التعديل العصبي بالموجات فوق الصوتية المركزة في وقت واحد وتسجيل القياس الضوئي للألياف في الماوس الحر الحركة

Summary

يتضمن البروتوكول تصنيع محول الطاقة ، والإبلاغ عن المعلمات ، والإجراءات الجراحية ، وتسجيل الإشارات لسير العمل التشغيلي الكامل للتعديل العصبي بالموجات فوق الصوتية المركزة المتزامنة وتسجيل القياس الضوئي للألياف في الفئران حرة الحركة.

Abstract

يمثل التعديل العصبي بالموجات فوق الصوتية المركزة (FUN) نهجا واعدا للاضطراب غير الجراحي للدوائر العصبية في مناطق الدماغ العميقة. وهو متوافق مع معظم الطرائق الحالية لمراقبة وظائف الدماغ في الجسم الحي. لا يمكننا التكامل مع طرق تسجيل وظائف الدماغ من معالجة أوامر واضطرابات وظائف الدماغ المحددة من خلال ردود الفعل ذات الحلقة المغلقة فحسب ، بل يوفر لنا أيضا رؤى ميكانيكية حول FUN نفسها. هنا ، نقدم بروتوكولا معدلا وبسيطا ويمكن الاعتماد عليه وقويا للتطبيق المتزامن لتسجيل مضان FUN وقياس الألياف الضوئية GCaMP6s في الفئران حرة الحركة. يتضمن ذلك تصنيع محول طاقة واحد جيد الحجم ووضعه مؤقتا على الفئران ، إلى جانب التثبيت الآمن لزرع الألياف الضوئية لتسهيل المرور السلس للمحول. يوفر الجمع بين FUN والقياس الضوئي للألياف التسجيل البصري لاستجابات الدوائر العصبية عند FUN في الوقت الفعلي في مناطق الدماغ العميقة. لإثبات كفاءة هذا البروتوكول ، تم استخدام الفئران Thy1-GCaMP6s كمثال لتسجيل النشاط العصبي في النواة المهادية الأمامية أثناء FUN أثناء تحرك الفئران بحرية. نعتقد أن هذا البروتوكول يمكن أن يعزز الاستخدام الواسع النطاق ل FUN في كل من مجال علم الأعصاب ومجال الموجات فوق الصوتية الطبية الحيوية.

Introduction

برز التعديل العصبي بالموجات فوق الصوتية المركزة (FUN) كأداة تعديل عصبي واعدة ومتعددة الاستخدامات ، مما يتيح استكشاف وظائف الدماغ وتنظيمه بإمكانات كبيرة¹. FUN قادر على توصيل الطاقة الصوتية بشكل غير جراحي إلى أي موضع داخل أنسجة المخ بدقة^{متناهية 2}. إن قدرته على تعديل النشاط العصبي بشكل عابر وعكسي في بنية الدماغ العميقة ، مع خصوصية زمانية مكانية عالية ، بطريقة آمنة وغير جراحية ، تمثل سمة جذابة تكمل تقنية التعديل العصبي السريرية الحالية³. تم تأكيد إظهار FUN الفعال في كل من الأشخاص^4،5،6 وفي نماذج حيوانية مختلفة ، تشمل^{الأنواع الصغيرة 7،8،9،10} والأنواع الكبيرة^{11،12،13،14،15،16،17}.

من خلال مراقبة تأثير FUN على أنواع عصبية محددة من خلال مراقبة النشاط العصبي أثناء FUN ، يمكننا الخوض في الآلية الكامنة وراء هذه العملية^18,19. أصبح القياس الضوئي للألياف القائم على مؤشرات الكالسيوم المشفرة وراثيا (GECIs) مستخدما على نطاق واسع في العقد الماضي كطريقة متعددة الاستخدامات لتتبع النشاط السكاني الخاص بنوع الخلية في الجسم الحي^{20،21،22،23،24}. وبالتالي ، فإن التطبيق المتزامن ل FUN والقياس الضوئي للألياف يمكن أن يثري بشكل كبير فهمنا الشامل ل FUN. ومع ذلك ، فإن استخدام محولات الطاقة المفردة الضخمة يستلزم التثبيت بإطار ، بينما تحتاج إلى الخضوع للتخدير وتجميدها في إطار مجسم^{7،19،25،26}. قد لا يكون هذا النهج مناسبا لأنواع معينة من التجارب المتعلقة بالإدراك والإدراك وتقييم السلوك. من الأهمية بمكان إنشاء بروتوكول يسهل دمج FUN والقياس الضوئي للألياف دون إعاقة تعبئة الفئران⁷.

في هذه الدراسة ، نقدم بروتوكولا منقحا مستخدما في دراساتنا السابقة لاستكمال طريقة صياغة محول طاقة واحد بسلاسة ورشاقة وتثبيته المؤقت على الفئران ، بالإضافة إلى التثبيت الآمن لزرع الألياف الضوئية لتسهيل المرور السلس لمحول الطاقة^7،19،26. يسمح للباحثين بتسجيل النشاط العصبي المعدل بواسطة الموجات فوق الصوتية في الفئران غير المقيدة. اخترنا مظروفا أكثر سلاسة ، مثل المغلف الجيبي ، لتقليل الارتباك السمعي²⁷. يتم تأكيد جدوى هذا البروتوكول من خلال التسجيل المتزامن للنشاط العصبي في النواة المهادية الأمامية للفئران حرة الحركة أثناء FUN. يوضح أن طاقة محول الطاقة كافية لتحقيق التعديل العصبي ، ويمكن أن تضمن طرق التثبيت لزرع الألياف الضوئية ومحول الطاقة استقرارها.

Protocol

امتثلت جميع الإجراءات والتعامل مع لإرشادات أخلاقيات NSFC ومتطلبات البروتوكول المعتمدة للجنة رعاية واستخدام المؤسسية التابعة لمعهد قوانغدونغ لعلوم وتكنولوجيا الذكاء.

1. إعداد محول الطاقة

1. قم بإعداد لوحة كهرضغطية بقطر داخلي 3 مم ، وقطر خارجي 7 مم ، وتردد مركزي 500 كيلو هرتز.
   ملاحظة: يمكن تعديل القطر الخارجي بناء على منطقة الدماغ المحددة المستهدفة ويجب تعظيمه مع الحفاظ على دقة التحفيز ودون تجاوز حدود جمجمة الفأر.
2. قم بتوصيل السلك بجانبي اللوحة الكهرضغطية باستخدام معجون الفضة الإيبوكسي (الشكل 1). بعد أن تصلب عجينة الفضة الإيبوكسي ، استخدم مقياسا متعددا لقياس المقاومة عند طرفي السلك للتأكد من أنها 0 تقريبا.
3. ضع طبقة من الشريط على الوجهين على سطح زجاجي نظيف. التمسك بلوحة كهرضغطية وحلقة نحاسية ، بارتفاع 8 مم ، وقطر خارجي 8 مم ، وقطر داخلي 7.6 مم ، بإحكام على الصفيحة الزجاجية.
   ملاحظة: يتم تحديد القطر الداخلي للحلقة النحاسية حسب حجم اللوحة الكهرضغطية لضمان تغطية اللوحة بالحلقة النحاسية.
4. أدخل أنبوب البولي بروبلين بقطر خارجي 3 مم بإحكام في وسط اللوحة الكهرضغطية وألصقه بقوة بالصفيحة الزجاجية (الشكل 1).
5. تحضير كمية مناسبة من الغراء راتنجات الايبوكسي وتفريغها. استخرج الإيبوكسي باستخدام حقنة يمكن التخلص منها وحقنها ببطء في الحلقة النحاسية. انتظر حوالي 10 ساعات حتى يتجمد الإيبوكسي (الشكل 1).
6. قم بلحام الأطراف السائبة لسلكين على موصل صامولة الحربة باستخدام مكواة لحام إلكترونية. قم بإزالة الصفيحة الزجاجية. نظف سطح محول الطاقة بالكحول (الشكل 1).

2. معلمات الإبلاغ عن FUN

1. ضع الهيدروفون ومحول الطاقة في خزان مياه مملوء بالماء منزوع الأيونات (الشكل 2 أ). تأكد من محاذاة الحزمة المركزية (المحور Z) لنظام تحديد المواقع مع محور محول الطاقة. يمكن تحقيق هذه المحاذاة أولا ، اكتشاف الحد الأقصى للمجال في المستوى البؤري من خلال المسح الضوئي 2D. ثانيا ، تحديد الحد الأقصى للحقل في مستوى آخر بحد أقصى واضح ؛ ثالثا ، مقارنة إحداثيات X و Y للعظمتين العظميين ثم ضبط موضع و / أو اتجاه محول الطاقة بشكل متكرر إذا لزم الأمر²⁸.
2. اضبط طرف السماعة المائية مع سطح محول الطاقة على مسافة 1 مم ، مع الحفاظ على هذه المسافة ثابتة أثناء وضع السماعة المائية في منتصف الحافة اليمنى للمحول. ابدأ برنامج المسح لالتقاط المجال الصوتي الحر في مستوى XZ (الشكل 2B).
   ملاحظة: يمكن العثور على طريقة بناء الهيدروفون في https://github.com/HQArrayLab/Hydrophone_system_control.
3. حرك الهيدروفون على طول المحور Z لتحديد الأعماق المرتبطة بضغط الذروة المكاني. في هذه التجربة ، يظهر ضغط الذروة المكاني على مسافة 3.4 مم من سطح محول الطاقة. حافظ على هذه المسافة عند تحريك الهيدروفون إلى الزاوية اليمنى السفلية من محول الطاقة عند المستوى XY. قم بتشغيل وبدء برنامج المسح لالتقاط المجال الصوتي الحر في مستوى XY (الشكل 2B).
4. ضع الترجام على جمجمة الفأر الذي خضع لعملية جراحية كما هو موضح في الخطوة 4. الحصول على المجال الصوتي عبر الجمجمة على مستوى XZ ومستوى XY (الشكل 2D) من خلال المسح المائي كما هو موضح في 2.1-2.3.
5. اقرأ سعة الضغط عند النقطة البؤرية ، وهي منطقة الذروة المكانية في المجال الصوتي الحر والمجال الصوتي عبر الجمجمة. سعة الضغط عند النقطة البؤرية في المجال الصوتي الحر هي 730 كيلو باسكال ، وفي المجال الصوتي عبر الجمجمة هي 580 كيلو باسكال. اقرأ الأبعاد البؤرية عند -3 ديسيبل (الشكل 2C ، E) ، والموضع على مستويات XY و XZ داخل المجال الصوتي عبر الجمجمة لتقييم ما إذا كان المجال الصوتي لهذا محول الطاقة يمكن أن يغطي مناطق الدماغ المستهدفة.
6. احسب المؤشر الميكانيكي (MI) ، المقيد بوثيقة إرشادات إدارة الغذاء والدواء ليكون أقل من 1.9 من أجل التخفيف من التجويف. يتم إعطاء حساب MI بواسطة المعادلة:
   (1)
   حيث يمثل p_{r ، .3} ضغط الذروة في MPa المعدل بواسطة معامل توهين 0.3 ديسيبل ^cm-1 MHz-1 ، و f₀ هو تردد التشغيل بالميجاهرتز. يبلغ ضغط التخلخل الأقصى عبر المجال الجمجمة 580 كيلو باسكال ، و 3.4 مم من محول الطاقة ، و f₀ هو 500 كيلو هرتز ، وبالتالي فإن p_{r ، .3} هو 576.6 كيلو باسكال. MI هو 0.82.
7. احسب متوسط شدة النبض الذروة المكانية (I_sppa) ، والذي يجب أن يكون أقل من 190 واط / سم² في اتجاه المستوى وفقا لوثيقة إرشادات إدارة الغذاء والدواء. يتم إعطاء حساب الشدة بواسطة المعادلة:
   (2)
   حيث p_sp (t) هو الضغط الصوتي المتغير زمنيا في موقع الذروة المكانية ، Z هي المعاوقة الصوتية المميزة للوسط (حوالي 1.5 × 10⁶ رايلز للأنسجة الرخوة) ، و PD هي مدة النبض. في حالة المغلف المربع ، يتم تقليل هذا إلى المعادلة:
   (3)
   حيث A هي سعة ضغط الذروة المكانية. A المقاس في الموقع المركز بالموجات فوق الصوتية هو 580 كيلو باسكال ، و Z للدماغ حوالي 1.58 × 10⁶ رايلز ، وبالتالي فإن I_sppa للغلاف المربع هو 10.65 واط / سم² و I_sppa للغلاف الجيبي هو 10.65 واط / سم².
8. احسب متوسط شدة متوسط وقت الذروة المكانية (I_spta) ، والذي تقيده وثيقة إرشادات إدارة الغذاء والدواء ليكون أقل من 430 ميجاوات / سم² في اتجاه المستوى. يتم إعطاء حساب الشدة بواسطة المعادلة:
   (4)
   حيث T هي الفترة الزمنية التي يتم خلالها حساب المتوسط. في حالة المغلف المربع ، يتم تقليل هذا إلى المعادلة:
   (5)
   حيث_{قطار نبض} التيار المستمر هو دورة عمل النبض. هنا ، قطار نبض التيار المستمر هو 1٪ لأنه تم استخدام الموجات المستمرة ، وبالتالي فإن I_spta يساوي متوسط شدة النبضة ذات الذروة المكانية ، 106.5 mW / cm² للغلاف المربع. يمكن حساب MI و I_sppa و I_spta باستخدام البرنامج (الشكل 3A). يمكن العثور على رمز قائم على MATLAB لسهولة الاستخدام على https://github.com/HQArrayLab/Ultrasound_Parameter_Caculation.
9. أبلغ عن معلمات توقيت النبض ، بما في ذلك_{الحد الأقصى} ، ومدة النبض ، وفترة تكرار النبض ، ومدة قطار النبض ، والمظروف (الشكل 3 ب).

3. إعداد للجراحة

1. تزن ذكور الفئران المعدلة وراثيا GCaMP6s البالغة من العمر 8 أسابيع ، ويبلغ وزنها التقريبي حوالي 20 جم. تحضير محلول يحتوي على الكيتامين عند 10 ملغ/مل والزيلازين عند 2 ملغ/مل في محلول ملحي معقم. يتم تطبيق محلول الكيتامين/الزيلازين عن طريق الحقن داخل الصفاق بجرعة 100 ملغ/ كغ من الكيتامين و20 ملغ/كغ من الزيلازين باستخدام إبرة 26 غرام وحقنة سعة 1 مل يمكن التخلص منها. ابدأ التحضير الجراحي بمجرد أن لا يستجيب للمنبهات المؤلمة ، مثل قرصة إصبع القدم.
2. استخدم الخافت لقص الشعر على رأس وتطهير المنطقة بنسبة 70٪ من الإيثانول والبوفيدون اليود قبل العملية الجراحية.
3. ضع الماوس في وضع الانبطاح على الإطار التجسيمي وتأكد من أن الجمجمة مستوية. ضع مرهما واقيا للعين على عيون للحفاظ على الرطوبة.

4. الإجراء الجراحي

1. قم بعمل شق على طول الخيط السهمي ، بدءا من العظم القذالي إلى بداية عظم الأنف. استخدم المقص الجراحي لإزالة الجلد الذي يغطي نصفي الكرة الأرضية.
2. استخدم محلول ملحي معقم لتنظيف الجمجمة والقضاء على أي سمحاق متبقي.
3. ضع 3٪ بيروكسيد الهيدروجين على الجمجمة المكشوفة باستخدام قطعة قطن لمدة 2 ثانية -3 ثانية تقريبا لإنشاء مسام دقيقة. اشطفها بمحلول ملحي معقم جيدا وتأكد من جفاف المنطقة تماما.
4. قم بإنشاء حج القحف بفتحة لدغ قطرها 0.6 مم باستخدام مثقاب معقم ومعقم فوق موقع منطقة الدماغ كما هو محدد بواسطة الأطلس التجسيمي المحاذي لبريغما ولامدا. اغسل أي حطام بمحلول ملحي معقم وتأكد من التجفيف الشامل. احرص على عدم إتلاف أي أنسجة.
5. أدخل حلقة الألياف الضوئية (الغرسة) في حامل المسبار وقم بتوصيلها بالذراع المجسمة.
6. قم بمحاذاة الغرسة مباشرة فوق المنطقة محل الاهتمام باستخدام الذراع المجسم. عند إدخال الألياف الضوئية في أنسجة المخ ، قم بدفع الألياف ببطء بمعدل 2 مم / دقيقة تقريبا.
7. امزج الأسمنت السني لتحقيق اللزوجة التي تسمح بالتطبيق السهل عبر الجمجمة. استخدم عود أسنان معقم لنشر طبقة رقيقة من الأسمنت السني فوق الجمجمة وعلى الجزء السفلي من الغرسة. اتركه حتى يجف تماما.
8. افصل حامل المسبار بعناية. قم بإعداد أنبوب بولي بروبلين بارتفاع 3 مم وقطر خارجي 3 مم وقطر داخلي 2.6 مم ، ثم قم بقص الأنبوب طوال طوله.
9. قم بتوصيل الأنبوب بأسفل الغرسة باستخدام الملقط. صب مسحوق الأسمنت السني في الأنبوب لضمان طول كاف فوق الغرسة لتسجيل إشارة الألياف الضوئية. أضف السائل المطلوب واترك بضع دقائق حتى يتجمد الأسمنت السني.
10. حدد موقع فتحة الأنبوب وقم بتثبيته بعناية لإزالة الأنبوب باستخدام الملقط. قم بإعداد خليط الأسمنت السني للتطبيق ، مما يضمن انتشار طبقة متساوية ورقيقة عبر الجمجمة. قم بتغطية أكبر مساحة ممكنة على الجمجمة بأسمنت الأسنان. انتظر بضع دقائق حتى يتجمد الأسمنت السني.
    ملاحظة: لا تدع الأسمنت السني يتلامس مع جلد الماوس.
11. قم بحفر ثلاثة ثقوب (قطر 1 مم) في الحلقة المطبوعة ثلاثية الأبعاد ، مقسمة بالتساوي في الأفق ، بارتفاع 7 مم ، وقطر خارجي 10 مم ، وقطر داخلي 8.4 مم. ثبت البراغي (بطول 1 مم) في الثقوب الخاصة بها.
12. أدخل الجزء العلوي من الغرسة في فتحة محول الطاقة المصنع مسبقا. تأكد من أن الجدار الداخلي للحلقة المطبوعة 3D سلس ، ثم ضعه حول محول الطاقة الموجود على جمجمة الماوس. تأكد من توسيط محول الطاقة داخل الحلقة.
13. ضع أسمنت الأسنان على التقاطع بين الحلقة والجمجمة ، ثم انتظر بضع دقائق حتى يتجمد الأسمنت السني. تجنب وضع الأسمنت السني على الوصلة بين الترجام والجمجمة.
14. قم بإزالة محول الطاقة بعناية وشد البراغي بإحكام. انقل الماوس إلى قفص دافئ وتأكد من مراقبته حتى يتعافى تماما قبل إعادته إلى قفصه الأصلي.
15. بعد الجراحة، يتم تطبيق كاربروفين تحت الجلد (2 ملغ/كغ) للتسكن ويستمر كل 24 ساعة لمدة 3 أيام للتحكم في الالتهاب والألم. راقب يوميا بحثا عن أي علامات للضيق أو فقدان غير طبيعي للوزن أو ألم أو عدوى. عادة ، بحلول اليوم 3^بعد الجراحة ، يجب أن تظهر جميع الفئران سلوكا طبيعيا. إذا لوحظت أي علامات على الضيق أو المرض في الفأر^{بعد اليوم 3} ، فاتبع الإرشادات المؤسسية للقتل الرحيم.

5. التحفيز وتسجيل الإشارة

1. في 7 أيام بعد الجراحة ، قم بتشغيل مصدر الأكسجين إلى آلة التخدير بالغاز واضبط منظم تدفق الأكسجين لضبط تدفق الغاز على 300-500 مل / دقيقة.
2. ضع الماوس في غرفة الحث وأغلق توصيل غاز التخدير إلى القناع. قم بتدوير قرص المرذاذ لضبط تركيز التخدير المناسب (2٪ - 2.5٪).
3. بعد تخدير الماوس ، ضعه على الإطار التجسيمي باستخدام قناع مخدر. أغلق خط الحث للسماح بتدفق غاز التخدير إلى قناع التخدير. ضبط تركيز مخدر الصيانة المناسب (1٪ -1.5٪).
4. قم بتنظيف السطح العلوي للزرع بالكحول ، ثم أدخل سلك تصحيح الألياف البصرية في وسط محول الطاقة المحضر.
5. حقن الماء في الفراغ بين الغرسة والحلقة المطبوعة 3D باستخدام إبرة 26G وحقنة 1 مل يمكن التخلص منها لترطيب الجمجمة. استخدم مناشف ورقية لامتصاص الماء الزائد.
6. حقن عامل اقتران في الفراغ بين الغرسة والحلقة المطبوعة 3D باستخدام إبرة 26G وحقنة 1 مل يمكن التخلص منها لتسهيل انتشار الموجات فوق الصوتية بسهولة من محول الطاقة إلى الدماغ.
7. قم بتوصيل الغرسة بسلك تصحيح الألياف البصرية. أدخل محول الطاقة بعناية في المنطقة المملوءة بعامل اقتران وشد البراغي بإحكام.
8. ضع الماوس في حقل مفتوح واتركه يستيقظ. قم بتوصيل محول الطاقة بنظام الإثارة بالموجات فوق الصوتية وقم بتوصيل سلك تصحيح الألياف الضوئية بنظام تسجيل الألياف الضوئية ، مما يتيح حرية حركة الماوس.
   ملاحظة: يبلغ طول سلك تصحيح الألياف الضوئية 2 متر وقطره 1.25 مم. شدة الضوء لقناة 405 هي 20 μW ، وللقناة 470 هي 40 μW.
9. قم بتنشيط كل من جهاز الإثارة بالموجات فوق الصوتية ونظام تسجيل الألياف الضوئية من أجل مزامنة التعديل العصبي بالموجات فوق الصوتية مع تسجيل إشارة الألياف الضوئية.

النتائج

يظهر توزيع الضغط الصوتي في المجال الصوتي الحر على المستوى XY ومستوى XZ الواقع على بعد 3.4 مم من سطح محول الطاقة ، المقابل لموضع النواة المهادية الأمامية للماوس ، في الشكل 2B ، C. تم الحصول على هذه القياسات من خلال المسح المائي في مجال XY ومجال XZ. يظهر توزيع الضغط الصوتي في المجال الصوتي عبر الجمجمة على مستوى XY ومستوى XZ الواقع على بعد 3.4 مم من سطح محول الطاقة في الشكل 2D ، E. الضغط الصوتي الحر المقاس هو 730 كيلو باسكال ، والضغط الصوتي عبر الجمجمة المقاس هو 580 كيلو باسكال لتردد مركز 500 كيلو هرتز. يبلغ سمك الجمجمة المقاسة حوالي 0.2 مم في المتوسط. نفترض أن علاقة التشتت خطية تقريبا، ومن ثم فإن معامل توهين الجمجمة يساوي 19.98 ديسيبل/سمهرتز. يسمح محول الطاقة خفيف الوزن ، الذي يزن حوالي 1.66 جرام ، للماوس بالتحرك بسهولة ، مما يسهل مراقبة سلوك استجابة الماوس تحت FUN ومسار الحركة.

تم تسجيل إشارات الألياف الضوئية تحت FUN (الشكل 4B ، D) ، حيث يكون الغلاف مربعا وجيبيا ، على التوالي. تم استخدام خمسة ذكور من الفئران في التجربة. استمر المربع لمدة 300 مللي ثانية ، بينما استمر الجيبي المستمر لمدة 471 مللي ثانية ، مما يضمن أن إجمالي الطاقة هو نفسه في اثنين من FUNs مختلفين (الشكل 4A ، C). يشير التحسين في إشارة الألياف الضوئية إلى زيادة النشاط العصبي. الاستجابة العصبية سريعة تحت FUN ، مما يشير إلى أن محول الطاقة لديه طاقة كافية وقدرات تركيز ممتازة.

الشكل 1: عملية إنتاج محول الطاقة. وهذا بدوره ينطوي على توصيل ورقة كهرضغطية بسلك ثم تعبئتها. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل 2: إعداد وتوصيف قياس مجال الموجات فوق الصوتية لمحول الطاقة بالموجات فوق الصوتية. (أ) يتضمن الإعداد لقياس مجال الموجات فوق الصوتية سماعة مائية ، ونظام محرك ، وبرنامج تحكم ، ومولد إشارة ، وراسم الذبذبات. (ب، د) رسم تخطيطي لقياسات محول الطاقة بالموجات فوق الصوتية في المجالات الصوتية الحرة وعبر الجمجمة ونتائج قياسات مجال الصوت العرضي والطولي. (ج، ه) رسم تخطيطي لمجال الصوت المستعرض في الموضع البؤري لمحول الطاقة ، مع الخط الأحمر الذي يشير إلى مجال الصوت عند موضع -3 ديسيبل. (و، ز) مخطط الشكل الموجي للإخراج المقاس بواسطة الهيدروفون للمحول. تمثل المساحة داخل الصندوق المتقطع الأحمر والمساحة داخل المربع المتقطع الأزرق الفترات التي تسبق وصول الشكل الموجي إلى سعة مستقرة وفترة رنين الترجام في النهاية ، على التوالي. تمثل المساحة داخل المربع البرتقالي المتقطع الجزء المستقر من الشكل الموجي ، والذي يستخدم لحساب سعة الضغط ، المشار إليه ب p. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

الشكل 3: برنامج الحساب ومعلمة الموجات فوق الصوتية. (أ) واجهة حساب معلمة الموجات فوق الصوتية محلية الصنع. MI ، أنا_sppa ، وأنا_spta تم حسابها. يمكن الحصول على الواجهة من https://github.com/HQArrayLab/Ultrasound_Parameter_Caculation. ب: مخططات الأشكال الموجية للضغط بالموجات فوق الصوتية. يتم استخدام مغلف نبض جيبي ومغلف نبض مستطيل. تمثل الفترة (T) مدة دورة واحدة من تردد التشغيل. النبضة ، المعروفة باسم صوتنة واحدة مستمرة ، تستمر لمدة محددة تسمى مدة النبض (PD). عادة ، تتكرر النبضات في تسلسل يعرف باسم قطار النبض. يشار إلى الفاصل الزمني بين نبضتين متتاليتين في قطار النبض باسم فاصل تكرار النبض (PRI) ، محسوبا على أنه مقلوب تردد تكرار النبض (PRF). التسلسل الكامل للنبضات ، المعروف باسم قطار النبض ، له مدة محددة تعرف باسم مدة قطار النبض. الفاصل الزمني يعني مدة محاكمة واحدة. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل 4: إشارة القياس الضوئي للألياف أثناء FUN. (أ، ج) معلمات الموجات فوق الصوتية مغلفة بالمربع (B) والجيوب الأنفية (D). (ب، د) إشارة القياس الضوئي للألياف على التوالي أثناء FUN ل (A) و (C). الظل الأخضر هو مدة المرح. الخط المتصل هو المتوسط ، وظلال الأزرق والأحمر هي المتوسط والانحراف المعياري للإشارات المسجلة. تم استخدام خمسة ذكور من الفئران في التجربة. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Discussion

يجمع هذا النهج بين FUN وتسجيل القياس الضوئي البصري ، مما يتيح التحقيق في وظائف دماغ الماوس وآلية FUN في الجسم الحي . تم تحديد العملية التشغيلية الكاملة ، من تصنيع محول الطاقة إلى العمليات الجراحية ، مما يسمح للباحثين بإجراء FUN بشكل مستقل من خارج المجال.

أحد الجوانب الحاسمة للبروتوكول هو التأكد من إدخال الغرسة البصرية بسلاسة في محول الطاقة ، والأسمنت السني عبر الجمجمة رقيق بما يكفي لاختراق الموجات فوق الصوتية في الدماغ ، ويتم توصيل الغرسة البصرية بشكل آمن بالجمجمة لمنع إزاحة أثناء التجربة ، وإنتاج الطاقة من محول الطاقة يكفي للتعديل العصبي الفعال. يجب أن يكون سمك الأسمنت السني المحيط بالزرع مساويا أو أقل من قطر فتحة محول الطاقة. لذلك ، ينصح باستخدام نفس أنبوب البولي بروبلين لكل من عملية تصنيع محول الطاقة والجراحة. نظرا لأن أنبوب البولي بروبلين لا يلتصق بأسمنت الأسنان ، فقد تم اختياره لتشكيل الأسمنت السني حول الغرسة ، بقطع جانبي ، لتسهيل إزالة أنبوب البولي بروبلين بسهولة.

التسجيل الفيزيولوجي الكهربي وتسجيل القياس الضوئي البصري هما تقنيتان شائعتان لمراقبة نشاط الدماغ في الجسم الحي ، مما يوفر دقة زمنية مكانية عالية. ومع ذلك ، فإن التسجيل الفيزيولوجي الكهربية يلتقط إشارة نشاط الإطلاق من الخلايا العصبية المتصلة بالأقطاب الكهربائية مباشرة. يمكن للموجات فوق الصوتية أن تهتز الأقطاب الكهربائية مباشرة ، مما يؤدي إلى تأثيرات مربكة غير ضرورية. لحسن الحظ ، فإن تقنية القياس الضوئي للألياف ، وهي أقل توغلا ، تلتقط نشاط الخلايا العصبية تحتها ، مما قد يقلل من التأثير المربك لاهتزاز الموجات فوق الصوتية على الغرسة^7،19،26. ونتيجة لذلك ، فإن تقنية التعديل العصبي بالموجات فوق الصوتية المركزة في وقت واحد وتسجيل القياس الضوئي للألياف في الفئران حرة الحركة تسمح بدراسة آليات التعديل العصبي بالموجات فوق الصوتية في الجسم الحي وتمكن من مراقبة الاستجابات السلوكية للفئران دون تدخل التخدير.

ومع ذلك ، فإن الدقة المكانية للقياس الضوئي للألياف مقيدة لأنها غير قادرة على مراقبة نشاط الدوائر تحت الخلوية والدوائر الدقيقة²⁴. علاوة على ذلك ، فإنه يوفر تمثيلا غير مباشر للنشاط العصبي لأنه لا يسجل مباشرة الإشارات الكهربائية الناتجة عن النشاط العصبي.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
1ml disposable syringe	DOUBLE-DOVE	1ml	Injection needles
26-gauge needle	Jin mao	JM-J02	Preparation needles
70% ethanol	Dong de alcohol	0.7	Disinfect
alcohol	Dong de alcohol	0.75	Clean the transducer surface
Bayonet Nut Connector	Risym	75-5	The other end of the connecting wire is connected to the ultrasonic excitation device
copper ring	Guowei Metal Materials	Outer diameter, wall thickness, height (8mm, 0.2mm, 8mm)	The outer protective case of the transducer
disposable syringe	DOUBLE-DOVE	1ml	The inhalation of epoxy resin allows precise small amounts to be injected into the copper pipe
double-sided tape	3M	3M55236	It is used to fix the transducer and the wire to ensure that the epoxy silver glue does not move before drying
electronic soldering iron	Victor	868A+	The soldered wires are connected to the BNC
epoxy resin glue	Kraft	K 9741	Seal the rear of the transducer
epoxy silver paste	Vonroll	CB-052	The wire is attached to the positive and negative poles of the piezoelectric ceramic sheet and the resistance is kept low
fader	JOQO	YP-7021	Remove the head hair of the mouse
gas anesthesia machine	RWD	R500	It is used for anesthesia in mice
glass sheet	Square glass	80mm*80mm	A temporary operating surface for placing piezoelectric ceramics and wires can be used to coat the surface of the glass plate with double-sided tape
ketamine/xylazine	Shutai/shengxin	Zoletil 50/2ml*10	Anesthetize the mouse
medical coupling agent	Bestman	120g	The couplant acts as a medium to conduct the ultrasound signal
mouse	Bai shi tong	GCaMp6	Test subject
ophthalmic ointment	Yun Zhi	0.5% x 2.5 g x1	Moistens the eye area to prevent blindness
piezoelectric plate	Jiaming Electronics Factory	Diameter, pore, thickness (7mm, 3mm, 3.56mm)	The electrical energy is emitted in the form of ultrasound
polypropylene pipe	Baihao Pipe Factory	Outer diameter, inner diameter, length (3mm, 2mm, 500mm)	Prevent the epoxy resin from plugging the holes and leaving the holes
povidone-iodine	lefeke	500ml	Disinfect
signal record of fiber	Thinker Tech Nanjing Biotech	Three-color single-channel fiber optic recording system	Record fiber photometry signals
stereotaxic frame	RWD	68805	Fix the head of the mouse and localize the brain region
sterile saline	Shijiazhuang si yao	500ML,4.5g	As a solvent, dissolves the drug
stimulation of ultrasound	Deep Brain Technology	DB-USNM	Provides stable input to the transducer
weighing machine	Qin bo shi	1718	Weigh the mouse
wire	Jinpeng Cable Factory	0.3mm2	Voltage is supplied to the transducer