导致有毒烟雾的释放。在通风良好的区域或通风橱中执行该程序。不要将增塑溶胶加热超过170°C。
4. 将熔融的增塑溶胶倒入模具外边缘附近的增塑溶胶环模具中，不要引入气泡（补充图S2J）。等待1小时，使增塑溶胶环冷却（补充图S2K）。从模具中取出环。在用于实验测定之前，请确保与DPI设备正确配合（补充图S2L）。

5. 将 DPI 设备连接到工厂

1. 在中继上为设备附件找到一个平滑、健康的站点。避免任何颠簸或打结，因为这些会导致设备泄漏。
2. 使用直径为 2 mm 的钻头在阀杆中心水平钻一个孔，与树干表面成 90° 角（补充图 S3A）。将钻头穿过孔几次，以清洁和平滑它以创建一个无障碍的孔（补充图 S3B）。
3. 在化合物输送通道另一侧的增塑溶胶环中创建一个垂直切片（补充图S3C）。将环安装在植物周围，并将输送通道与先前钻孔对齐（补充图S3D）。
   注意：环必须紧贴在行李箱周围，以避免泄漏;各种直径的核心组件可用于为不同尺寸的植物茎制作塑料溶胶环。
4. 将 DPI 设备添加到增塑溶胶环中，确保它们紧密贴合在一起。将DPI设备喷口与增塑溶胶环输送通道和钻孔对齐（补充图S3E）。
   注意： 使用钻头将孔和 DPI 设备喷口对齐可能会有所帮助。
5. 用硅胶带紧紧包裹以将设备固定到位（补充图S3F）。检查完全组装和连接的设备，以确保工厂的正确对齐和方向。

6. 使用 DPI 设备应用感兴趣的复方

1. 使用注射器或移液器将感兴趣的溶液填充DPI设备（补充图S3G）。使用注射器穿透DPI设备另一侧的硅胶带和塑料溶胶环，将空气从内部通道中抽出，避免将气泡引入植物脉管系统（补充图S3H）。将任何提取的化合物置回DPI设备。
2. 在注射器形成的孔上再添加一小块硅胶带，以加强该区域并防止撕裂。检查设备在连接点处是否有可见泄漏，并检查设备储液罐的液位是否稳定。
   注意：最初可以使用水来测试泄漏，以避免浪费测试溶液。
3. 用蜡密封膜覆盖DPI装置的开口端，向下拉以形成密封并减少实验化合物的蒸发。用注射器尖端在蜡膜上戳一个孔以防止真空的发展，然后重新填充设备（补充图S3I）。
4. 每天检查设备以确保组件正确对齐（补充图S3J），并使用注射器加满液体以避免储液器干涸。重复此过程，直到引入所需量的实验溶液。
   注意：化合物可以从给定设备成功引入长达 1 个月。超过此时间范围的溶液吸收持续时间应在实验设置之前进行经验测试。

7. 使用CFDA观察柑橘类植物的维管运动

1. 将 DPI 装置连接到 25 厘米高的香橼（柑橘药用 L.）植物上，在 H 2 O 对照或 CFDA 中对 DPI 装置施加 2.0 mL 处理的 20% DMSO，并让它吸收 24 小时。要遵循此协议，通过将 1.6 mL H₂O 添加到 400 μL CFDA 储备溶液（储备溶液中含有溶解在 100% 二甲基亚砜 [DMSO] 中的 10 mM CFDA）来制备有效的 CFDA 溶液，以产生 2 mM 和 20% DMSO 的最终 CFDA 浓度。
2. 制作植物各种组织的横截面，并使用带有荧光滤光片的立体镜或复合显微镜（包括498nm波长）来可视化植物组织中的CFDA。将图像与H₂O对照中的20%DMSO进行比较，以解释组织中的自发荧光。

8. 测定链霉素处理后叶片样品中CLas滴度的变化

1. 使用0.75米高的温室种植的CLas感染的瓦伦西亚（Citrus sinensis （L .） Osbeck“Valencia”）植物，从每株植物上收集两片HLB症状叶的叶柄和中脉，将它们切成小段，汇集每种组织类型，并将它们分别储存在含有直径6.35毫米的钢球的2 mL抗冲击样品管中。
2. 使用均质器以 3.4 m/s 的速度研磨样品，该均质器编程为两个 15 秒循环。如前所述提取总核酸¹⁹。
3. 使用表 1 中定义的qPCR混合物和 表2中定义的反应条件对CLas感染的叶片样品进行qPCR。使用显示强壮CLas感染的植物（强壮感染通常定义为基于qPCR的Ct值注意：使用CLas 16S Las Long（LL）和柑橘脱水素DNA引物估计细菌滴度，以估计相对基因组当量，如前^所述20。
4. 为符合上述最低感染滴度的柑橘类植物配备DPI设备，并对其进行所需浓度的2.0mL H₂O溶液或链霉素溶液的一次性处理。要遵循本研究，请使用溶解在 H₂O 中的 9.5 mg/mL（总共 19 mg）链霉素的单次 2.0 mL 处理。
5. 在处理后 7 天、14 天和 28 天收集叶片样品。使用与上述相同的方案测定取样叶的CLas滴度。
6. 在处理后60天，获取用H₂O或链霉素处理的植物的照片。使用对 CLas 感染的目视观察来对感染严重程度进行评分。寻找<50%的叶子显示脉间萎黄和叶脉软化以及叶子潮红生长作为轻度感染的迹象，超过50%的叶子出现静脉间萎黄和脉塞以及叶片脱落和植物生长发育迟缓作为更严重感染的迹象。

9.吡虫啉治疗后柑橘D. 的死亡率的测定

1. 将0.5米高的香橼（柑橘药 用L.）植物修剪到12厘米的高度，以促进新潮的生长。
   注意：冲洗生长的速度可能取决于植物的健康状况和一年中的时间;因此，在实验设计期间要考虑到这一点。
2. 在>6冲洗后，长1-2厘米，已经发育，将植物引入含有成年 D. citri 的笼子中。将植物留在笼子中24小时，以允许卵沉积。
3. 产卵后 1-2 天对三个冲洗芽进行代表性的鸡蛋计数，然后应用 DPI 设备。用 2.0 mL 水对照或所需浓度的吡虫啉（21.8% 活性成分）填充这些装置。要遵循此协议，请使用 528 μL/L、52.8 μL/L 和 5.28 μL/L 的吡虫啉。
   注意：卵计数是一种破坏性措施，因此此阶段的计数用于估计同一植物未计数冲洗的卵数，并帮助为实验结束时进行的后续若虫出现计数提供基线。
4. 收集至少三个剩余齐平芽的 柑橘 出苗率。在化合物引入后7天获取代表性植物照片。

讨论

为了使DPI装置被认为是将外源化合物输送到植物中的可行方法，它必须有助于对各种组织类型进行稳健和一致的化合物摄取。使用CFDA的实验清楚地显示了不动音和基瓣化合物的运动，以及叶片的血管系统和叶肉细胞。此外，并且可能由于该DPI设备中使用的钻孔为化合物吸收提供了大量的表面积，因此CFDA在茎的所有部分中以相对相等的量存在，而不仅仅是在与设备相邻的脉管系统的一小部分中，正如先前使用树^干注射的植物染料吸收研究所见的那样6.此外，使用DPI设备测试了绿色荧光蛋白和花卉染料的递送，并观察到这些化合物的分布与CFDA相似（数据未显示）。这些数据表明，该装置可用于系统递送各种大小和分子结构不同的化合物。然而，值得注意的是，基于叶片发育阶段的复合吸收存在差异，年轻发育中的叶比较老的成熟叶吸收更多的化合物。这可能是由于汇与源组织中存在的脉管系统特性的变化，应针对给定的实验进行优化。

DPI装置对CFDA、GFP和花卉染料的可视化表现出足够的化合物吸收，并且还分别显示出链霉素和吡虫啉的抗菌和杀虫作用。这两种化合物在单次 2.0 mL 处理后 1 周均导致目标生物体活力发生变化。这些数据表明，DPI装置可用于全植物测定，以测试各种化合物的生存能力，以控制微生物和害虫。此外，由于其与血管系统的直接接触，该装置甚至可以提供机会来测试根或表皮细胞无法有效吸收的化合物。特别感兴趣的是RNA干扰（RNAi），因为它可用于调节宿主植物，病原体或病原体载体内的基因表达。先前通过苹果和葡萄植株树干上的钻孔引入发夹RNA的研究表明，RNA分子仅限于木质部组织，这表明这些分子可能仅对咀嚼和木质部汁液喂养生物有效²²。鉴于DPI装置使用类似的钻孔递送系统，因此使用该装置递送的发夹RNA也可能仅限于木质部组织。然而，在DPI装置的链霉素治疗后观察到韧皮部限制性CLas滴度的降低强烈表明这种抗生素存在于韧皮部中。因此，使用DPI装置输送的化合物的血管分布可能取决于它们的大小和化学性质，并且应单独评估每个分子。

尽管市场上有许多商用DPI设备，但此处描述的设备可以在内部制造并且是可修改的。通过这种方式，可以根据所使用的植物种类和实验设计进行尺寸的改进和变化，并且不依赖于商业产品。此外，该装置是半永久性地附着在植物上，这意味着可以同时对给定化合物进行多次处理，而不必通过多次化合物注射重新伤害植物。需要注意的是，如果安装不正确，设备可能会泄漏。结果，化合物会流失到环境中，而不是被输送到工厂。因此，在设置过程中和之后的头几天，应注意检查设备是否有任何泄漏迹象。虽然在树上钻一个洞是潜在的有害的，但选择这种方法是为了确保稳定和一致的化合物吸收。此外，在这些实验中，DPI设备的连接没有看到对植物健康的不利影响。但是，实验设计中应包括额外的植物，以替换那些在整个给定实验过程中可能失去活力的植物。最后，由于该装置使用被动流来引入化合物，因此很难预测不同植物物种或同一物种的发育阶段的吸收率。如果化合物吸收的速度是一个限制因素，这可能会使实验复杂化。为了获得最佳结果，应计划实验，以便为植物提供足够的时间完全吸收 2.5 mL 化合物，这可能需要长达 1 周的时间。总之，该DPI装置是快速评估抗菌或杀虫化合物对CLas及其载体D. citri的植物内活性的有效工具，因此提供了比先前提出的分离叶测定法更多的关于系统有效性和对植物性能影响的信息²³。毫无疑问，该系统的应用范围远远超出了本研究中描述的特定用途。

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.5 cm Diameter Steel Balls	Ballistic Products Inc.	#SHT #T
10 mL Luer-Lok Syringe	Becton Dickinson	382903029952
20 G 1 Syringe Needle	Becton Dickinson	305175
2 mL Screw Cap Tubes	USA Scientific	1420-9710
3/32nd Inch Black Oxide Drill Bit	Sears	964077
3D Printer	Markforged	F-PR-2027
3D Printing Software	Markforged	F-SW-FDVX
3D Printing Software	Markforged	S-FW-OEVX
5(6)-CFDA (5-(and-6)-Carboxyfluorescein Diacetate)	Invitrogen	C195
5/64th Inch Black Oxide Drill Bit	Sears	964502
96 Well qPCR Machine	Roche	5815916001
Centrifuge	Eppendorf	22621408
Fluorescent Microscope	Olympus	SP-BX43-BI
Fluorescent Microscope Filter	Chroma	69401-ET
Gloss Clear Spray Paint	Rustoleum	249117
Grey Lego Baseplate	Lego	11024
Handheld Cordless Drill	Makita	6349D
Homogenizer	Fisher Scientific	15-340-163
Imidacloprid 2F	Quali-Pro	83080133
Liquid Plastisol Medium Hardness	Fusion X Fishing Lures	XSOL-505
Red Silicone 70 Shore A O-Ring	Grainger	Varies by Size
Non-Stick Cooking Spray	PAM	64144030217
NucleoSpin Plant II	Macherey-Nagel	740770.5
Parafilm	Bemis	HS234526A
Poly Viyl Acetate Based Glue	Elmers	E301
qPCR Master Mix	Promega	A6001
qPCR Primers	Integrated DNA Technologies	Varies by DNA sequence
Reverse Transcriptase	Promega	A5003
Single Edge Razor Blade	Garvey	40475
Translucent Silicone RTV Rubber	Aero Marine Products	AM 115T
Transparent Silicone Tape	Maxwell	KE30S
Truncated Oncocin 112	Genscript	Varies by peptide sequence
White 1 x 6 Lego Piece	Lego	300901
White Nylon	Markforged	F-MF-0003