Maturation in vitro des ovocytes du tissu ovarien pour la préservation de la fertilité

Résumé

La maturation in vitro des ovocytes du tissu ovarien (OTO-IVM), une technique accessible au sein d’un laboratoire de procréation médicalement assistée (MAR) offrant des options supplémentaires réalistes de préservation de la fertilité aux patientes qui ont besoin d’une cryoconservation du tissu ovarien.

Résumé

La vitrification des ovocytes matures est la norme de soins pour préserver la fertilité chez les femmes à risque d’infertilité. Cependant, la cryoconservation du tissu ovarien (OTC) reste la seule option pour préserver la fertilité chez les femmes qui doivent commencer un traitement gonadotoxique en urgence ou chez les enfants prépubères. Lors de la préparation du cortex ovarien pour la cryoconservation, le tissu médullaire est retiré. Les follicules antraux en croissance résident à la limite de l’interface cortex-médullaire de l’ovaire et sont brisés au cours de ce processus, libérant leur complexe cumulus-ovocytes (COC). En inspectant minutieusement le tissu médullaire moyen et fragmenté, ces complexes cumulus-ovocytes immatures peuvent être identifiés sans interférer avec la procédure OTC. Les ovocytes immatures dérivés du tissu ovarien peuvent être mûris avec succès in vitro, créant ainsi une source supplémentaire de gamètes pour la préservation de la fertilité. Si la vente en vente libre est réalisée dans ou à proximité d’un laboratoire de procréation médicalement assistée, tous les outils nécessaires à la maturation in vitro (IVM) et à la vitrification des ovocytes peuvent être à portée de main. De plus, en cas de rémission et de souhait d’enfant, la patiente dispose de plusieurs options pour restaurer la fertilité : transplantation de tissu ovarien ou transfert d’embryons après l’insémination d’ovocytes vitrifiés/réchauffés. Par conséquent, la maturation in vitro des ovocytes du tissu ovarien (OTO-IVM) peut être une technique complémentaire précieuse de préservation de la fertilité.

Introduction

Les options de préservation de la fertilité (PF) pour les femmes prévues pour un traitement gonadotoxique, une thérapie de réassignation sexuelle ou les femmes qui ont une prédisposition génétique à l’insuffisance ovarienne prématurée dépendent de l’état de santé et de l’âge de la patiente, du calendrier disponible, du type de traitement, de la préférence du patient et des procédures de PF disponibles au centre de fertilité de votre choix. La vitrification d’ovocytes matures obtenue après stimulation ovarienne avec des gonadotrophines et prélèvement d’ovocytes dans un cycle de laboratoire de procréation médicalement assistée (PMA) est considérée comme l’option privilégiée pour les PF ^1,2. Cependant, pour les filles prépubères, les femmes chez qui le début urgent d’un traitement gonadotoxique ou d’une gonadectomie est nécessaire, ou les femmes présentant un risque élevé d’aménorrhée permanente due à un traitement gonadotoxique, un cycle de stimulation ovarienne avec des gonadotrophines n’est pas possible, et la cryoconservation du tissu ovarien (OTC), qui est une technique acceptée et valide pour la PF ^{1,2, 3}, est la seule option. L’objectif de l’OTC est de cryopréserver des milliers de follicules primordiaux dormants dans le tissu du cortex ovarien, qui peuvent reprendre leur croissance après la transplantation de tissu congelé/décongelé sur l’ovaire restant ou dans une poche péritonéale après le dépistage minutieux d’une maladie résiduelle minimale dans des fragments de tissu représentatifs.

Afin d’obtenir des fragments corticaux de 1 à 2 mm d’épaisseur adaptés à la cryoconservation, le tissu médullaire mou doit être retiré. Ce tissu médullaire implique généralement des follicules en croissance à différents stades de développement qui échappent au cortex ovarien rigide pour permettre leur croissance et leur expansion⁴. Depuis de nombreuses années, plusieurs laboratoires étudient le potentiel de ces ovocytes récupérés à partir de follicules résidant dans le tissu médullaire restant après la préparation de fragments corticaux ovariens à l’aide de la maturation in vitro (IVM)^5,6,7, appelée IVM ovocytaire du tissu ovarien (OTO-IVM). Les follicules antraux, même ceux de moins de 6 mm de diamètre, contiennent des ovocytes immatures entourés de cellules cumulus qui peuvent mûrir, féconder et devenir des bébés en bonne santé à l’aide d’un système IVM ^8,9. La MIV est considérée comme la norme de soins pour les femmes à risque de syndrome d’hyperstimulation ovarienne (SHO), telles que les patientes atteintes du syndrome des ovaires polykystiques (SOPK). Cependant, dans le domaine de la PF, il existe peu de données disponibles pour la MIV dans les cas de contre-indication à la stimulation ovarienne ; La MIV des ovocytes prélevés par voie transvaginale est toujours considérée comme innovante, et la MIV-OTO est considérée comme expérimentale ^2,10. Cela dit, les rapports sur les premières naissances vivantes après OTO-IVM^11,12,13 soulignent le potentiel de l’utilisation de l’OTO-IVM comme technique d’appoint lorsque l’OTC est nécessaire pour la PF chez les patients¹⁴.

Cette étude apporte des détails techniques pour adopter l’OTO-IVM dans le laboratoire MAR et illustre les résultats obtenus dans un seul centre.

Protocole

La présente étude sur OTO-IVM a été approuvée par le Comité d’éthique local de l’UZ-Bruxelles (addendum du projet 2008/068 et du projet 2022/303). Tous les patients ont signé un consentement éclairé écrit. Chaque patient a été évalué individuellement par un médecin spécialiste en médecine de la reproduction, une infirmière pivot et l’oncologue référent afin de rédiger le plan de traitement optimal de la PF, en tenant compte des préférences du patient¹⁴. En bref, les patients éligibles à l’OTC ont un besoin urgent de PF et ont moins de 36 ans et¹⁴ ans. Pour combiner l’OTC avec l’OTO-IVM, la chimiothérapie ou la radiothérapie ne doit pas avoir été administrée dans les 6 mois précédant l’OTC.

1. Environnement et personnel de laboratoire

1. Effectuez l’OTC dans une armoire à flux laminaire de classe A.
2. Effectuer la vente en vente libre avec deux opérateurs : l’un travaillant de manière aseptique dans l’armoire à flux laminaire, et l’autre nettoyant tous les matériaux non stériles avec un spray décontaminant bactéricide et sporicide et remettant les matériaux et les fournitures de manière aseptique au premier opérateur. Traitez le cortex ovarien sur un couvercle de glacière de paillasse (± 4 °C).
3. Effectuer la recherche du complexe cumulus-ovocytes (COC) dans une deuxième armoire à flux laminaire avec un stéréomicroscope dans un laboratoire MAR sur une platine chauffée (37 °C).
4. Effectuer la récupération du COC à partir des restes médullaires (sections 3 et 4) et lancer le processus de GIV (section 5). Ceci est fait par un troisième opérateur.

2. Préparation des supports

REMARQUE : Cinq types de supports sont utilisés pour cette procédure (détaillés ci-dessous) : le support de manipulation OTC, le support de congélation OTC, le support de recherche, le support LAG et le support IVM. Lors de la préparation du fluide, travaillez de manière aseptique dans l’armoire d’écoulement, comme indiqué dans la section 1. Utilisez des réactifs neufs et non ouverts pour chaque procédure et maintenez la stérilité de tous les produits jetables utilisés pour vérifier la stérilité des milieux produits.

1. Fluide de manutention OTC
   1. Complétez le milieu L15 de Leibovitz avec 4 mg/mL d’albumine sérique humaine (HSA), 100 U/mL de pénicilline et 100 μg/mL de streptomycine (voir le tableau des matières).
   2. Conservez le fluide de manipulation OTC au réfrigérateur jusqu’à son utilisation (pendant un maximum de 2 jours).
      REMARQUE : Utilisez un produit de manipulation en vente libre pour rincer et traiter le tissu ovarien et utilisez-le à froid (0-4 °C).
2. Fluide de congélation en vente libre
   1. Complétez le milieu L15 de Leibovitz avec 1,5 M de diméthylsulfoxyde (DMSO) et 4 mg/mL de HSA.
   2. Conservez le fluide de congélation OTC au réfrigérateur jusqu’à son utilisation (pendant 2 jours maximum).
3. Média de recherche
   REMARQUE : Le milieu Search (un milieu tamponné à HEPES pour la manipulation des ovocytes) est disponible dans le commerce (voir le tableau des matériaux) et prêt à l’emploi. Utilisez le milieu de recherche pour rincer le filtre et recueillir le COC tout en recherchant des COC entre les fragments de moelle (section 4).
   1. Remplissez six tubes stériles à fond rond de 14 ml avec 6 ml de milieu de recherche.
   2. Préparez un plat à 4 puits avec 500 μL de milieu de recherche recouvert de 350 μL d’huile (voir le tableau des matériaux).
   3. Chauffez les tubes et la boîte à 4 puits à 37 °C pendant au moins 1 h avant l’arrivée du tissu ovarien. Les milieux tamponnés HEPES ne nécessitent pas d’incubation de CO₂ .
4. GAL moyen
   REMARQUE : Le système IVM disponible dans le commerce (voir le tableau des matériaux) comprend deux supports différents : le support LAG et le support IVM, qui doivent être complétés comme détaillé ci-dessous. Le milieu LAG est utilisé pour rincer les COC, mais peut également être utilisé pendant une période d’incubation de 2 à 3 heures précédant la MIV dans le milieu de MIV, comme suggéré par l’insert du système de GIV.
   1. Utilisez le support LAG prêt à l’emploi disponible dans le commerce (voir le tableau des matériaux).
5. IVM moyenne
   1. Compléter le milieu de MIV disponible dans le commerce avec 10 mg/mL de HSA, 75 mUI/mL d’hormone folliculostimulante (FSH) et 100 mUI/mL de gonadotrophine chorionique humaine (hCG).
   2. Préparez une boîte de culture à 4 puits avec un puits de milieu LAG et trois puits de milieu IVM complété : 500 μL de milieu recouvert de 350 μL de rechargement d’huile.
   3. Équilibrez la parabole pendant la nuit dans un incubateur à 37 °C avec 6 % de CO₂ et 20 % d’O₂, l’environnement optimal pour la culture IVM.

3. Préparation du cortex ovarien

REMARQUE : L’ablation laparoscopique de l’ovaire entier a été effectuée comme décrit par Jadoul et ^al.15.

1. À l’arrivée de l’ovaire au laboratoire, lavez l’ovaire dans le milieu de manipulation en vente libre (étape 2.1) deux fois en transférant l’ovaire dans une boîte de Pétri de 100 mm avec le milieu de manipulation en vente libre.
2. À l’aide d’un scalpel, ouvrez l’ovaire en deux dans le sens longitudinal (Figure 1A).
3. Faites plusieurs incisions dans le tissu médullaire à la fois verticalement et horizontalement avec un scalpel frais. Évitez d’endommager le cortex. Percez doucement les follicules antraux fermes de différentes tailles dans la moelle avec le scalpel pour libérer le liquide folliculaire dans le milieu de manipulation en vente libre.
4. Épluchez le tissu mou de la moelle épinière à l’aide de ciseaux chirurgicaux (Figure 1B). Cette procédure peut prendre plusieurs minutes.
5. Mettez la coquille ovarienne dans un nouveau plat avec du produit de manipulation frais en vente libre pendant le processus de coupe.
6. Transférez la boîte contenant les fragments médullaires et le liquide folliculaire libéré (figure 1C) dans la deuxième armoire d’écoulement pour commencer la recherche de COC.
7. Répétez les étapes 3.4 à 3.6 jusqu’à ce que l’épaisseur souhaitée (1-2 mm) du tissu cortex soit obtenue.
8. Coupez le cortex en morceaux d’environ 8 mm x 5 mm.
9. Incuber les morceaux 3 fois de suite pendant 10 minutes dans environ 25 ml de produit de congélation en vente libre (étape 2.2) dans des boîtes de Pétri de 100 mm.
10. Placer un morceau dans 800 μL de fluide de congélation en vente libre dans un cryoflacon.
11. Cryoconserver le tissu ovarien à l’aide d’un protocole de congélation lente dans une chambre cryogénique contrôlée par un régulateur de température (voir Tableau des matériaux) : de 4 °C à -7 °C à -2 °C/min, semis manuel à -7 °C, de -7°C à -40 °C à -0,3 °C/min, de -40 °C à -100 °C à -10 °C/min, et à -100 °C, plongez les cryoflacons dans de l’azote liquide et stockez-les.

4. Recherchez des COC

1. Préparez l’armoire à flux laminaire pour la recherche de COC.
   1. Boîtes de culture chaudes de 60 mm sur la platine chauffée sous le stéréomicroscope dans l’armoire à flux laminaire.
   2. Placez les tubes de 14 mL avec 6 mL de milieu de recherche préchauffé (étape 2.3.1) dans un bloc chauffé, et la boîte préchauffée à 4 puits avec le milieu de recherche sur la platine chauffée sous le microscope dans l’armoire à flux laminaire.
   3. Placez un filtre stérile (passoire à cellules, maille de 70 μm ; voir tableau des matériaux) de bas en bas dans une boîte de culture.
   4. Prenez un capillaire en verre de 290-310 μm pour l’utilisation : n’utilisez pas de capillaires plus petits que 290-310 μm, afin d’éviter d’endommager la connectivité ovocyte-cumulus.
   5. Assurez-vous d’avoir des pointes de filtre de 1 ml et une pipette de 1 ml.
2. Prenez la première parabole avec des fragments médullaires de l’armoire à flux laminaire OTC (4 °C) et placez la parabole sur la platine chauffée (37 °C) dans l’armoire à flux laminaire IVM dès que possible.
   REMARQUE : Le premier plat de fragments médullaires et de liquide folliculaire peut être contaminé par du sang provenant de follicules ovulés remplis de sang ou du système vasculaire de l’ovaire lui-même. Les globules rouges brouillent la vision claire et compliquent la recherche de COC. Le milieu contaminé doit être retiré pour éliminer les globules rouges (voir étape 4.3).
3. Éliminez la contamination des cellules sanguines en suivant les étapes ci-dessous.
   1. Pipeter 2 mL de média Search sur la membrane filtrante (crépine cellulaire de 70 μm) pour mouiller la membrane et mettre la parabole, qui a capturé le fluide, de côté sur la platine chauffée.
   2. Retournez le filtre et placez-le avec la poignée contre le bord d’une nouvelle boîte de culture, en créant une pente avec le bas du filtre.
   3. Prélever un milieu contaminé par le sang entre les fragments médullaires à l’aide d’une pointe de 1 mL et le souffler doucement sur la membrane filtrante (figure 1D) pour capturer les COC présents dans le milieu contaminé.
   4. Répétez l’étape 4.3.3 jusqu’à ce que la majeure partie du milieu contaminé par le sang soit retirée.
   5. Versez immédiatement du milieu de recherche frais sur les fragments médullaires pour maintenir le COC en suspension dans le milieu de culture à tout moment.
   6. Rincez doucement la membrane filtrante inclinée avec 2 ml de milieu Search pour rincer les globules rouges sur la membrane filtrante.
   7. Placez le filtre de bas en bas dans une nouvelle parabole et versez 3 à 4 ml de média de recherche dans le filtre pour expulser le COC de la membrane filtrante dans le milieu qui remplit la parabole. Retirez le filtre. Pour éviter que la membrane filtrante ne se dessèche (et que d’éventuels COC n’en soient pas encore expulsés), plongez le filtre de bas en bas dans la première parabole, qui a été utilisée pour mouiller le filtre pour la première fois.
   8. Examinez immédiatement le milieu expulsé à la recherche de COC par inspection visuelle au microscope stéréoscopique avec un grossissement de 10x à 50x. Recherchez des ovocytes translucides clairs avec un bord de cumulus sombres et compacts (Figure 1E). Faites tourner le milieu dans le plat et examinez à nouveau le milieu.
   9. Rincez le filtre une deuxième fois dans une nouvelle coupelle et examinez le milieu expulsé à la recherche de COC.
   10. Examinez le milieu dans la boîte où le filtre est immergé pour les COC restants.
   11. Transférez les COC avec un capillaire en verre dans la boîte à 4 puits contenant le milieu de recherche (Figure 1E). Gardez la vaisselle sur la scène chauffée en tout temps.
4. Recherchez des COC entre les fragments médullaires après avoir retiré les cellules sanguines contaminantes de la boîte avec des fragments médullaires et rempli la boîte avec un milieu de recherche transparent. Utilisez le capillaire de verre pour vous déplacer autour des fragments médullaires et faites tourner le milieu dans le plat afin de trouver des COC. Séparer les gros fragments médullaires à l’aide d’aiguilles à tuberculine à l’aide d’une seringue de 1 mL si la présence d’un ovocyte est suspectée.
5. Rassemblez tous les COC intacts dans la parabole à 4 puits avec le support de recherche.
   REMARQUE : Dans une procédure OTC typique, le tissu cortex est réduit de la moelle à l’aide de trois boîtes consécutives de 100 mm, où la coquille ovarienne est déplacée vers une nouvelle boîte avec un milieu frais et où les restes sont transférés dans le flux IVM pour la recherche de COC. Habituellement, seule la première boîte nécessite l’ablation de cellules sanguines ; dans les deuxième et troisième plats, moins de fragments médullaires sont présents, et la recherche COC est effectuée directement entre les fragments et dans le milieu.

5. IVM des COC

1. Rincez les COC dans un puits propre avec le média de recherche.
2. Déplacez la boîte de culture IVM pré-équilibrée (la boîte à 4 puits qui contient un puits de milieu LAG et trois puits de milieu IVM) de l’incubateur à l’étage chauffé dans l’armoire de flux IVM.
3. Étiquetez la boîte de culture IVM contenant des COC avec les informations sur le patient.
4. Rincez les COC dans un milieu LAG (2-3 s) et placez-les dans l’un des trois puits avec un milieu IVM supplémenté. Cultivez les COC en groupes d’environ 10 COC par puits. Omettre les ovocytes nus - ovocytes dépourvus de cellules cumulus attachées - de la culture, car ils sont connus pour avoir un potentiel de développement gravement compromis.
5. Placez le plat dans un incubateur à 37 °C, 6 % CO₂ et 20 % O₂ pendant 30 h.

6. Manipulation des ovocytes matures

1. Dépouillez les ovocytes de leurs cellules cumulus environnantes par une brève exposition à 80 UI d’hyaluronidase (voir le tableau des matériaux) et un pipetage mécanique doux après 30 h d’IVM.
2. Identifier les ovocytes matures par l’extrusion du premier corps polaire.
3. Vitrifier ou inséminer les ovocytes matures, selon la préférence de la patiente.
   REMARQUE : Si le contrôle de maturation après 30 h d’IVM tombe en dehors des heures de travail acceptables, la durée de l’IVM peut être raccourcie à 28 h ou prolongée jusqu’à 42 h. Si seulement quelques ovocytes matures sont obtenus après 30 h, les ovocytes immatures peuvent être cultivés en plus pendant la nuit dans le puits IVM d’origine, dépourvu de cellules cumulus, et utilisés le lendemain matin pour la vitrification ou l’injection intracytoplasmique de spermatozoïdes (ICSI) à maturité.

Résultats

Au cours de la dernière décennie, 98 patientes subissant une ovariectomie ou une biopsie ovarienne en vente libre se sont également vu proposer l’OTO-IVM. Les résultats présentés ici sont une mise à jour du programme clinique tel que publié avant le ^7,13. Les ovocytes immatures obtenus lors du traitement du tissu ovarien ont été mûris in vitro principalement pendant 30 h. Cependant, un temps de maturation pl...

Discussion

La priorité de la procédure de PF est toujours de manipuler et de congeler le cortex ovarien selon le protocole opératoire standard qui a été validé en clinique. Un inconvénient de la PF est l’absence d’un protocole standard disponible dans la littérature publiée concernant l’OTC et l’OTO-IVM. Il est difficile d’évaluer l’efficacité et la validité des techniques et des adaptations car il y a un grand écart de temps entre la congélation/vitrification et la décon...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
1000 µL filter tips	Eppendorf/VWR International	613-6780	COC search
Benchtop Cooler	Fisher Scientific	15-350-54	Benchtop Cooler lid is used to prepare the tissue, Benchtop Cooler tube holder to keep cryovials with freezing medium cooled
Corning Cell culture dish, non-treated, 100 mm	Corning/VWR International	430591	Dish for ovarian tissue preparation
CryoSure-DMSO	WAK Chemicals	0482	Cryoprotectant for ovarian tissue cryopreservation
Cumulase	Origio/CooperSurgical	16125000A	recombinant human hyaluronidase enzyme for cumulus cell removal after IVM
Decontamination spray: Suprox	Medipure LTD	MP016	Desinfectant solution for aseptic handling with bactericide and sporicide action
Disposable scalpels	Swann-Morton	0511	Ovarian tissue preparation
Falcon 14 mL Round Bottom Polystyrene Test Tube, with Snap Cap, Sterile	Falcon/VWR International	BDAA352057	Medium container
Falcon Cell strainer 70 µm	Falcon/VWR International	352350	Filter for elimination of red blood cell contamination and COC search
Freeze control Ampoule Cryochamber and Temperature Controller	Cryologic	CL-8800i   CC60AS	Slow freezing machine
FSH: Menopur 75 IU	Ferring	BE197504	Follicle Stimulating Hormone : Supplement for IVM medium
Handling pipette 290-310 µm	Vitrolife	15538	COC search: gentle transfer of COC without damaging oocyte-cumulus cell connectivity
hCG: Brevactid 5000 IE	Ferring	5008001036	Human Chorionic Gonadotropin : Supplement for IVM medium
High security tube	CryoBioSystem	022252	cryovial, heat-sealed for safe cryostorage
HSA-solution	Vitrolife	10064	Human serum Albumin: supplement for IVM medium
Leibovitz's L-15 medium	Life Technologies Europe	31415-029	Handling medium for ovarian tissue preparation
MediCult IVM system	Origio/CooperSurgical	82214010	medium for IVM containing both LAG and IVM medium. IVM medium needs to be supplemented as detailed in the protocol
METZENBAUM fino scissors 140 mm	Chirurgical Maintenance	VIZ08280314	Medium size scissors for initial medulla removal
Nunc 4-well dishes for IVF	Nunc/VWR International	144444	COC collection during COC search and IVM culture
Nunc Invitro fertilization Petri Dish with Vented Lid, 60 mm, Non-Pyrogenic, Sterile	Thermo Scientific/VWR	NUNC150270	Dish for COC search
Oocyte handling medium : Flushing Medium with heparin	Origio/CooperSurgical	10765060	Search medium for COC search
Ovoil	Vitrolife	10029	oil for IVM culture
Penicillin/Streptomicin mix	Life Technologies Europe	15140-148	Supplement for OTC handling medium
Scissors, curved, 150 mm long, 20 mm blade	Chirurgical Maintenance	VIREBST999-SC	Small size scissors for residual medulla removal