JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • النتائج
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

يتم تقديم النضج في المختبر لأنسجة المبيض (OTO-IVM) ، وهي تقنية يمكن الوصول إليها داخل مختبر الإنجاب الطبي المساعد (MAR) التي تقدم خيارات إضافية واقعية للحفاظ على الخصوبة للمرضى الذين يحتاجون إلى حفظ أنسجة المبيض بالتبريد.

Abstract

تزجيج البويضات الناضجة هو معيار الرعاية للحفاظ على الخصوبة لدى النساء المعرضات لخطر العقم. ومع ذلك ، لا يزال حفظ أنسجة المبيض بالتبريد (OTC) هو الخيار الوحيد للحفاظ على الخصوبة لدى النساء اللواتي يحتجن إلى بدء العلاج السام للغدد التناسلية بشكل عاجل أو في الأطفال قبل البلوغ. أثناء تحضير قشرة المبيض للحفظ بالتبريد ، تتم إزالة أنسجة النخاع. توجد البصيلات التاجية المتنامية على حدود واجهة القشرة والنخاع للمبيض ويتم كسرها خلال هذه العملية ، مما يؤدي إلى إطلاق مركب البويضات الركامية (COC). من خلال الفحص الدقيق للأنسجة النخاعية المتوسطة والمجزأة ، يمكن تحديد هذه المجمعات الركامية والبويضات غير الناضجة دون التدخل في إجراء OTC. يمكن أن تنضج البويضات غير الناضجة المشتقة من أنسجة المبيض بنجاح في المختبر ، مما يخلق مصدرا إضافيا للأمشاج للحفاظ على الخصوبة. إذا تم إجراء OTC داخل أو بالقرب من مختبر الإنجاب بمساعدة طبية ، فيمكن أن تكون جميع أدوات النضج في المختبر (IVM) وأدوات تزجيج البويضات في متناول اليد. علاوة على ذلك ، عند مغفرة الطفل ورغبة الطفل ، يكون لدى المريض خيارات متعددة لاستعادة الخصوبة: زرع أنسجة المبيض أو نقل الأجنة بعد تلقيح البويضات المزججة / الدافئة. وبالتالي ، يمكن أن يكون نضوج البويضات في أنسجة المبيض في المختبر (OTO-IVM) أسلوبا مساعدا قيما للحفاظ على الخصوبة.

Introduction

تعتمد خيارات الحفاظ على الخصوبة (FP) للنساء المخططات للعلاج السام للغدد التناسلية ، أو علاج تغيير الجنس ، أو النساء اللواتي لديهن استعداد وراثي لفشل المبيض المبكر ، على صحة المريض وعمره ، والإطار الزمني المتاح ، ونوع العلاج ، وتفضيل المريض ، وإجراءات FP المتاحة في مركز الخصوبة المفضل. يعتبر تزجيج البويضات الناضجة التي تم الحصول عليها بعد تحفيز المبيض باستخدام موجهة الغدد التناسلية واسترجاع البويضات في دورة مختبرية الإنجاب الطبي بمساعدة (MAR) الخيار المفضل ل FP1،2. ومع ذلك ، بالنسبة للفتيات قبل البلوغ ، والنساء اللواتي يلزم البدء العاجل في العلاج السام للغدد التناسلية أو استئصال الغدد التناسلية ، أو النساء المعرضات لخطر كبير للإصابة بانقطاع الطمث الدائم بسبب العلاج السام للغدد التناسلية ، لا يمكن إجراء دورة من تحفيز المبيض باستخدام موجهة الغدد التناسلية ، وحفظ أنسجة المبيض بالتبريد (OTC) ، وهي تقنية مقبولة وصالحة ل FP1،2 ، 3 ، هو الخيار الوحيد. الهدف من OTC هو الحفاظ على الآلاف من البصيلات البدائية الخاملة في أنسجة قشرة المبيض ، والتي يمكن أن تستأنف النمو بعد زرع الأنسجة المجمدة / المذابة على المبيض المتبقي أو في جيب بريتوني بعد الفحص الدقيق للحد الأدنى من المرض المتبقي في شظايا الأنسجة التمثيلية.

من أجل الحصول على شظايا قشرية بسمك 1-2 مم مناسبة للحفظ بالتبريد ، يجب إزالة الأنسجة النخاعية الرخوة. يستلزم هذا النسيج النخاعي عادة نمو بصيلات في مراحل مختلفة من التطور تهرب من قشرة المبيض المتيبسة للسماح بنموهاوتوسعها 4. لسنوات عديدة ، كانت العديد من المختبرات تبحث في إمكانات هذه البويضات المستردة من البصيلات الموجودة في الأنسجة النخاعية المتبقية بعد تحضير شظايا قشرة المبيض باستخدام النضج في المختبر (IVM) 5،6،7 ، المشار إليها باسم بويضة أنسجة المبيض IVM (OTO-IVM). تحتوي البصيلات الباطنية ، حتى تلك التي يقل قطرها عن 6 مم ، على بويضات غير ناضجة محاطة بخلايا ركامية يمكن أن تنضج وتخصيب وتتطور إلى أطفال أصحاء باستخدام نظام IVM8،9. يعتبر IVM معيار الرعاية للنساء المعرضات لخطر الإصابة بمتلازمة فرط تحفيز المبيض (OHSS) ، مثل مرضى متلازمة المبيض المتعدد الكيسات (PCOS). ومع ذلك ، في مجال FP ، هناك بيانات محدودة متاحة للIVM في الحالات التي تحتوي على موانع لتحفيز المبيض. لا يزال IVM من البويضات التي تم جمعها عبر المهبل يعتبر مبتكرا ، ويعتبر OTO-IVM تجريبيا2،10. ومع ذلك ، فإن تقارير الولادات الحية الأولى بعد OTO-IVM11،12،13 تسلط الضوء على إمكانية استخدام OTO-IVM كتقنية إضافية عندما يكون OTC مطلوبا ل FP في المرضى14.

تقدم هذه الدراسة تفاصيل فنية لاعتماد OTO-IVM في مختبر MAR وتوضح النتائج التي تم الحصول عليها في مركز واحد.

Protocol

تمت الموافقة على هذه الدراسة حول OTO-IVM من قبل اللجنة الأخلاقية المحلية في UZ-Brussels (إضافة المشروع 2008/068 والمشروع 2022/303). وقع جميع المرضى على موافقة خطية مستنيرة. تم تقييم كل مريض على حدة من قبل طبيب متخصص في الطب التناسلي وممرضة ملاح وأخصائي الأورام المحيل لوضع خطة علاج FP المثلى ، مع مراعاة تفضيلات المريض14. باختصار ، المرضى المؤهلون للحصول على OTC هم في حاجة ماسة إلى FP وتقل أعمارهم عن 36 عامامن 14 عاما. للجمع بين OTC و OTO-IVM ، لا يمكن إعطاء العلاج الكيميائي أو الإشعاعي في الأشهر ال 6 السابقة لعلاج OTC.

1. بيئة المختبر والموظفين

  1. قم بإجراء OTC في خزانة التدفق الصفحي من الفئة A.
  2. قم بإجراء OTC مع مشغلين: أحدهما يعمل بشكل معقم في خزانة التدفق الصفحي ، والثاني لتنظيف جميع المواد غير المعقمة باستخدام رذاذ مزيل للتلوث بمبيد للجراثيم ومبيد الأبواغ وتسليم المواد والإمدادات بشكل معقم إلى المشغل الأول. قم بمعالجة قشرة المبيض على غطاء مبرد على الطاولة (± 4 درجات مئوية).
  3. قم بإجراء البحث عن مركب البويضات الركامية (COC) في خزانة تدفق رقائقي ثانية باستخدام مجهر مجسم في مختبر MAR على مرحلة ساخنة (37 درجة مئوية).
  4. قم بإجراء استرجاع COC من بقايا النخاع (القسمان 3 و 4) وبدء عملية IVM (القسم 5). يتم ذلك بواسطة مشغل ثالث.

2. إعداد وسائل الإعلام

ملاحظة: يتم استخدام خمسة أنواع من الوسائط لهذا الإجراء (مفصلة أدناه): وسيط المناولة بدون وصفة طبية، ووسط التجميد بدون وصفة طبية، ووسيط البحث، ووسط مجموعة تجميع الارتباطات (LAG)، ووسيط IVM. عند تحضير الوسائط ، اعمل بشكل معقم في خزانة التدفق ، كما هو مفصل في القسم 1. استخدم كواشف جديدة غير مفتوحة لكل إجراء وحافظ على عقم جميع المستهلكات المستخدمة للتأكد من عقم الوسائط المنتجة.

  1. وسط المناولة OTC
    1. مكمل وسيط Leibovitz's L15 مع 4 ملغ / مل من ألبومين المصل البشري (HSA) ، و 100 وحدة / مل بنسلين ، و 100 ميكروغرام / مل من الستربتومايسين (انظر جدول المواد).
    2. احتفظ بوسط المناولة بدون وصفة طبية في الثلاجة حتى الاستخدام (لمدة أقصاها يومين).
      ملاحظة: استخدم وسيط المناولة بدون وصفة طبية لشطف أنسجة المبيض ومعالجتها واستخدمها باردة (0-4 درجة مئوية).
  2. وسط التجميد بدون وصفة طبية
    1. مكمل لوسط Leibovitz L15 مع 1.5 M ثنائي ميثيل سلفوكسيد (DMSO) و 4 مجم / مل HSA.
    2. احتفظ بوسط التجميد الذي لا تستلزم وصفة طبية في الثلاجة حتى الاستخدام (لمدة أقصاها يومين).
  3. وسيط البحث
    ملاحظة: وسيط البحث (وسيط مخزن مؤقت ب HEPES لمعالجة البويضات) متاح تجاريا (انظر جدول المواد) وجاهز للاستخدام. استخدم وسيط البحث لشطف الفلتر وجمع COC أثناء البحث عن COCs بين شظايا النخاع (القسم 4).
    1. املأ ستة أنابيب معقمة مستديرة القاع سعة 14 مل بسعة 6 مل من وسيط البحث.
    2. قم بإعداد طبق مكون من 4 آبار يحتوي على 500 ميكرولتر من وسط البحث المغطى ب 350 ميكرولتر من الزيت (انظر جدول المواد).
    3. قم بتسخين الأنابيب والطبق المكون من 4 آبار عند 37 درجة مئوية لمدة ساعة واحدة على الأقل قبل وصول أنسجة المبيض. لا تتطلب الوسائط المخزنة ب HEPESحضانة ثاني أكسيد الكربون.
  4. LAG متوسط
    ملاحظة: يتألف نظام الإدارة المتكاملة للنواتج المتاح تجاريا (انظر جدول المواد) من وسيلتين مختلفتين: وسيط LAG ووسيط IVM، اللذين يجب استكمالهما كما هو مفصل أدناه. يستخدم وسط LAG لشطف COCs ، ولكن يمكن استخدامه أيضا لفترة حضانة مدتها 2-3 ساعات تسبق IVM في وسط IVM ، كما هو مقترح في إدخال نظام IVM.
    1. استخدم وسيط مجموعة تجميع الارتباطات (LAG) المتوفرة تجاريا والجاهزة للاستخدام (انظر جدول المواد).
  5. IVM متوسط
    1. مكمل غذائي متاح تجاريا في وسط IVM مع 10 مجم / مل HSA ، و 75 ملي وحدة دولية / مل هرمون تحفيز الجريب (FSH) ، و 100 ملي وحدة / مل موجهة الغدد التناسلية المشيمية البشرية (hCG).
    2. قم بإعداد طبق استزراع مكون من 4 آبار مع بئر واحد من وسط LAG وثلاثة آبار من وسط IVM التكميلي: 500 ميكرولتر من الوسط المغطى ب 350 ميكرولتر من تراكب الزيت.
    3. قم بموازنة الطبق طوال الليل في حاضنة عند 37 درجة مئوية في 6٪ ثاني أكسيد الكربون2 و 20٪ O2 ، البيئة المثلى لثقافة IVM.

3. تحضير قشرة المبيض

ملاحظة: تم إجراء إزالة المبيض الكامل بالمنظار كما هو موضح من قبل Jadoul et al.15.

  1. عند وصول المبيض إلى المختبر ، اغسل المبيض في وسط المناولة بدون وصفة طبية (الخطوة 2.1) مرتين عن طريق نقل المبيض إلى طبق بتري 100 مم مع وسيط المناولة بدون وصفة طبية.
  2. باستخدام مشرط ، افتح المبيض إلى نصفين طوليا (الشكل 1 أ).
  3. قم بعمل عدة شقوق في الأنسجة النخاعية رأسيا وأفقيا باستخدام مشرط جديد. تجنب إتلاف القشرة. اثقب البصيلات التاجية الصلبة ذات الأحجام المختلفة داخل النخاع برفق باستخدام المشرط لتحرير السائل الجريبي في وسط المناولة بدون وصفة طبية.
  4. قم بتقليص أنسجة النخاع الرخوة بمقص جراحي (الشكل 1 ب). قد يستغرق هذا الإجراء عدة دقائق.
  5. ضعي قشرة المبيض في طبق جديد مع وسيط معالجة طازج بدون وصفة طبية أثناء عملية التشذيب.
  6. انقل الطبق بشظايا النخاع والسائل المسامي الذي تم إطلاقه (الشكل 1C) إلى خزانة التدفق الثانية لبدء البحث عن COCs.
  7. كرر الخطوات من 3.4 إلى 3.6 حتى يتم الحصول على السماكة المطلوبة (1-2 مم) لأنسجة القشرة.
  8. قطعي القشرة إلى قطع بحجم 8 مم × 5 مم تقريبا.
  9. احتضن القطع 3 مرات متتالية لمدة 10 دقائق في حوالي 25 مل من وسط التجميد بدون وصفة طبية (الخطوة 2.2) في أطباق بتري 100 مم.
  10. ضع قطعة واحدة في 800 ميكرولتر من وسط التجميد بدون وصفة طبية في التبريد.
  11. حفظ أنسجة المبيض بالتبريد باستخدام بروتوكول تجميد بطيء في غرفة تبريد يتم التحكم فيها بواسطة جهاز تحكم في درجة الحرارة (انظر جدول المواد): من 4 درجات مئوية إلى -7 درجات مئوية عند -2 درجة مئوية / دقيقة ، البذر اليدوي عند -7 درجة مئوية ، من -7 درجة مئوية إلى -40 درجة مئوية عند -0.3 درجة مئوية / دقيقة ، من -40 درجة مئوية إلى -100 درجة مئوية عند -10 درجة مئوية / دقيقة ، وعند -100 درجة مئوية ، اغمر المبردات في النيتروجين السائل وقم بتخزينها.

4. البحث عن COCs

  1. قم بإعداد خزانة التدفق الصفحي للبحث عن COC.
    1. أطباق ثقافة دافئة مقاس 60 مم على المسرح الساخن تحت المجهر المجسم في خزانة التدفق الصفحي.
    2. ضع الأنابيب سعة 14 مل مع 6 مل من وسط البحث المسخن مسبقا (الخطوة 2.3.1) في كتلة ساخنة ، والطبق المسخن مسبقا المكون من 4 آبار مع وسيط البحث على المسرح الساخن تحت المجهر في خزانة التدفق الصفحي.
    3. ضع مرشحا معقما (مصفاة خلية ، بحجم شبكة 70 ميكرومتر ؛ انظر جدول المواد) من الأسفل إلى أسفل في طبق الاستزراع.
    4. خذ شعيرات دموية زجاجية 290-310 ميكرومتر للاستخدام: لا تستخدم الشعيرات الدموية الأصغر من 290-310 ميكرومتر ، لتجنب تلف اتصال البويضة والخلايا الركامية.
    5. تأكد من توفر أطراف مرشح سعة 1 مل وماصة سعة 1 مل.
  2. خذ الطبق الأول مع شظايا النخاع من خزانة التدفق الصفحي OTC (4 درجات مئوية) وضع الطبق على المرحلة الساخنة (37 درجة مئوية) في خزانة التدفق الصفحي IVM في أسرع وقت ممكن.
    ملاحظة: قد يكون الطبق الأول من شظايا النخاع والسائل المسابي ملوثا بالدم من بصيلات الإباضة المملوءة بالدم أو الأوعية الدموية للمبيض نفسه. تعمل خلايا الدم الحمراء على تشويش الرؤية الواضحة وتعقد البحث عن COCs. يجب إزالة الوسط الملوث لغسل خلايا الدم الحمراء (انظر الخطوة 4.3).
  3. قم بإزالة تلوث خلايا الدم باتباع الخطوات أدناه.
    1. Pipet 2 مل من وسيط البحث فوق غشاء المرشح (مصفاة خلية 70 ميكرومتر) لترطيب الغشاء ووضع الطبق ، الذي التقط الوسط ، جانبا على المرحلة الساخنة.
    2. اقلب الفلتر رأسا على عقب وضعه بالمقبض على حافة طبق ثقافة جديد ، مما يخلق منحدرا مع الجزء السفلي من الفلتر.
    3. اجمع الوسط الملوث بالدم بين شظايا النخاع باستخدام طرف 1 مل وانفخه برفق فوق غشاء المرشح (الشكل 1 د) لالتقاط COCs الموجودة في الوسط الملوث.
    4. كرر الخطوة 4.3.3 حتى تتم إزالة معظم الوسط الملوث بالدم.
    5. صب وسط البحث الطازج على شظايا النخاع على الفور للحفاظ على COC معلقا في وسط الاستزراع في جميع الأوقات.
    6. اشطف غشاء المرشح المنحدر برفق باستخدام 2 مل من وسيط البحث لشطف خلايا الدم الحمراء على غشاء المرشح.
    7. ضع الفلتر من الأسفل إلى أسفل في طبق جديد واسكب 3-4 مل من وسيط البحث في الفلتر لطرد COC من غشاء المرشح إلى الوسط الذي يملأ الطبق. قم بإزالة الفلتر. للتأكد من أن غشاء المرشح لا يجف (وأي COCs محتملة لم يتم طردها منه بعد) ، اغمر الفلتر من أسفل إلى أسفل في الطبق الأول ، والذي تم استخدامه لترطيب الفلتر لأول مرة.
    8. افحص على الفور الوسط المطرود ل COCs عن طريق الفحص البصري تحت مجهر استريو بتكبير 10x-50x. ابحث عن البويضات الشفافة الشفافة ذات حافة من الخلايا الركامية المحيطة الداكنة والمضغوطة (الشكل 1 ه). حرك الوسط في الطبق وافحص الوسط مرة أخرى.
    9. اشطف الفلتر مرة ثانية في طبق جديد وافحص الوسط المطرود بحثا عن COCs.
    10. افحص الوسط الموجود في الطبق حيث يتم غمر الفلتر لباقي COCs.
    11. انقل COCs مع الشعيرات الدموية الزجاجية إلى طبق مكون من 4 آبار يحتوي على وسيط البحث (الشكل 1E). احتفظ بالأطباق على المسرح الساخن في جميع الأوقات.
  4. ابحث بين شظايا النخاع عن COCs بعد إزالة خلايا الدم الملوثة من الطبق بشظايا النخاع وتجديد الطبق بوسيط بحث واضح. استخدم الشعيرات الدموية الزجاجية للتحرك حول شظايا النخاع وقم بتدوير الوسط في الطبق للعثور على COCs. قم بتفكيك شظايا النخاع الكبيرة بإبر السل على حقنة سعة 1 مل في حالة الاشتباه في وجود بويضة.
  5. اجمع كل COCs السليمة في طبق 4 آبار باستخدام وسيط البحث.
    ملاحظة: في إجراء نموذجي بدون وصفة طبية ، يتم تقليص أنسجة القشرة من النخاع باستخدام ثلاثة أطباق متتالية مقاس 100 مم ، حيث يتم نقل قشرة المبيض إلى طبق جديد بوسط طازج وحيث يتم نقل البقايا إلى تدفق IVM للبحث عن COC. عادة ، يتطلب الطبق الأول فقط إزالة خلايا الدم ؛ في الطبقين الثاني والثالث ، يوجد عدد أقل من شظايا النخاع ، ويتم إجراء بحث COC مباشرة بين الأجزاء وفي الوسط.

5. IVM من COCs

  1. اشطف COCs في بئر نظيف باستخدام وسيط البحث.
  2. انقل طبق ثقافة IVM المتوازن مسبقا (الطبق المكون من 4 آبار الذي يحتوي على بئر واحد من وسط LAG وثلاثة آبار من وسط IVM) من الحاضنة إلى المرحلة الساخنة في خزانة تدفق IVM.
  3. قم بتسمية طبق ثقافة IVM الذي يحتوي على COCs بمعلومات المريض.
  4. اشطف COCs في وسط LAG (2-3 ثوان) وضعها في أحد الآبار الثلاثة مع وسيط IVM الكامل. استزراع COCs في مجموعات من حوالي 10 COCs لكل بئر. حذف البويضات العارية - البويضات الخالية من الخلايا الركامية المرتبطة - من الثقافة ، حيث من المعروف أن إمكاناتها التنموية تعرضت للخطر بشدة.
  5. ضع الطبق في حاضنة عند 37 درجة مئوية ، و 6٪ ثاني أكسيد الكربون2 ، و 20٪ O2 لمدة 30 ساعة.

6. التعامل مع البويضات الناضجة

  1. قم بتجريد البويضات من الخلايا الركامية المحيطة بها عن طريق التعرض لفترة وجيزة ل 80 وحدة دولية من الهيالورونيداز (انظر جدول المواد) وسحب العينات الميكانيكية اللطيفة بعد 30 ساعة من IVM.
  2. تحديد البويضات الناضجة عن طريق بثق الجسم القطبي الأول.
  3. تزجيج أو تلقيح البويضات الناضجة ، حسب تفضيل المريض.
    ملاحظة: إذا كان فحص النضج بعد 30 ساعة من IVM يقع خارج ساعات العمل المقبولة ، فيمكن تقصير مدة IVM إلى 28 ساعة أو تمديدها حتى 42 ساعة. إذا تم الحصول على عدد قليل من البويضات الناضجة بعد 30 ساعة ، فيمكن زراعة البويضات غير الناضجة بين عشية وضحاها في بئر IVM الأصلي ، الخالي من الخلايا الركامية ، واستخدامها في صباح اليوم التالي للتزجيج أو حقن المنوية داخل الهيولى (ICSI) عندما تنضج.

النتائج

على مدى العقد الماضي ، تم أيضا عرض على 98 مريضا يخضعون لاستئصال المبيض أو خزعة المبيض من أجل OTC OTO-IVM. النتائج المعروضة هنا هي تحديث للبرنامج السريري كما تم نشره قبل7،13. نضجت البويضات غير الناضجة التي تم الحصول عليها أثناء معالجة أنسجة المبيض ...

Discussion

تتمثل أولوية إجراء FP دائما في معالجة قشرة المبيض وتجميدها وفقا لبروتوكول التشغيل القياسي الذي تم التحقق من صحته في العيادة. عيب في FP هو عدم وجود بروتوكول قياسي متاح في الأدبيات المنشورة فيما يتعلق ب OTC و OTO-IVM. من الصعب تقييم كفاءة وصحة التقنيات والتكيفات نظرا لوجود فجوة ز?...

Disclosures

لا يوجد لدى أصحاب البلاغ مصالح مالية متنافسة.

Acknowledgements

تم إجراء هذا العمل في مختبر التلقيح الاصطناعي في بروكسل IVF ، Universitair Ziekenhuis في VUB ، بروكسل. يود المؤلفون أن يشكروا جميع أعضاء فريق مختبر بروكسل لأطفال الأنابيب على مهاراتهم العالية ودقتهم ومرونتهم اللازمة لإنشاء وحدة الحفاظ على الخصوبة داخل مختبر MAR.

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
1000 µL filter tipsEppendorf/VWR International613-6780COC search
Benchtop CoolerFisher Scientific15-350-54Benchtop Cooler lid is used to prepare the tissue, Benchtop Cooler tube holder to keep cryovials with freezing medium cooled
Corning Cell culture dish, non-treated, 100 mmCorning/VWR International430591Dish for ovarian tissue preparation
CryoSure-DMSOWAK Chemicals0482Cryoprotectant for ovarian tissue cryopreservation
CumulaseOrigio/CooperSurgical16125000Arecombinant human hyaluronidase enzyme for cumulus cell removal after IVM
Decontamination spray: SuproxMedipure LTDMP016Desinfectant solution for aseptic handling with bactericide and sporicide action
Disposable scalpelsSwann-Morton0511Ovarian tissue preparation
Falcon 14 mL Round Bottom Polystyrene Test Tube, with Snap Cap, SterileFalcon/VWR InternationalBDAA352057Medium container 
Falcon Cell strainer 70 µmFalcon/VWR International352350Filter for elimination of red blood cell contamination and COC search
Freeze control Ampoule Cryochamber and Temperature ControllerCryologicCL-8800i   CC60ASSlow freezing machine
FSH: Menopur 75 IUFerringBE197504Follicle Stimulating Hormone : Supplement for IVM medium
Handling pipette 290-310 µmVitrolife15538COC search: gentle transfer of COC without damaging oocyte-cumulus cell connectivity
hCG: Brevactid 5000 IEFerring5008001036Human Chorionic Gonadotropin : Supplement for IVM medium
High security tubeCryoBioSystem022252cryovial, heat-sealed for safe cryostorage
HSA-solutionVitrolife10064Human serum Albumin: supplement for IVM medium
Leibovitz's L-15 mediumLife Technologies Europe31415-029Handling medium for ovarian tissue preparation
MediCult IVM systemOrigio/CooperSurgical82214010medium for IVM containing both LAG and IVM medium. IVM medium needs to be supplemented as detailed in the protocol
METZENBAUM fino scissors 140 mmChirurgical MaintenanceVIZ08280314Medium size scissors for initial medulla removal
Nunc 4-well dishes for IVFNunc/VWR International144444COC collection during COC search and IVM culture
Nunc Invitro fertilization Petri Dish with Vented Lid, 60 mm, Non-Pyrogenic, SterileThermo Scientific/VWRNUNC150270Dish for COC search
Oocyte handling medium : Flushing Medium with heparinOrigio/CooperSurgical10765060Search medium for COC search
OvoilVitrolife10029oil for IVM culture
Penicillin/Streptomicin mixLife Technologies Europe15140-148Supplement for OTC handling medium
Scissors, curved, 150 mm long, 20 mm bladeChirurgical MaintenanceVIREBST999-SCSmall size scissors for residual medulla removal

References

  1. Practice Committee of the American Society for Reproductive Medicine. Fertility preservation in patients undergoing gonadotoxic therapy or gonadectomy: a committee opinion. Fertility and Sterility. 112 (6), 1022-1033 (2019).
  2. Anderson, R. A., et al. ESHRE guideline: female fertility preservation. Human Reproduction Open. 2020 (4), (2020).
  3. Karavani, G., et al. Chemotherapy-based gonadotoxicity risk evaluation as a predictor of reproductive outcomes in post-pubertal patients following ovarian tissue cryopreservation. BMC Women's Health. 21 (1), 201 (2021).
  4. Fiorentino, G., et al. Biomechanical forces and signals operating in the ovary during folliculogenesis and their dysregulation: implications for fertility. Human Reproduction Update. 29 (1), 1-23 (2023).
  5. Revel, A., et al. Oocyte collection during cryopreservation of the ovarian cortex. Fertility and Sterility. 79 (5), 1237-1239 (2003).
  6. Fasano, G., Moffa, F., Dechène, J., Englert, Y., Demeestere, I. Vitrification of in vitro matured oocytes collected from antral follicles at the time of ovarian tissue cryopreservation. Reproductive Biology and Endocrinology. 9, 150 (2011).
  7. Segers, I., et al. In vitro maturation (IVM) of oocytes recovered from ovariectomy specimens in the laboratory: a promising "ex vivo" method of oocyte cryopreservation resulting in the first report of an ongoing pregnancy in Europe. Journal of Assisted Reproduction and Genetics. 32 (8), 1221-1231 (2015).
  8. Guzman, L., et al. Developmental capacity of in vitro-matured human oocytes retrieved from polycystic ovary syndrome ovaries containing no follicles larger than 6 mm. Fertility and Sterility. 98 (2), e1-2 (2012).
  9. Mackens, S., et al. Outcome of in-vitro oocyte maturation in patients with PCOS: does phenotype have an impact. Human Reproduction. 35 (10), 2272-2279 (2020).
  10. Practice Committees of the American Society for Reproductive Medicine, the Society of Reproductive Biologists and Technologists, and the Society for Assisted Reproductive Technology. In vitro maturation: a committee opinion. Fertility and Sterility. 115 (2), 298-304 (2021).
  11. Prasath, E. B., et al. First pregnancy and live birth resulting from cryopreserved embryos obtained from in vitro matured oocytes after oophorectomy in an ovarian cancer patient. Human Reproduction. 29 (2), 276-278 (2014).
  12. Uzelac, P. S., Delaney, A. A., Christensen, G. L., Bohler, H. C. L., Nakajima, S. T. Live birth following in vitro maturation of oocytes retrieved from extracorporeal ovarian tissue aspiration and embryo cryopreservation for 5 years. Fertility and Sterility. 104 (5), 1258-1260 (2015).
  13. Segers, I., et al. Live births following fertility preservation using in-vitro maturation of ovarian tissue oocytes. Human Reproduction. 35 (9), 2026-2036 (2020).
  14. Delattre, S., et al. Combining fertility preservation procedures to spread the eggs across different baskets: a feasibility study. Human Reproduction. 35 (11), 2524-2536 (2020).
  15. Jadoul, P., et al. Laparoscopic ovariectomy for whole human ovary cryopreservation: technical aspects. Fertility and Sterility. 87 (4), 971-975 (2007).
  16. Vilela, J. d. M. V., Dolmans, M. M., Amorim, C. A. Ovarian tissue transportation: a systematic review. Reproductive Biomedicine Online. 42 (2), 351-365 (2021).
  17. Vanhoutte, L., Cortvrindt, R., Nogueira, D., Smitz, J. Effects of chilling on structural aspects of early preantral mouse follicles. Biology of Reproduction. 70 (4), 1041-1048 (2004).
  18. Arav, A., Zvi, R. Do chilling injury and heat stress share the same mechanism of injury in oocytes. Molecular and Cellular Endocrinology. 282 (1-2), 150-152 (2008).
  19. Nikiforov, D., et al. Improving the maturation rate of human oocytes collected ex vivo during the cryopreservation of ovarian tissue. Journal of Assisted Reproduction and Genetics. 37 (4), 891-904 (2020).
  20. Vuong, L. N., et al. Live births after oocyte in vitro maturation with a prematuration step in women with polycystic ovary syndrome. Journal of Assisted Reproduction and Genetics. 37 (2), 347-357 (2020).
  21. Kirillova, A., et al. Improved maturation competence of ovarian tissue oocytes using a biphasic in vitro maturation system for patients with gynecological malignancy: a study on sibling oocytes. Journal of Assisted Reproduction and Genetics. 38 (6), 1331-1340 (2021).
  22. Segers, I., et al. In Vitro Maturation (IVM) culture conditions: the effect of oxygen tension and medium volume. Human Reproduction. 32, 126-127 (2017).
  23. De Munck, N., Santos-Ribeiro, S., Stoop, D., Van de Velde, H., Verheyen, G. Open versus closed oocyte vitrification in an oocyte donation programme: a prospective randomized sibling oocyte study. Human Reproduction. 31 (2), 377-384 (2016).
  24. Anderson, R. A., McLaughlin, M., Wallace, W. H. B., Albertini, D. F., Telfer, E. E. The immature human ovary shows loss of abnormal follicles and increasing follicle developmental competence through childhood and adolescence. Human Reproduction. 29 (1), 97-106 (2014).
  25. Karavani, G., et al. Age-dependent in vitro maturation efficacy of human oocytes-is there an optimal age. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 9, 667682 (2021).
  26. Bourg, M., et al. Is in vitro maturation of oocytes retrieved ex vivo from ovarian tissue an effective fertility preservation technique in the presence of organic ovarian cysts. European Journal of Obstetrics and Gynecology and Reproductive Biology. 281, 87-91 (2023).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved