الحقن الأمثل في الوريد في أسماك الزرد البالغة

Summary

هنا ، نقدم بروتوكولا محسنا وفعالا للحقن الوريدي للخلايا أو العوامل الدوائية في أسماك الزرد البالغة ، مما يؤدي إلى تعزيز نقش الخلايا وزيادة معدلات بقاء أسماك الزرد المعالجة.

Abstract

يعرف الحقن الوريدي (IV) على نطاق واسع بأنه الطريقة الأكثر فعالية والأكثر استخداما لتحقيق التوصيل الجهازي للمواد في نماذج أبحاث الثدييات. ومع ذلك ، فإن تطبيقه في أسماك الزرد البالغة لتوصيل الأدوية وزرع الخلايا الجذعية والدراسات التجديدية والسرطانية كان محدودا بسبب التحديات التي يفرضها صغر حجم الجسم والأوعية الدموية المعقدة. للتغلب على هذه القيود ، تم استكشاف تقنيات الحقن البديلة مثل الحقن داخل القلب والحقن الرجعي الحجاجي (RO) في الماضي لزرع الخلايا الجذعية في أسماك الزرد البالغة. ومع ذلك ، فإن هذه التقنيات لها عيوبها ، بما في ذلك الحاجة إلى تقنيات الحقن الدقيقة أو زيادة خطر الوفاة.

في هذه الدراسة ، قمنا بتطوير إجراء حقن وريدي محسن ومحسن مصمم خصيصا لأسماك الزرد البالغة ، لمعالجة التحديات المرتبطة بتشريحها الفريد. لإثبات فعالية هذه التقنية ، أجرينا حقنا وريديا ناجحة لخلايا نخاع الكلى الكاملة من أسماك Tg (mpo: EGFP) وصبغة FITC-dextran في أسماك Casper البالغة. أكد التصور اللاحق للخلايا والأصباغ المحقونة باستخدام المجهر الفلوري نجاحها وتوصيلها ونقشها داخل سمك الزرد. علاوة على ذلك ، أظهرنا أنه بالمقارنة مع الحقن داخل القلب والحقن التناضحي العكسي ، أدى الحقن الوريدي إلى تحسين معدلات البقاء على قيد الحياة وكفاءة النقش في أسماك الزرد المعالجة. يتيح هذا النهج التوصيل الدقيق للمواد وتوطينها ويحمل إمكانات كبيرة لفحص الأدوية والمواد الكيميائية على نطاق واسع باستخدام أسماك الزرد البالغة. بالإضافة إلى ذلك ، توفر القدرة على تتبع الخلايا والأصباغ المحقونة بصريا رؤى لا تقدر بثمن حول نقشها وهجرتها وتفاعلاتها مع الأنسجة المضيفة ، مما يتيح تقييما أكثر شمولا للتأثيرات العلاجية والعمليات البيولوجية في نماذج أسماك الزرد.

Introduction

برزت أسماك الزرد (Danio rerio) ككائن حي نموذجي قيم في البحوث الطبية الحيوية ، ويرجع ذلك أساسا إلى تشابهها الجيني مع البشر ، حيث أن أكثر من 70٪ من الجينات البشرية لها نظائر من أسماك الزرد^1،2. هذا التشابه الجيني ، جنبا إلى جنب مع الحجم الصغير لسمك الزرد ، ودورة التطور السريعة ، والقدرة على التلاعب الجيني على نطاق واسع ، يجعلها أداة قوية للاستكشاف العلمي. هذه السمات مفيدة بشكل خاص للتجارب التي تنطوي على زرع الخلايا وتوصيل الأدوية وتتبع الخلايا. علاوة على ذلك ، فإن الوضوح البصري لليرقات الشفافة وطفرات التصبغ المحددة ، مثل أسماك الزرد Casper ، يسمح بالتصور الدقيق للخلايا أو المواد المزروعة ، مما يوفر بديلا أكثر كفاءة وفعالية من حيث التكلفة للنماذج الحيوانية التقليدية.

تستخدم أسماك الزرد على نطاق واسع لتطوير نماذج زراعة السرطان وإجراء فحوصات الأدوية للأمراض الشديدة مثل الورم الدبقي والورم الميلانيني وأورام البنكرياس وسرطان الدم^{3،4،5،6،7،8،9،10}. عادة ما تبدأ هذه النماذج في مرحلة اليرقات للاستفادة من الجهاز المناعي غير الناضج لليرقات والشفافية المتأصلة ، مما يبسط عملية الحقن ويعزز جدوى الدراسات قصيرة المدى. ومع ذلك ، فإن استخدام اليرقات يحد من مدة تقييم النقش والتدخلات العلاجية^7،11. يؤدي نقل هذه البروتوكولات التجريبية إلى أسماك الزرد البالغة إلى تحديات مثل إجراءات الحقن الأكثر تعقيدا ، وانخفاض كفاءة النقش ، وارتفاع معدلات الوفيات ، وزيادة التباين في الاستجابات الفردية. تسلط هذه التحديات الضوء على الحاجة الماسة لتحسين تقنيات الحقن وإيصال المواد ، خاصة بالنسبة للدراسات التي شملت أسماك الزرد البالغة التي تتطلب فترات مراقبة ممتدة.

تاريخيا ، كانت الحقن داخل القلب¹² والحقن الرجعية المدارية (RO)¹³ هي الطرق الأساسية لتوصيل الأدوية وزرع الخلايا في أسماك الزرد البالغة. يضمن الحقن داخل القلب ، والذي يتضمن حقن المواد مباشرة في القلب ، الدورة الدموية الجهازية الفورية للأدوية ولكنه يرتبط بمخاطر كبيرة ، بما في ذلك إصابات القلب المحتملة وارتفاع معدل الوفيات. من ناحية أخرى ، فإن حقن التناضح العكسي ، الذي يوصل المواد إلى الجيوب الأنفية الوريدية خلف العين ، يعزز أيضا التوزيع الجهازي السريع ولكنه يمكن أن يكون مرهقا للأسماك ويتطلب دقة عالية في التنفيذ¹⁴. تعتبر الحقن الوريدية ، الراسخة لتوصيل المواد الجهازية في الفئران والجرذان ، ضرورية لدراسات الحركية الدوائية ، وتقييمات فعالية الأدوية ، والتدخلات العلاجية في هذه النماذج^{15،16،17،18}. في الآونة الأخيرة ، اكتسبت الحقن الوريدية مكانة بارزة في أبحاث أسماك الزرد ، لا سيما في دراسات الاستجابات المناعية الفطرية^19،20 وإصابة الكلى الحادة²¹ في يرقات الزرد. ومع ذلك ، فإن تطبيقها في أسماك الزرد البالغة لا يزال محدودا.

في هذه الدراسة ، قمنا بتطوير وتحسين إجراء الحقن الوريدي المصمم خصيصا لأسماك الزرد البالغة ، مما يحسن بشكل كبير من معدلات البقاء على قيد الحياة والدقة وكفاءة التسليم. نوضح هذه الطريقة بصريا ونقدم بروتوكولا مفصلا باستخدام هذه التقنية المكررة. نجحنا في إجراء الحقن الوريدية لخلايا نخاع الكلى الكامل (WKM) من أسماك Tg (mpo: EGFP) وصبغة FITC-dextrann في أسماك Casper البالغة ، مع تأكيد التسليم والنقش الذي تم تقييمه بواسطة الفحص المجهري الفلوري. تظهر النتائج التي توصلنا إليها أن تقنية الحقن الوريدي المكرر أكثر كفاءة واتساقا مقارنة بالطرق التقليدية داخل القلب والتناضح العكسي مع استمرار توسع استخدام أسماك الزرد في البحث العلمي ، من المرجح أن يؤدي اعتماد تقنية الحقن الوريدي المحسنة هذه إلى تعزيز فهمنا للتسبب في المرض وتسريع تطوير مناهج علاجية جديدة.

Protocol

تمت الموافقة على جميع الإجراءات الحيوانية من قبل لجنة استخدام المختبر والبحوث (CULATR) في جامعة هونغ كونغ (HKU).

1. تحضير مواد الحقن

1. تحضير وسط تعليق الخلية: 0.9x PBS + 5٪ مصل بقري للجنين (FBS) + 1٪ بنسلين / ستربتومايسين (قلم / بكتيريا).
2. قم بتعقيم حقنة هاميلتون والإبرة المرفقة (34 جم ، طول 10 مم ، سعة 10 ميكرولتر ، انظر جدول المواد) تحت ضوء الأشعة فوق البنفسجية بطول موجي 270-280 نانومتر وفضح العناصر لمدة ساعتين.
3. تحضير براعم قطنية معقمة ووسادات رغوية ومناديل ورقية.
4. تحضير خليط التخدير عن طريق تخفيف التريكيين بماء السمك المعقم إلى تركيز نهائي يبلغ 0.2 مجم / مل.
5. لزرع خلايا WKM في أسماك كاسبر ، قبل يومين من الزرع ، قم بإعطاء جرعة تشعيع شبه مميتة تبلغ 25 غراي ، مقسمة إلى جلستين من 12.5 غراي لكل منهما ، تعطى في نفس اليوم بفاصل 7-8 ساعات بين الجرعات. لعملية التشعيع ، ضع 5-10 أسماك بالغة في طبق بتري مقاس 100 مم يحتوي على ماء السمك وقم بتعريضها في مشعاع جاما.
   ملاحظة: تم تحديد الجرعة لتكون شبه مميتة بناء على تحليل البقاء على قيد الحياة بعد تعريض أسماك كاسبر لمستويات تشعيع مختلفة تصل إلى 35 غراي ، تمت مراقبتها على مدار 30 يوما (الشكل 1 أ). يجب معايرة المدة الدقيقة للتعرض وفقا لإعدادات المشع. لا حاجة إلى تشعيع للإجراءات التي تنطوي على توصيل الدواء فقط.
6. استخدم معقم الأوتوكلاف بالبخار في المختبر لتعقيم مياه السمك المخصصة لإيواء الأسماك المعالجة (انظر جدول المواد) للوقاية من العدوى وضمان بيئة تعافي آمنة للأسماك بعد الحقن.
   ملاحظة: تم تصميم عملية التعقيم وفقا لوحدة الأوتوكلاف المحددة المستخدمة ، ونحن نلتزم بإرشادات الشركة المصنعة لتعقيم المحاليل السائلة لتحضير مياه السمك.
7. تحضير المخزن المؤقت لغسل الإبرة: عدة أنابيب من 75٪ من الإيثانول والماء عالي النقاء في أنابيب أجهزة الطرد المركزي الدقيقة سعة 1.5 مل.
8. قم بإعداد المخزن المؤقت للزرع عن طريق إذابة FITC-Dextran (الوزن الجزيئي: 10,000) في وسط تعليق الخلية المعد مسبقا (0.9x PBS مع 5٪ FBS و 1٪ قلم / بكتيريا). اضبط التركيز على 100 ميكروغرام / مل.
   ملاحظة: سيتم استخدام هذا المخزن المؤقت للحقن ، بحجم مخطط يبلغ 2 ميكرولتر لكل سمكة.

2. تحضير نخاع الكلى الكامل للزرع

1. قم بالقتل الرحيم للعدد اللازم من أسماك Tg (mpo: EGFP) عن طريق غمرها في محلول tricaine 0.4 مجم / مل ، مع ضمان بقائها في المحلول لمدة 10 دقائق على الأقل بعد توقف الحركة الجراحية.
2. قم بتشريح أسماك Tg (mpo: EGFP) لعزل ونقل نخاع الكلى (KM) إلى وسط تعليق الخلية داخل أنبوب طرد مركزي دقيق سعة 1.5 مل كما هو موضح^{سابقا 22}.
3. قم بتقسيم خلايا KM عن طريق سحب العينات وتصفية التعليق من خلال مصفاة خلية نايلون 40 ميكرومتر.
4. الطرد المركزي التعليق عند 500 × جم لمدة 8 دقائق.
5. تخلص من المادة الطافية وأعد تعليق الحبيبات في 500 ميكرولتر من وسط تعليق الخلية.
6. عد الخلايا باستخدام عداد آلي مع 10 ميكرولتر من تعليق الخلية.
7. جهاز طرد مركزي مرة أخرى عند 500 × جم لمدة 8 دقائق.
8. اضبط تركيز الخلية على 150,000 خلية/ميكرولتر باستخدام المخزن المؤقت للزرع.

3. إجراء الحقن

1. اغسل حقنة هاميلتون جيدا 3-4x مع 75٪ إيثانول قبل الحقن. اشطف المحقنة 3-4 مرات بالماء فائق النقاء لإزالة أي بقايا إيثانول.
2. قم بتخدير سمك الزرد عن طريق غمره في خليط التخدير حتى يتم تخديره بالكامل ، كما يتضح من تناقص الحركة وفقدان الاستجابات الانعكاسية. بمجرد تخدير الأسماك ، ضعها بحيث يكون جانبها الظهري متجها لأعلى ورأسها موجه إلى اليسار (الشكل 1 ب). ضع السمك بعناية على مناديل ورقية نظيفة ورطبة ، مما يساعد على تثبيتها للحقن. تأكد من أن الأنسجة رطبة بدرجة كافية لمنع الأسماك من الجفاف ، ولكنها ليست رطبة لدرجة أنها تسبب الانزلاق.
3. أمسك حقنة هاميلتون بإحكام وقم بزاوية الإبرة عند ~ 45 درجة إلى الوعاء الأساسي (الوريد الذيلي) لاستهدافها بشكل فعال مع تقليل الضرر الذي يلحق بالأنسجة المحيطة. بالنسبة لأسماك الزرد الكبرية ، استهدف جزءا من الوعاء يمكن رؤيته من خلال جسمه الشفاف لوضع الإبرة بدقة (الشكل 1 ب). بالنسبة لأسماك الزرد من النوع البري (Tubingen ، TU) ذات الجلد المصطبغ ، استهدف الأوعية الأولية التي تقع على طول محور الجسم وخلف فتحة الشرج في منطقة الأوعية الأولية (الشكل 1 ب). أدخل الإبرة برفق وسلاسة في الوعاء المخصص ، وقم بإدارة الحقن (2 ميكرولتر) ببطء لتقليل الإجهاد ، وضمان الامتصاص الأمثل للمادة ، والضغط برفق على الموقع باستخدام برعم قطني لمدة 10 ثوان للسيطرة على أي نزيف بعد الحقن.
4. راقب تحت المجهر للتأكد من وجود إشارات GFP ، مما يضمن فعالية الحقن. تأكد من ظهور الخلايا أو الأصباغ كإشارات خضراء داخل الوعاء الدموي (الشكل 2 أ).
5. اسمح للأسماك بالتعافي في ماء السمك المعقم حديثا بعد الحقن لمدة 10 دقائق حتى يتم نقلها إلى خزان ثابت.
6. نظف الإبرة كما هو موضح سابقا بين حقن الكواشف المختلفة.
7. لمنع تكتل الخلايا ، قم بنقر تعليق الخلية كل 10 دقائق لإعادة تعليق الخلايا.
8. احتفظ بحد أقصى 15 سمكة مزروعة في خزان سعة 4 لتر تحت ظروف المياه الساكنة طوال مدة العلاج. بدلا من ذلك ، قم بتخزين الأسماك المزروعة بشكل فردي في خزانات ثابتة سعة 1 لتر. جهز الخزان بمضخة أكسجين وقم بإجراء تغييرات يومية في المياه لتقليل مخاطر العدوى.
9. مراقبة وتقييم تعبير GFP عن طريق قياس التدفق الخلوي في الأسماك بعد 14 يوما تقريبا من الزرع لتقييم معدل النقش. سجل معدل الوفيات اليومي للأسماك لحساب معدلات البقاء على قيد الحياة بدقة. قم بإجراء ANOVA أحادي الاتجاه لتحليل النقش واختبار التصنيف اللوغاريتمي لتحليل البقاء على قيد الحياة.

النتائج

لتقييم فعالية ودقة طرق الحقن المختلفة في أسماك كاسبر البالغة ، تم إجراء تحليل مقارن باستخدام تقنيات داخل القلب والتناضح العكسي والوريد (الشكل 2 أ). تم حقن كميات متفاوتة من خلايا WKM من أسماك Tg (mpo: EGFP) ، كل منها مختلط بصبغة FITC-dextrann بتركيزات 1 × 10⁵

Discussion

في هذه الدراسة ، قمنا بتطوير بروتوكول حقن وريدي مصمم خصيصا لأسماك الزرد البالغة لتعزيز دقة واتساق توصيل الخلايا أو الأدوية. عنصر حاسم في هذه الطريقة هو القدرة على توطين الوريد الأساسي وتصوره ، وهو أمر بالغ الأهمية للإدارة الدقيقة للمواد. في حين يوصى باستخدام سلالة أسماك...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Autoclaves Steam Sterilizer	HIRAYAMA	HRG-140
Centrifuge 5424	Eppendorf
Countess 3 Automated Cell Counter	Thermofisher
Countess II FL	Invitrogen
Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate salt (Tricaine)	Sigma-aldrich	MKCL9483
Falcon 40 µm Cell Strainer	CORNING		Blue, Sterile, Individually Packaged, 50/Case
FBS, Qualified	Gibco	26140079
FITC-Dextran (MW 10000)	MedChemExpress	60842-46-8
Injection needle	Hamilton	HAMI207434	34 G, 10 mm length
Micro syringe	Hamilton	7635-01	10 µL capacity, Model 701 RN
Nikon SMZ18
PBS pH 7.4 (1x)	Gibco	10010023
Penicillin-Streptomycin (5,000 U/mL)	Gibco™	15070063	100x
Pipette Tips	Eppendorf	epTIPS
Single Channel Pipette	Eppendorf	05-403-151
UltraPure Distilled Water	Invitrogen	10977015