Yetişkin Zebra Balıklarında Optimize Edilmiş İntravenöz Enjeksiyon

Özet

Burada, yetişkin zebra balıklarına hücrelerin veya farmakolojik ajanların intravenöz enjeksiyonu için optimize edilmiş ve etkili bir protokol sunuyoruz, bu da hücre aşılamasının artmasına ve tedavi edilen zebra balığının hayatta kalma oranlarının artmasına neden oluyor.

Özet

İntravenöz (IV) enjeksiyon, memeli araştırma modellerinde maddelerin sistemik olarak verilmesini sağlamak için en etkili ve yaygın olarak kullanılan yöntem olarak yaygın olarak kabul edilmektedir. Bununla birlikte, yetişkin zebra balıklarında ilaç dağıtımı, kök hücre nakli ve rejeneratif ve kanser çalışmaları için uygulanması, küçük vücut boyutları ve karmaşık kan damarlarının yarattığı zorluklar nedeniyle sınırlı kalmıştır. Bu sınırlamaların üstesinden gelmek için, geçmişte yetişkin zebra balıklarında kök hücre nakli için intrakardiyak ve retro-orbital (RO) enjeksiyon gibi alternatif enjeksiyon teknikleri araştırılmıştır. Bununla birlikte, bu tekniklerin, titiz enjeksiyon tekniklerine duyulan ihtiyaç veya artan mortalite riski dahil olmak üzere dezavantajları vardır.

Bu çalışmada, benzersiz anatomileriyle ilgili zorlukları ele alan, yetişkin zebra balıklarına özel olarak uyarlanmış rafine ve optimize edilmiş bir IV enjeksiyon prosedürü geliştirdik. Bu tekniğin etkinliğini göstermek için, Tg (mpo: EGFP) balıklarından tüm böbrek iliği hücrelerinin ve FITC-dekstran boyasının yetişkin Casper balıklarına başarılı IV enjeksiyonları gerçekleştirdik. Enjekte edilen hücrelerin ve boyaların bir floresan mikroskobu kullanılarak daha sonra görselleştirilmesi, zebra balığı içinde başarılı bir şekilde verildiklerini ve aşılandıklarını doğruladı. Ayrıca, intrakardiyak ve RO enjeksiyonları ile karşılaştırıldığında, IV enjeksiyonunun tedavi edilen zebra balıklarında hayatta kalma oranlarının ve aşılama verimliliğinin artmasına neden olduğunu gösterdik. Bu yaklaşım, maddelerin hassas bir şekilde verilmesini ve lokalizasyonunu sağlar ve yetişkin zebra balığı kullanılarak büyük ölçekli ilaç ve kimyasal tarama için büyük bir potansiyele sahiptir. Ek olarak, enjekte edilen hücreleri ve boyaları görsel olarak izleme yeteneği, bunların aşılanması, göçü ve konakçı dokularla etkileşimleri hakkında paha biçilmez bilgiler sağlayarak, zebra balığı modellerinde terapötik etkilerin ve biyolojik süreçlerin daha kapsamlı bir şekilde değerlendirilmesini sağlar.

Giriş

Zebra balığı (Danio rerio), insan genlerinin %70'inden fazlasının zebra balığı muadillerine sahip olmasıyla, öncelikle insanlara olan genetik benzerliği nedeniyle biyomedikal araştırmalarda değerli bir model organizma olarak ortaya çıkmıştır ^1,2. Bu genetik benzerlik, zebra balığının kompakt boyutu, hızlı gelişim döngüsü ve kapsamlı genetik manipülasyon kapasitesi ile birleştiğinde, onu bilimsel keşif için güçlü bir araç haline getiriyor. Bu özellikler, hücre nakli, ilaç dağıtımı ve hücre izlemeyi içeren deneyler için özellikle avantajlıdır. Ayrıca, şeffaf larvaların ve Casper zebra balığı gibi spesifik pigmentasyon mutantlarının optik berraklığı, nakledilen hücrelerin veya maddelerin hassas bir şekilde görselleştirilmesine olanak tanıyarak geleneksel hayvan modellerine daha verimli ve uygun maliyetli bir alternatif sunar.

Zebra balığı, kanser nakli modelleri geliştirmek ve gliom, melanom, pankreas tümörleri ve lösemi gibi ciddi hastalıklar için ilaç taramaları yapmak için yaygın olarak kullanılmaktadır 3,4,5,6,7,8,9,10. Tipik olarak, bu modeller, larvaların olgunlaşmamış bağışıklık sisteminden ve doğal şeffaflığından yararlanmak için larva aşamasında başlatılır, bu da enjeksiyon sürecini basitleştirir ve kısa süreli çalışmaların fizibilitesini artırır. Bununla birlikte, larvaların kullanılması, aşılama ve terapötik müdahalelerin değerlendirilmesi için süreyi sınırlar ^7,11. Bu deneysel protokollerin yetişkin zebra balıklarına geçişi, daha karmaşık enjeksiyon prosedürleri, düşük aşılama verimliliği, daha yüksek ölüm oranları ve bireysel tepkilerde artan değişkenlik gibi zorluklar ortaya çıkarmaktadır. Bu zorluklar, özellikle uzun gözlem süreleri gerektiren yetişkin zebra balıklarını içeren çalışmalar için, gelişmiş enjeksiyon ve madde verme tekniklerine olan kritik ihtiyacı vurgulamaktadır.

Tarihsel olarak, intrakardiyak¹² ve retro-orbital (RO) enjeksiyonlar¹³, yetişkin zebra balıklarında ilaç dağıtımı ve hücre nakli için birincil yöntemler olmuştur. Maddelerin doğrudan kalbe enjekte edilmesini içeren intrakardiyak enjeksiyon, ilaçların hemen sistemik dolaşımını sağlar, ancak potansiyel kardiyak yaralanma ve yüksek mortalite dahil olmak üzere önemli risklerle ilişkilidir. Öte yandan, materyalleri gözün arkasındaki venöz sinüse ileten RO enjeksiyonu da hızlı sistemik dağılımı teşvik eder, ancak balıklar için stresli olabilir ve uygulamada yüksek hassasiyet gerektirir¹⁴. Farelerde ve sıçanlarda sistemik madde dağıtımı için iyi bilinen IV enjeksiyonları, bu modellerde farmakokinetik çalışmalar, ilaç etkinlik değerlendirmeleri ve terapötik müdahaleler için çok önemlidir 15,16,17,18. Son zamanlarda, zebra balığı araştırmalarında, özellikle larva zebra balıklarında doğuştan gelen bağışıklık tepkileri^19,20 ve akut böbrek hasarı²¹ çalışmalarında IV enjeksiyonları önem kazanmıştır. Bununla birlikte, yetişkin zebra balıklarındaki uygulamaları sınırlı kalmaktadır.

Bu çalışmada, hayatta kalma oranlarını, hassasiyeti ve teslimat verimliliğini önemli ölçüde artıran, yetişkin zebra balıkları için özel olarak tasarlanmış bir IV enjeksiyon prosedürü geliştirdik ve optimize ettik. Bu yöntemi görsel olarak gösteriyoruz ve bu rafine tekniği kullanarak ayrıntılı bir protokol sunuyoruz. Tg (mpo: EGFP) balıklarından ve FITC-dekstran boyasından elde edilen tüm böbrek iliği (WKM) hücrelerinin IV enjeksiyonlarını yetişkin Casper balıklarına başarıyla uyguladık ve floresan mikroskobu ile değerlendirilen doğum ve aşılama onayı ile uygulandı. Bulgularımız, rafine IV enjeksiyon tekniğinin geleneksel intrakardiyak ve RO yöntemlerine kıyasla daha verimli ve tutarlı olduğunu göstermektedir. Zebra balığının bilimsel araştırmalarda kullanımı genişlemeye devam ettikçe, bu geliştirilmiş IV enjeksiyon tekniğinin benimsenmesi, hastalık patogenezi anlayışımızı geliştirecek ve yeni terapötik yaklaşımların geliştirilmesini hızlandıracaktır.

Protokol

Tüm hayvan prosedürleri, Hong Kong Üniversitesi'ndeki (HKU) Laboratuvar ve Araştırma Hayvanları Kullanım Komitesi (CULATR) tarafından onaylandı.

1. Enjeksiyon malzemesinin hazırlanması

1. Hücre süspansiyon ortamını hazırlayın: 0.9x PBS +% 5 fetal sığır serumu (FBS) +% 1 penisilin / streptomisin (Kalem / Strep).
2. Hamilton şırıngasını ve takılı iğneyi (34 G, 10 mm uzunluk, 10 μL kapasite, Malzeme Tablosuna bakınız) 270-280 nm dalga boyuna sahip UV ışığı altında sterilize edin ve öğeleri 2 saat boyunca maruz bırakın.
3. Sterilize edilmiş pamuklu çubuklar, köpük pedler ve kağıt mendil hazırlayın.
4. Trikiyi sterilize edilmiş balık suyuyla 0.2 mg / mL'lik bir nihai konsantrasyona seyrelterek anestezi karışımını hazırlayın.
5. Casper balıklarında WKM hücrelerinin nakli için, transplantasyondan 2 gün önce, her biri 12.5 Gy'lik iki seansa bölünmüş, aynı gün dozlar arasında 7-8 saatlik bir aralıkla verilen 25 Gy'lik bir subletal ışınlama dozu uygulayın. Işınlama işlemi için, 5-10 yetişkin balığı balık suyu içeren 100 mm'lik bir Petri kabına koyun ve bir gama ışınlayıcıya maruz bırakın.
   NOT: Casper balıklarını 30 gün boyunca izlenen 35 Gy'ye kadar çeşitli ışınlama seviyelerine maruz bıraktıktan sonra hayatta kalma analizine dayalı olarak dozun öldürücü olmadığı belirlenmiştir (Şekil 1A). Tam maruz kalma süresi, ışınlayıcının ayarlarına göre kalibre edilmelidir. Sadece ilaç verilmesini içeren işlemler için ışınlamaya gerek yoktur.
6. Enfeksiyonları önlemek ve enjeksiyon sonrası balıklar için güvenli bir iyileşme ortamı sağlamak için tedavi edilmiş balıkları barındırmaya yönelik balık suyunu sterilize etmek için bir laboratuvar otoklav buhar sterilizatörü kullanın ( Malzeme Tablosuna bakınız).
   NOT: Sterilizasyon işlemi, kullanılan özel otoklav ünitesine göre uyarlanmıştır ve balık suyunu hazırlamak için üreticinin sıvı çözeltileri otoklavlama yönergelerine bağlı kalıyoruz.
7. İğne yıkama tamponu hazırlayın: 1,5 mL mikrosantrifüj tüplerinde birkaç tüp% 75 etanol ve ultra saf su.
8. FITC-Dekstran'i (Molekül Ağırlığı: 10.000) önceden hazırlanmış hücre süspansiyon ortamında (% 5 FBS ve% 1 Pen / Strep ile 0.9x PBS) çözerek transplantasyon tamponu hazırlayın. Konsantrasyonu 100 μg/mL'ye ayarlayın.
   NOT: Bu tampon, balık başına 2 μL planlanan hacimle enjeksiyonlar için kullanılacaktır.

2. Transplantasyon için tüm böbrek iliğinin hazırlanması

1. Gerekli sayıda Tg (mpo: EGFP) balığı 0.4 mg / mL trikat çözeltisine batırarak ötenazi yapın ve operküler hareketin kesilmesini takiben en az 10 dakika boyunca çözelti içinde kalmalarını sağlayın.
2. Böbrek iliğini (KM) daha önce tarif edildiği gibi 1.5 mL'lik bir mikrosantrifüj tüpü içinde hücre süspansiyon ortamına izole etmek ve aktarmak için Tg (mpo: EGFP) balığını inceleyin²².
3. Süspansiyonu 40 μm'lik bir naylon hücre süzgecinden pipetleyerek ve filtreleyerek KM hücrelerini ayırın.
4. Süspansiyonu 500 × g'da 8 dakika santrifüjleyin.
5. Süpernatanı atın ve peleti 500 μL hücre süspansiyon ortamında yeniden süspanse edin.
6. Hücre süspansiyonunun 10 μL'lik bir alikotu olan otomatik bir sayaç kullanarak hücreleri sayın.
7. 500 × g'da tekrar 8 dakika santrifüjleyin.
8. Transplantasyon tamponunu kullanarak hücre konsantrasyonunu 150.000 hücre / μL'ye ayarlayın.

3. Enjeksiyon prosedürü

1. Enjeksiyondan önce Hamilton şırıngasını 3-4x'i %75 etanol ile iyice yıkayın. Etanol kalıntısını gidermek için şırıngayı 3-4x ultra saf suyla durulayın.
2. Zebra balıklarına, tamamen uyuşturulana kadar anestezi karışımına daldırarak anestezi uygulayın, bu da hareketin azalması ve refleks tepkilerinin kaybı ile kanıtlanmıştır. Balıklar sakinleştirildikten sonra, sırt tarafları yukarı bakacak ve başları sola bakacak şekilde konumlandırın (Şekil 1B). Balıkları dikkatlice temiz, nemli kağıt mendil üzerine koyun, bu da onları enjeksiyon için stabilize etmeye yardımcı olacaktır. Balığın kurumasını önlemek için dokunun yeterince nemli olduğundan, ancak kaymaya neden olacak kadar ıslak olmadığından emin olun.
3. Hamilton şırıngasını sıkıca kavrayın ve çevredeki dokulara verilen zararı en aza indirirken etkili bir şekilde hedeflemek için iğneyi birincil damara (kaudal damar) ~ 45 ° açıyla açın. Capser zebra balığı için, doğru iğne yerleşimi için damarın yarı saydam gövdesinden görülebilen bir bölümünü hedefleyin (Şekil 1B). Pigmentli deriye sahip vahşi tip zebra balığı (Tübingen, TU) için, birincil damarların bulunduğu bölgede, vücut ekseni boyunca ve anüsün arkasında bulunan birincil damarları hedefleyin (Şekil 1B). İğneyi belirlenen kaba nazikçe ve düzgün bir şekilde yerleştirin, stresi en aza indirmek için enjeksiyonu (2 μL) yavaşça uygulayın, maddenin en iyi şekilde alınmasını sağlayın ve enjeksiyondan sonra herhangi bir kanamayı kontrol etmek için bir pamuklu çubukla bölgeye 10 saniye boyunca hafif bir baskı uygulayın.
4. Enjeksiyonun etkinliğini sağlamak için GFP sinyallerinin varlığını doğrulamak için mikroskop altında gözlemleyin. Hücrelerin veya boyaların damar içinde yeşil sinyaller olarak göründüğünü onaylayın (Şekil 2A).
5. Enjeksiyondan sonra balığın taze sterilize edilmiş balık suyunda statik bir tanka aktarılana kadar 10 dakika iyileşmesine izin verin.
6. Farklı reaktiflerin enjeksiyonları arasında iğneyi daha önce tarif edildiği gibi temizleyin.
7. Hücre topaklanmasını önlemek için, hücreleri yeniden askıya almak için hücre süspansiyonunu her 10 dakikada bir hafifçe vurun.
8. Tedavi süresi boyunca statik su koşulları altında 4 L'lik bir tankta en fazla 15 nakledilen balık bulundurun. Alternatif olarak, nakledilen balıkları ayrı ayrı 1 L'lik statik tanklarda barındırın. Depoyu bir oksijen pompası ile donatın ve enfeksiyon riskini en aza indirmek için günlük su değişimleri yapın.
9. Aşılama oranını değerlendirmek için transplantasyondan yaklaşık 14 gün sonra balıklarda akış sitometrisi ile GFP ekspresyonunu izleyin ve değerlendirin. Hayatta kalma oranlarını doğru bir şekilde hesaplamak için balıkların günlük ölüm oranını kaydedin. Aşılama analizi için tek yönlü ANOVA ve sağkalım analizi için Log-rank testi gerçekleştirin.

Sonuçlar

Yetişkin Casper balıklarında farklı enjeksiyon yöntemlerinin etkinliğini ve hassasiyetini değerlendirmek için intrakardiyak, RO ve IV teknikleri kullanılarak karşılaştırmalı bir analiz yapılmıştır (Şekil 2A). Tg (mpo: EGFP) balıklarından değişen miktarlarda WKM hücreleri enjekte edildi, her biri 1 × 10⁵ ve 3 × 10⁵ hücre konsantrasyonlarında FITC-dekstran boya ile karıştırıldı. Her yönt...

Tartışmalar

Bu çalışmada, hücrelerin veya ilaçların verilmesinin hassasiyetini ve tutarlılığını artırmak için yetişkin zebra balığı için özel olarak hazırlanmış bir IV enjeksiyon protokolü geliştirdik. Bu yöntemin kritik bir unsuru, maddelerin doğru bir şekilde uygulanması için çok önemli olan birincil damarı lokalize etme ve görselleştirme yeteneğidir. Optimum gemi görünürlüğü için yarı saydam Casper zebra balığı türü tavsiye edilirken, proto...

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
Autoclaves Steam Sterilizer	HIRAYAMA	HRG-140
Centrifuge 5424	Eppendorf
Countess 3 Automated Cell Counter	Thermofisher
Countess II FL	Invitrogen
Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate salt (Tricaine)	Sigma-aldrich	MKCL9483
Falcon 40 µm Cell Strainer	CORNING		Blue, Sterile, Individually Packaged, 50/Case
FBS, Qualified	Gibco	26140079
FITC-Dextran (MW 10000)	MedChemExpress	60842-46-8
Injection needle	Hamilton	HAMI207434	34 G, 10 mm length
Micro syringe	Hamilton	7635-01	10 µL capacity, Model 701 RN
Nikon SMZ18
PBS pH 7.4 (1x)	Gibco	10010023
Penicillin-Streptomycin (5,000 U/mL)	Gibco™	15070063	100x
Pipette Tips	Eppendorf	epTIPS
Single Channel Pipette	Eppendorf	05-403-151
UltraPure Distilled Water	Invitrogen	10977015