נוירומודולציית אולטרסאונד ממוקדת בו זמנית והקלטת פוטומטריית סיבים בעכבר הנע בחופשיות

Summary

הפרוטוקול כולל ייצור מתמרים, דיווח פרמטרים, הליך כירורגי והקלטת אותות עבור כל זרימת העבודה התפעולית של נוירומודולציית אולטרסאונד ממוקדת בו זמנית והקלטת פוטומטריית סיבים בעכברים הנעים בחופשיות.

Abstract

נוירומודולציית אולטרסאונד ממוקדת (FUN) מייצגת גישה מבטיחה להפרעה לא פולשנית של מעגלים עצביים באזורי מוח עמוקים. זה תואם את רוב השיטות הקיימות לניטור תפקודי המוח in vivo. אינטגרציה עם שיטות רישום של תפקודי המוח לא רק מאפשרת לנו לטפל בפקודות ובהפרעות של תפקודי מוח ספציפיים באמצעות משוב בלולאה סגורה, אלא גם מספקת לנו תובנות מכניסטיות על FUN עצמו. כאן, אנו מספקים פרוטוקול שונה, פשוט, אמין וחזק ליישום סימולטני של FUN ופוטומטריית סיבים GCaMP6s הקלטת פלואורסצנטיות בעכברים הנעים בחופשיות. זה כרוך בייצור של מתמר יחיד בגודל טוב ומיקומו הזמני על העכברים, יחד עם קיבוע מאובטח של שתל סיב אופטי כדי להקל על המעבר החלק של המתמר. השילוב של FUN ופוטומטריית סיבים מספק הקלטה אופטית של תגובות מעגלים עצביים על FUN בזמן אמת באזורי מוח עמוקים. כדי להדגים את היעילות של פרוטוקול זה, עכברי Thy1-GCaMP6s שימשו כדוגמה לרישום הנוירואקטיביות בגרעין התלמוס הקדמי במהלך FUN בזמן שהעכברים נעים בחופשיות. אנו מאמינים כי פרוטוקול זה יכול לקדם את השימוש הנרחב ב- FUN הן בתחום מדעי המוח והן בתחום האולטרסאונד הביו-רפואי.

Introduction

נוירומודולציה ממוקדת אולטרסאונד (FUN) התפתחה ככלי נוירומודולציה מבטיח ורב-תכליתי, המאפשר לחקור את תפקוד המוח וארגונו עם פוטנציאל גדול¹. FUN מסוגלת לספק אנרגיה אקוסטית באופן לא פולשני לכל מיקום ברקמת המוח בדיוק נקודתי². יכולתו לווסת באופן ארעי והפיך את הנוירואקטיביות במבנה המוח העמוק, עם ספציפיות מרחבית-טמפורלית גבוהה, באופן בטוח ולא פולשני, מציגה תכונה מושכת המשלימה את טכניקת הנוירומודולציה הקלינית הקיימת³. הדגמה של FUN יעיל אושרה הן בבני אדם ^4,5,6 והן במודלים שונים של בעלי חיים, הכוללים^מינים קטנים 7,8,9,10 ומינים גדולים 11,12,13,14,15,16,17.

על ידי התבוננות בהשפעה של FUN על סוגים עצביים ספציפיים באמצעות ניטור נוירואקטיביות במהלך FUN, אנו יכולים להתעמק במנגנון שמאחורי תהליך זה^18,19. פוטומטריית סיבים המבוססת על מדדי סידן מקודדים גנטית (GECIs) הפכה בשימוש נרחב בעשור האחרון כשיטה רב-תכליתית למעקב אחר פעילות אוכלוסייה ספציפית לסוג התא in vivo 20,21,22,23,24. לפיכך, היישום הסימולטני של FUN ופוטומטריית סיבים יכול להעשיר באופן משמעותי את ההבנה המקיפה שלנו של FUN. עם זאת, השימוש במתמרים בודדים מגושמים מחייב קיבוע למסגרת, בעוד בעלי חיים צריכים לעבור הרדמה ולהיות משותקים במסגרת סטריאוטקסית 7,19,25,26. גישה זו עשויה שלא להתאים לסוגים מסוימים של ניסויים הקשורים לתפיסה, קוגניציה והערכת התנהגות. חיוני לקבוע פרוטוקול המאפשר מיזוג של FUN ופוטומטריית סיבים מבלי לפגוע בניוד העכברים⁷.

במחקר זה, אנו מציגים פרוטוקול מעודן ששימש במחקרים הקודמים שלנו כדי להשלים בצורה חלקה וחיננית את השיטה ליצירת מתמר יחיד וקיבוע זמני שלו על העכברים, כמו גם קיבוע מאובטח של שתל סיב אופטי כדי להקל על המעבר החלק של המתמר ^7,19,26. זה מאפשר לחוקרים להקליט את הנוירואקטיביות המווסתת על ידי אולטרסאונד בעכברים בלתי מרוסנים. בחרנו במעטפה חלקה יותר, כגון מעטפה סינוסואידית, כדי להקטין את בלבול השמע²⁷. היתכנות פרוטוקול זה מאושרת באמצעות רישום סימולטני של נוירואקטיביות בגרעין התלמי הקדמי של עכברים הנעים בחופשיות במהלך FUN. הוא מדגים כי אנרגיית המתמר מספיקה להשגת נוירומודולציה, ושיטות הקיבוע של שתל הסיב האופטי והמתמר יכולות להבטיח את יציבותם.

Protocol

כל הנהלים והטיפול בבעלי חיים עמדו בהנחיות האתיקה של NSFC ובדרישות פרוטוקול מאושרות של הוועדה המוסדית לטיפול ושימוש בבעלי חיים של מכון גואנגדונג למודיעין, מדע וטכנולוגיה.

1. הכנת מתמרים

1. הכינו צלחת פיאזואלקטרית בקוטר פנימי של 3 מ"מ, קוטר חיצוני של 7 מ"מ ותדר מרכזי של 500 קילוהרץ.
   הערה: ניתן לכוונן את הקוטר החיצוני בהתבסס על האזור הספציפי במוח הממוקד ויש למקסם אותו תוך שמירה על דיוק הגירוי ומבלי לחרוג מגבול גולגולת העכבר.
2. חברו את החוט לשני הצדדים של הלוח הפיזואלקטרי באמצעות משחת כסף אפוקסי (איור 1). לאחר שמשחת הכסף האפוקסי התמצקה, השתמש במולטימטר כדי למדוד את ההתנגדות בשני קצוות החוט כדי לוודא שהיא בערך 0.
3. יש למרוח שכבה של סרט דו-צדדי על משטח זכוכית נקי. היצמדו לצלחת הפיזואלקטרית ולטבעת הנחושת, בגובה של 8 מ"מ, קוטר חיצוני של 8 מ"מ וקוטר פנימי של 7.6 מ"מ, צמוד ליריעת הזכוכית.
   הערה: הקוטר הפנימי של טבעת הנחושת נקבע על ידי גודל הלוח הפיזואלקטרי כדי להבטיח שהלוח מכוסה על ידי טבעת הנחושת.
4. הכניסו היטב את צינור הפוליפרופילן בקוטר חיצוני של 3 מ"מ למרכז הלוח הפיזואלקטרי והדביקו אותו היטב ליריעת הזכוכית (איור 1).
5. הכינו כמות מתאימה של דבק שרף אפוקסי ושאבו אותו. מוציאים את האפוקסי בעזרת מזרק חד פעמי ומזריקים אותו לאט לאט לתוך טבעת הנחושת. המתינו כ-10 שעות עד שהאפוקסי יתמצק (איור 1).
6. הלחמת את הקצוות הרופפים של שני חוטים על מחבר אום הכידון באמצעות מגהץ הלחמה אלקטרוני. הסירו את יריעת הזכוכית. נקו את פני השטח של המתמר עם אלכוהול (איור 1).

2. פרמטרי דיווח עבור FUN

1. הניחו את ההידרופון והמתמר במיכל מים מלא במים שעברו דה-יוניזציה (איור 2A). ודא שהקרן המרכזית (ציר Z) של מערכת המיקום מיושרת עם ציר המתמר. יישור זה יכול להיות מושג על ידי ראשית, גילוי שדה מקסימלי במישור המוקד באמצעות סריקה דו-ממדית; שנית, זיהוי שדה מקסימלי במישור אחר עם מקסימום ברור; שלישית, השוואת קואורדינטות X ו- Y של שתי המקסימום ולאחר מכן התאמה איטרטיבית של המיקום ו / או הכיוון של המתמר במידת הצורך²⁸.
2. כוונן את קצה ההידרופון עם פני השטח של המתמר במרחק של 1 מ"מ, תוך שמירה על מרחק קבוע תוך מיקום ההידרופון באמצע הקצה הימני של המתמר. הפעל את תוכנית הסריקה כדי ללכוד את השדה האקוסטי החופשי במישור XZ (איור 2B).
   הערה: ניתן למצוא את שיטת הבנייה של ההידרופון https://github.com/HQArrayLab/Hydrophone_system_control.
3. הזיזו את ההידרופון לאורך ציר Z כדי לקבוע את העומקים הקשורים ללחץ השיא המרחבי. בניסוי זה, לחץ השיא המרחבי מופיע במרחק של 3.4 מ"מ מפני השטח של המתמר; שמור על מרחק זה בעת הזזת ההידרופון לפינה הימנית התחתונה של המתמר במישור XY. הפעל והפעל את תוכנית הסריקה כדי ללכוד את השדה האקוסטי החופשי במישור XY (איור 2B).
4. הניחו את המתמר על גולגולת של עכבר שעבר ניתוח כמתואר בשלב 4. רכשו את השדה האקוסטי הטרנס-גולגולתי במישור XZ ובמישור XY (איור 2D) באמצעות סריקה הידרופונית כמתואר ב-2.1-2.3.
5. קרא את אמפליטודות הלחץ בנקודת המוקד, שהיא אזור השיא המרחבי בשדה האקוסטי החופשי ובשדה האקוסטי הטרנס-גולגולתי. משרעת הלחץ בנקודת המוקד בשדה האקוסטי החופשי היא 730k Pa, ובשדה האקוסטי הטרנס-גולגולתי היא 580k Pa. קראו את ממדי המוקד ב-3- dB (איור 2C,E), ואת המיקום במישורי XY ו-XZ בתוך השדה האקוסטי הטרנס-גולגולתי כדי להעריך אם השדה האקוסטי של המתמר הזה יכול לכסות את אזורי המטרה במוח.
6. חשב את המדד המכני (MI), אשר מוגבל על ידי מסמך הנחיות ה- FDA להיות מתחת 1.9 על מנת להפחית cavitation. חישוב MI נתון על ידי המשוואה:
   (1)
   כאשר p_r,.3 מייצג את שיא הלחץ הרפרפקציוני ב- MPa המותאם על ידי מקדם הנחתה של 0.3 dB ^{cm-1 MHz-1}, ו - f₀ הוא תדר הפעולה ב- MHz. הלחץ הרפרפקציוני של שיא השדה הטרנס-גולגולתי שנמדד הוא 580 kPa, , 3.4 מ"מ מהמתמר, f₀ הוא 500 kHz, כך שה- p_r,.3 המנוטרל הוא 576.6 kPa. ה-MI הוא 0.82.
7. חשב את עוצמת הדופק הממוצעת של שיא מרחבי (I_sppa), הנדרשת להיות מתחת ל -190 W/cm² בכיוון המישור על פי מסמך הנחיות ה- FDA. חישוב העוצמה נתון על ידי המשוואה:
   (2)
   כאשר p_sp (t) הוא הלחץ האקוסטי המשתנה בזמן במיקום הפסגה המרחבית, Z הוא העכבה האקוסטית האופיינית של התווך (בערך 1.5 x 10⁶ קרניים לרקמות רכות), ופרקינסון הוא משך הדופק. במקרה של המעטפה הריבועית, זה מצטמצם למשוואה:
   (3)
   כאשר A היא משרעת הלחץ המרחבית-שיא. ה-A שנמדד במיקום ממוקד האולטרסאונד הוא 580 kPa, וה-Z של המוח הוא בערך 1.58 x 10⁶ קרניים, כך שה-I_sppa של המעטפת הריבועית הוא 10.65 W/cm² וה-I_sppa של המעטפת הסינוסואידית הוא 10.65 W/cm².
8. חשב את העוצמה המרחבית-שיא הזמן-ממוצעת (I_spta), אשר מוגבלת על ידי מסמך ההנחיות של ה- FDA להיות מתחת 430 mW / cm² בכיוון המטוס. חישוב העוצמה נתון על ידי המשוואה:
   (4)
   כאשר T הוא פרק הזמן שבו מחושב הממוצע. במקרה של המעטפה הריבועית, זה מצטמצם למשוואה:
   (5)
   כאשר_{רכבת דופק} DC היא מחזור העבודה של הדופק. כאן, רכבת הדופק DC היא 1% מכיוון שנעשה שימוש בגלים רציפים, כך שה_{- I spta} שווה לעוצמת הדופק הממוצעת של שיא מרחבי, 106.5 mW / cm² עבור מעטפת מרובעת. ניתן לחשב את MI, I_sppa ו-I_spta באמצעות התוכנה (איור 3A). קוד מבוסס MATLAB לשימוש קל ניתן למצוא בכתובת https://github.com/HQArrayLab/Ultrasound_Parameter_Caculation.
9. דווחו על פרמטרי תזמון הדופק, כולל A_{מקסימום}, משך הדופק, מרווח חזרת הדופק, משך רכבת הדופק והמעטפה (איור 3B).

3. הכנת החיה לניתוח

1. שוקלים עכברים טרנסגניים זכרים בני 8 שבועות מסוג GCaMP6s, שמשקלו משוער הוא כ-20 גרם. הכינו תמיסה המכילה קטמין ב-10 מ"ג/מ"ל וקסילזין ב-2 מ"ג/מ"ל במי מלח סטריליים. יש לתת את תמיסת הקטמין/קסילזין בהזרקה תוך צפקית במינון של 100 מ"ג/ק"ג קטמין ו-20 מ"ג/ק"ג קסילזין באמצעות מחט 26 גרם ומזרק חד פעמי בנפח 1 מ"ל. התחל הכנה כירורגית ברגע שבעל החיים אינו מגיב לגירויים כואבים, כגון צביטת בוהן.
2. השתמש fader כדי לקצץ את השיער על הראש של החיה ולחטא את האזור עם 70% אתנול ו povidone-יוד לפני ההליך הכירורגי.
3. מקם את העכבר במצב נוטה על המסגרת הסטריאוטקסית וודא שהגולגולת ישרה. הניחו משחת עיניים מגנה על עיני בעל החיים כדי לשמור על לחות.

4. הליך כירורגי

1. בצע חתך לאורך התפר sagittal, החל מן העצם העורפית לתחילת עצם האף. השתמש מספריים כירורגיים כדי להסיר את העור המכסה את שתי ההמיספרות.
2. השתמש מלוחים סטריליים כדי לנקות את הגולגולת ולחסל כל periosteum שנותר.
3. יש למרוח 3% מי חמצן על הגולגולת החשופה באמצעות צמר גפן למשך כ-2-3 שניות ליצירת מיקרו-נקבוביות. יש לשטוף היטב במי מלח סטריליים ולוודא שהאזור יבש לחלוטין.
4. צור קרניוטומיה של חור בור בקוטר 0.6 מ"מ באמצעות מקדח סטרילי ואוטוקלאבי מעל מיקום אזור המוח כפי שנקבע על ידי האטלס הסטריאוטקסי המיושר לברגמה וללמדא. שטפו את כל הלכלוך במי מלח סטריליים והבטיחו ייבוש יסודי. היזהר לא לפגוע בשום רקמה.
5. הכנס את הסיב האופטי (שתל) למחזיק הבדיקה וחבר אותו לזרוע הסטריאוטקסית.
6. יישרו את השתל ישירות מעל אזור העניין באמצעות הזרוע הסטריאוטקסית. בעת החדרת הסיב האופטי לרקמת המוח, יש לקדם את הסיב באיטיות בקצב של כ-2 מ"מ/דקה.
7. ערבבו את הצמנט הדנטלי כדי להשיג צמיגות המאפשרת מריחה קלה על פני הגולגולת. השתמש בקיסם סטרילי כדי לפזר שכבה דקה של מלט דנטלי על הגולגולת ועל החלק התחתון של השתל. הניחו לו להתייבש לחלוטין.
8. נתק את בעל הבדיקה בזהירות. הכינו צינור פוליפרופילן בגובה של 3 מ"מ, קוטר חיצוני של 3 מ"מ וקוטר פנימי של 2.6 מ"מ, ולאחר מכן חתכו את הצינור לכל אורכו.
9. חברו את הצינור לתחתית השתל באמצעות פינצטה. שפכו את אבקת המלט הדנטלית לתוך הצינור כדי להבטיח אורך מספיק מעל השתל להקלטת אות הסיב האופטי. מוסיפים את הנוזל הדרוש ומאפשרים מספר דקות עד שהמלט הדנטלי יתמצק.
10. אתר את פתח הצינור ומהדק אותו בזהירות כדי להסיר את הצינור באמצעות פינצטה. הכינו את תערובת הצמנט הדנטלי למריחה, וודאו ששכבה אחידה ודקה נפרסת על פני הגולגולת. כסו שטח פנים רב ככל האפשר על הגולגולת במלט דנטלי. המתן מספר דקות עד שבית הקברות הדנטלי יתמצק.
    הערה: אין לתת למלט הדנטלי לבוא במגע עם עור העכבר.
11. קדחו שלושה חורים (קוטר 1 מ"מ) לתוך הטבעת המודפסת בתלת-ממד, מחולקת באופן שווה באופק, בגובה של 7 מ"מ, קוטר חיצוני של 10 מ"מ וקוטר פנימי של 8.4 מ"מ. אבטחו את הברגים (באורך 1 מ"מ) לתוך החורים שלהם.
12. הכנס את החלק העליון של השתל לתוך החור של המתמר שיוצר מראש. ודא שהדופן הפנימית של הטבעת המודפסת בתלת-ממד חלקה, ולאחר מכן מקם אותה סביב המתמר הממוקם על גולגולת העכבר. ודא שהמתמר ממורכז בתוך הטבעת.
13. מרחו צמנט דנטלי על הצומת שבין הטבעת לגולגולת, ואז המתינו מספר דקות עד שהמלט הדנטלי יתמצק. הימנעו מהנחת המלט הדנטלי על החיבור בין המתמר לגולגולת.
14. הסר בזהירות את המתמר והדק היטב את הברגים. העבירו את העכבר לכלוב חם וודאו שהוא מנוטר עד להחלמה מלאה לפני החזרתו לכלוב המקורי.
15. לאחר הניתוח, לנהל Carprofen תת עורית (2 מ"ג / ק"ג) עבור שיכוך כאבים ולהמשיך כל 24 שעות במשך 3 ימים כדי לנהל דלקת וכאב. יש לעקוב אחר בעלי החיים מדי יום לאיתור סימני מצוקה, ירידה חריגה במשקל, כאב או זיהום. בדרך כלל,^{עד היום השלישי} לאחר הניתוח, כל העכברים צריכים להפגין התנהגות נורמלית. אם סימני מצוקה או מחלה כלשהם נצפים בעכבר לאחר היום^השלישי , פעל בהתאם להנחיות המוסדיות להמתת חסד.

5. גירוי והקלטת אותות

1. לאחר 7 ימים לאחר הניתוח, הפעל את אספקת החמצן למכונת הרדמת הגז וכוונן את וסת זרימת החמצן כדי להגדיר את זרימת הגז ל 300-500 מ"ל / דקה.
2. הניחו את העכבר בתא האינדוקציה וסגרו את הזרמת גז ההרדמה למסכה. סובב את חוגת הוופורייזר כדי להתאים את ריכוז ההרדמה המתאים (2%-2.5%).
3. לאחר שהעכבר מורדם, הניחו אותו על המסגרת הסטריאוטקסית עם מסכת הרדמה. סגור את קו הזירוז כדי לאפשר לגז ההרדמה לזרום לתוך מסיכת ההרדמה. התאמת ריכוז ההרדמה התחזוקתית המתאימה (1%-1.5%).
4. נקו את המשטח העליון של השתל באלכוהול, ולאחר מכן הכניסו את כבל התיקון של הסיב האופטי למרכז המתמר המוכן.
5. הזריקו מים לרווח שבין השתל לטבעת המודפסת בתלת-ממד באמצעות מחט 26G ומזרק חד פעמי בנפח 1 מ"ל כדי להרטיב את הגולגולת. השתמשו במגבות נייר כדי לספוג עודפי מים.
6. הזריקו חומר צימוד לחלל שבין השתל לטבעת המודפסת בתלת-ממד באמצעות מחט 26G ומזרק חד פעמי בנפח 1 מ"ל כדי להקל על התפשטות קלה של אולטרסאונד מהמתמר למוח.
7. חבר את השתל לכבל התיקון של הסיב האופטי. הכניסו בזהירות את המתמר לאזור המלא בחומר צימוד והדקו היטב את הברגים.
8. מקם את העכבר בשדה פתוח ואפשר לו להתעורר. חבר את המתמר למערכת העירור העל-קולי וחבר את כבל התיקון של הסיב האופטי למערכת הקלטת הסיב האופטי, מה שמאפשר חופש תנועה לעכבר.
   הערה: כבל התיקון של הסיב האופטי הוא באורך של 2 מ' וקוטר של 1.25 מ"מ. עוצמת האור עבור ערוץ 405 היא 20 μW, ועבור ערוץ 470 היא 40 μW.
9. הפעל הן את מכשיר העירור העל-קולי והן את מערכת הקלטת הסיב האופטי על מנת לסנכרן אפנון עצבי על-קולי עם הקלטת אות סיב אופטי.

תוצאות

התפלגות הלחץ האקוסטי בשדה האקוסטי החופשי במישור XY ובמישור XZ הממוקם במרחק של 3.4 מ"מ מפני השטח של המתמר, בהתאם למיקום הגרעין התלמי הקדמי של העכבר, מוצגת באיור 2B,C. מדידות אלה נרכשו באמצעות סריקה הידרופונית בתחום XY ותחום XZ. התפלגות הלחץ האקוסטי בשדה האקוסטי הטרנס-גולגולתי במישור XY ובמישור XZ הממוקם במרחק של 3.4 מ"מ מפני השטח של המתמר מוצגת באיור 2D,E. הלחץ האקוסטי החופשי שנמדד הוא 730 kPa, והלחץ האקוסטי התוך גולגולתי שנמדד הוא 580 kPa עבור תדר מרכזי של 500 kHz. עובי הגולגולת שנמדד הוא כ-0.2 מ"מ בממוצע. אנו מניחים שיחס הפיזור הוא ליניארי בקירוב, ולכן לגולגולת יש מקדם הנחתה של 19.98 dB/cmMHz. המתמר קל המשקל, השוקל כ-1.66 גרם, מאפשר לעכבר לנוע בקלות, ומקל על התבוננות בהתנהגות התגובה של העכבר תחת FUN ושובל התנועה.

אותות הסיב האופטי נקלטו תחת FUN (איור 4B,D), כאשר המעטפת הייתה מרובעת וסינוסואידית, בהתאמה. חמישה עכברים זכרים שימשו בניסוי. הריבוע נמשך 300 מילישניות, בעוד שהסינוסואידל הרציף נמשך 471 מילישניות, מה שיכול להבטיח שהאנרגיה הכוללת תהיה זהה בשני FUNs שונים (איור 4A,C). שיפור באות הסיב האופטי מצביע על עלייה בפעילות העצבית. התגובה העצבית מהירה תחת FUN, מה שמרמז על כך שלמתמר יש מספיק אנרגיה ויכולות מיקוד מצוינות.

איור 1: תהליך הייצור של המתמר. זה כרוך, בתורו, חיבור יריעה פיאזואלקטרית לחוט ולאחר מכן אריזת אותו. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

איור 2: הגדרת ואפיון שדה אולטרסאונד למתמר אולטרסוני. (A) ההגדרה למדידת שדה אולטרסאונד כוללת הידרופון, מערכת מנועים, תוכנת בקרה, מחולל אותות ואוסילוסקופ. (ב, ד) תרשים סכמטי של מדידות מתמרים על-קוליים בשדות אקוסטיים חופשיים וטרנס-גולגולתיים ותוצאות מדידות שדה קול רוחבי ואורכי. (ג, ה) דיאגרמה של שדה הקול הרוחבי במיקום מוקד המתמר, כאשר הקו האדום מציין את שדה הקול במיקום -3 dB. (ו, ז) דיאגרמת צורת גל של הפלט שנמדד על ידי ההידרופון עבור המתמר. השטח בתוך התיבה המקווקו האדום והשטח בתוך התיבה המקווקו הכחולה מייצגים את התקופות לפני שצורת הגל מגיעה למשרעת יציבה ואת תקופת הצלצול של המתמר בסוף, בהתאמה. האזור בתוך התיבה המקווקו הכתום מייצג את החלק היציב של צורת הגל, המשמש לחישוב משרעת הלחץ, המסומנת כ-p. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

איור 3: תוכנת חישוב ופרמטר אולטרסאונד. (A) ממשק חישוב פרמטר אולטרסאונד ביתי. MI, אני_sppa, ואני_spta מחושבים. ניתן היה להשיג את הממשק https://github.com/HQArrayLab/Ultrasound_Parameter_Caculation. (B) סכמות של צורות גל לחץ אולטרסאונד. נעשה שימוש במעטפת דופק סינוסואידלית ובמעטפת דופק מלבנית. התקופה (T) מייצגת את משך הזמן של מחזור יחיד של תדירות ההפעלה. פולס, המכונה סוניקציה רציפה יחידה, נמשך משך זמן מוגדר הנקרא משך הדופק (PD). בדרך כלל, פולסים חוזרים על עצמם ברצף המכונה רכבת דופק. מרווח הזמן בין שתי פעימות רצופות ברכבת פולס מכונה מרווח חזרה על הדופק (PRI), המחושב כגומלין של תדירות חזרת הדופק (PRF). לכל רצף הפעימות, המכונה רכבת הדופק, יש משך זמן מסוים המכונה משך רכבת הדופק. זמן מרווח הזמן פירושו משך הניסיון היחיד. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

איור 4: אות של פוטומטריית סיבים במהלך FUN. (א, ג) פרמטרים של אולטרסאונד עטופים בריבוע (B) וסינוסואידלי (D). (ב, ד) אות הפוטומטריה של הסיב בהתאמה במהלך FUN של (A) ו-(C). הצל הירוק הוא משך הזמן של FUN. הקו המוצק הוא הממוצע, והגוונים של כחול ואדום הם הממוצע וסטיית התקן של אותות מוקלטים. חמישה עכברים זכרים שימשו בניסוי. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

Discussion

גישה זו משלבת FUN עם הקלטת פוטומטריה אופטית, ומאפשרת לחקור את תפקוד המוח של העכבר ואת מנגנון in vivo FUN. התהליך התפעולי המלא, החל מייצור מתמרים ועד להליכים כירורגיים, מתואר, ומאפשר לחוקרים לבצע FUN באופן עצמאי מחוץ לשטח.

היבט חיוני אחד של הפרוטוקול הוא לוודא שהשתל האופטי מוכנס בצורה חלקה לתוך המתמר, הצמנט הדנטלי לאורך הגולגולת דק מספיק לחדירת אולטרסאונד למוח, השתל האופטי מחובר היטב לגולגולת כדי למנוע תזוזה במהלך הניסוי, ותפוקת האנרגיה של המתמר מספיקה לנוירומודולציה יעילה. עובי הצמנט הדנטלי המקיף את השתל צריך להיות שווה או קטן מקוטר חור המתמר. לכן, מומלץ להשתמש באותו צינור פוליפרופילן הן לתהליך ייצור המתמרים והן לניתוח. מכיוון שצינור פוליפרופילן אינו נדבק לצמנט דנטלי, הוא נבחר לעצב את המלט הדנטלי סביב השתל, עם חתך צדדי, כדי להקל על הסרה קלה של צינור הפוליפרופילן.

הקלטה אלקטרופיזיולוגית והקלטת פוטומטריה אופטית הן טכנולוגיות נפוצות לניטור פעילות המוח in vivo, המציעות רזולוציה טמפורלית מרחבית גבוהה. עם זאת, הקלטה אלקטרופיזיולוגית לוכדת את אות פעילות הירי מתאי עצב המחוברים ישירות לאלקטרודות. גלי האולטרסאונד יכלו להרטיט ישירות את האלקטרודות, ולגרום להשפעות מבלבלות מיותרות. למרבה המזל, טכנולוגיית פוטומטריית הסיבים, שהיא פחות פולשנית, לוכדת את פעילות הנוירונים שמתחתיה, מה שיכול להפחית את ההשפעה המבלבלת של רטט אולטרסאונד על השתל ^7,19,26. כתוצאה מכך, הטכנולוגיה של נוירומודולציית אולטרסאונד ממוקדת בו זמנית ורישום פוטומטריה של סיבים בעכברים הנעים בחופשיות מאפשרת לחקור מנגנוני in vivo של נוירומודולציה על-קולית ומאפשרת תצפית על התגובות ההתנהגותיות של העכברים ללא הפרעה של הרדמה.

עם זאת, הרזולוציה המרחבית של פוטומטריית סיבים מוגבלת מכיוון שהיא אינה מסוגלת לנטר את פעילותם של תת-תאיים ומיקרו-מעגלים²⁴. יתר על כן, הוא מספק ייצוג עקיף של פעילות עצבית שכן הוא אינו רושם ישירות את האותות החשמליים המיוצרים על ידי פעילות עצבית.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
1ml disposable syringe	DOUBLE-DOVE	1ml	Injection needles
26-gauge needle	Jin mao	JM-J02	Preparation needles
70% ethanol	Dong de alcohol	0.7	Disinfect
alcohol	Dong de alcohol	0.75	Clean the transducer surface
Bayonet Nut Connector	Risym	75-5	The other end of the connecting wire is connected to the ultrasonic excitation device
copper ring	Guowei Metal Materials	Outer diameter, wall thickness, height (8mm, 0.2mm, 8mm)	The outer protective case of the transducer
disposable syringe	DOUBLE-DOVE	1ml	The inhalation of epoxy resin allows precise small amounts to be injected into the copper pipe
double-sided tape	3M	3M55236	It is used to fix the transducer and the wire to ensure that the epoxy silver glue does not move before drying
electronic soldering iron	Victor	868A+	The soldered wires are connected to the BNC
epoxy resin glue	Kraft	K 9741	Seal the rear of the transducer
epoxy silver paste	Vonroll	CB-052	The wire is attached to the positive and negative poles of the piezoelectric ceramic sheet and the resistance is kept low
fader	JOQO	YP-7021	Remove the head hair of the mouse
gas anesthesia machine	RWD	R500	It is used for anesthesia in mice
glass sheet	Square glass	80mm*80mm	A temporary operating surface for placing piezoelectric ceramics and wires can be used to coat the surface of the glass plate with double-sided tape
ketamine/xylazine	Shutai/shengxin	Zoletil 50/2ml*10	Anesthetize the mouse
medical coupling agent	Bestman	120g	The couplant acts as a medium to conduct the ultrasound signal
mouse	Bai shi tong	GCaMp6	Test subject
ophthalmic ointment	Yun Zhi	0.5% x 2.5 g x1	Moistens the eye area to prevent blindness
piezoelectric plate	Jiaming Electronics Factory	Diameter, pore, thickness (7mm, 3mm, 3.56mm)	The electrical energy is emitted in the form of ultrasound
polypropylene pipe	Baihao Pipe Factory	Outer diameter, inner diameter, length (3mm, 2mm, 500mm)	Prevent the epoxy resin from plugging the holes and leaving the holes
povidone-iodine	lefeke	500ml	Disinfect
signal record of fiber	Thinker Tech Nanjing Biotech	Three-color single-channel fiber optic recording system	Record fiber photometry signals
stereotaxic frame	RWD	68805	Fix the head of the mouse and localize the brain region
sterile saline	Shijiazhuang si yao	500ML,4.5g	As a solvent, dissolves the drug
stimulation of ultrasound	Deep Brain Technology	DB-USNM	Provides stable input to the transducer
weighing machine	Qin bo shi	1718	Weigh the mouse
wire	Jinpeng Cable Factory	0.3mm2	Voltage is supplied to the transducer