تقييم الهيمنة الاجتماعية في نماذج الفئران باستخدام اختبار الأنبوب

Summary

يصف هذا البروتوكول فحصا سلوكيا لتقييم الهيمنة الاجتماعية في القوارض باستخدام اختبار الأنبوب. تظل الهيمنة الاجتماعية مستقرة بمرور الوقت ، وتظهر العديد من نماذج الاضطرابات التنموية والعصبية تشوهات قوية في الهيمنة الاجتماعية. لذلك ، يعمل اختبار الأنبوب كمقياس مناسب للنتائج للدراسات الميكانيكية أو الفحص العلاجي قبل السريري.

Abstract

تتغير الهيمنة الاجتماعية في الأمراض النمائية العصبية والتنكسية العصبية وتعمل كمقياس مفيد للنتائج في الدراسات قبل السريرية لهذه الاضطرابات. اختبار الأنبوب هو اختبار سلوكي بسيط لتقييم الهيمنة الاجتماعية التي لا تتطلب معدات باهظة الثمن. في هذا الاختبار ، يدخل فأران طرفي نقيض من أنبوب بلاستيكي شفاف ، وبعد الالتقاء في المنتصف ، يجب على أحدهما (الأقل هيمنة) التراجع. يمكن استخدام اختبار الأنبوب لكل من الفئران من الذكور والإناث ويتضمن العديد من المعلمات القابلة للتكيف لتناسب احتياجات المحقق. يمكن اختبار الفئران ضد العديد من المعارضين الفريدين لتوفير مؤشر للهيمنة الاجتماعية. تظل الهيمنة الاجتماعية في اختبار الأنبوب مستقرة على الاختبارات المتكررة وترتبط بالأداء في المقايسات الاجتماعية الأخرى. بالإضافة إلى ذلك ، يمكن إجراء الاختبار بين زملائه في القفص لتقييم التسلسلات الهرمية للهيمنة الاجتماعية داخل القفص. يعد اختبار الأنبوب مفيدا بشكل خاص في الدراسات العلاجية قبل السريرية ، لأنه يتيح الاختبار الطولي قبل وبعد التدخلات التجريبية. لذلك ، فهو بمثابة مقياس مناسب للنتائج للدراسات الميكانيكية والفحص العلاجي قبل السريري.

Introduction

يعد اضطراب السلوك الاجتماعي سمة من سمات العديد من الاضطرابات البشرية ، بما في ذلك اضطرابات النمو والنفسية والتنكسية العصبية^1،2. تستخدم نماذج الفئران لاكتساب نظرة ثاقبة للتسبب في هذه الاضطرابات ولتوفير منصة للاختبار قبل السريري للعلاجات. ومع ذلك ، فإن العديد من المقايسات للسلوك الاجتماعي للفأر تستغرق وقتا طويلا ، وتتطلب معدات باهظة الثمن و / أو برامج تتبع الفيديو لتحليلها ، أو لديها خوارزميات تسجيل ذاتية. في المقابل ، فإن اختبار الأنبوب للهيمنة الاجتماعية سريع وبسيط الأداء ولا يتطلب أي معدات متخصصة أو تتبع فيديو. يحتوي الاختبار على نتيجة ثنائية للفوز / الخسارة ، مما يجعل تفسير النتائج واضحا.

تم تطوير اختبار الأنبوب للهيمنة الاجتماعية من قبل Lindzey وزملاؤه في محاولة لتقييم الهيمنة الاجتماعية في الفئران³. منذ تطويره ، تم إنشاء اختبار الأنبوب أيضا كطريقة لتقييم التسلسلات الهرمية للهيمنة الاجتماعية داخل القفص⁴. ترتبط الأنماط الظاهرية لاختبار الأنبوب بمقاييس أخرى للهيمنة الاجتماعية مثل الحلاقة ومنافسة المكافآت وصنع البول في ذكور^{الفئران 5}. ومع ذلك ، هناك نتائج مختلطة لاختبار الأنبوب وارتباطه بالمنافسة على الوصول إلى الغذاء والماء والعدوان^3،6،7. الأهم من ذلك ، أن الأنماط الظاهرية لاختبار الأنبوب ترتبط بالأنماط الظاهرية الاجتماعية الأخرى مثل التواصل الاجتماعي ثلاثي الغرف^8،9.

تتمثل إحدى مزايا اختبار الأنبوب في أن تشريحه محدد جيدا ، مما يجعله مفيدا بشكل خاص في نماذج الفئران المختلفة ، بما في ذلك نماذج اضطرابات طيف التوحد والأمراض الأخرى التي تتميز بالعجز الاجتماعي مثل الخرف الجبهي الصدغي^{8،9،10،11،12،13،14،15،16}. قشرة الفص الجبهي الإنسي (mPFC) هي وسيط رئيسي لسلوك اختبار أنبوب الفأر⁶. أظهر وانغ وزملاؤه أن النشاط في mPFC يدفع الهيمنة الاجتماعية في الفئران⁶ ، وقد صقلت البيانات الحديثة هذه البصيرة من خلال إظهار أن مدخلات المهاد الوسيط في القشرة الحزامية قبل الحوفية والأمامية تدفع الهيمنة الاجتماعية¹⁷. تمشيا مع الدور الرئيسي ل mPFC في اختبار الأنبوب الهيمنة الاجتماعية ، والتشوهات في العرش المتغصنة ، والعمود الفقري المتغصني ، ومستقبلات الغلوتامات ، و / أو الاستثارة العصبية ، ارتبط mPFC بتشوهات اختبار الأنبوب في نماذج القوارض لاضطرابات طيف التوحد^15،18 ، والخرف الجبهي الصدغي^8،19 ، والإجهاد المزمن²⁰ ، والعزلة الاجتماعية²¹.

ميزة رئيسية أخرى لاختبار الأنبوب هي القدرة على اختبار الهيمنة الاجتماعية قبل وبعد التدخل العلاجي ، حيث أن الهيمنة الاجتماعية للفأر في اختبار الأنبوب مستقرة بمرور الوقت ، مما يسمح بالاختبار المتكرر قبل وبعد التدخل التجريبي^6،8،22،23. أحد الأمثلة على ذلك يأتي من نماذج الفئران البروگرانولين متغايرة الزيجوت (Grn ^+/-) للخرف الجبهي الصدغي الناجم عن طفرات البروگرانولين (GRN) ، وهو مرض نقص الفرسان. الفئران البروجرانولين متغايرة الزيجوت لديها عجز في الهيمنة الاجتماعية⁸. يمكن عكس هذا العجز في اختبار الأنبوب عن طريق استعادة البروجرالينين إما بالعلاج الجيني AAV-progranulin²² ، أو إعطاء الأجسام المضادة المضادة للسورتيلين المصممة لتقليل تحلل البروجرالينين²³. توضح هذه الأمثلة فائدة اختبار الأنبوب في تصميم التجارب قبل السريرية للأبحاث المتعلقة بالخرف.

يوفر هذا البروتوكول طرقا أساسية لإجراء اختبار الأنبوب بين غير المزارعين لتقييم الاختلافات بين المجموعات التجريبية ، وبين المجموعات التجريبية لتقييم التسلسلات الهرمية للهيمنة الاجتماعية داخل القفص.

Protocol

تمت الموافقة على جميع الإجراءات التجريبية من قبل اللجنة المؤسسية لرعاية واستخدامها بجامعة ألاباما في برمنغهام وتم إجراؤها وفقا لجمعية تقييم واعتماد رعاية المختبر (AAALAC). تم إنشاء الفئران غير متغايرة الزيجوت من البروگرانولين وعبورها على خلفية C57BL / 6J كما هو موضح^{سابقا 9}. تم إعادة الفئران المستخدمة في هذه الدراسة إلى خلفية C57BL / 6J على مدى 12 جيلا على الأقل. تم استخدام الفئران التي تتراوح أعمارها بين 9 و 16 شهرا في بيانات العينة. تم استخدام كل من الذكور والإناث في هذه الدراسة. تم الاحتفاظ بالفئران في دورة إضاءة / ظلام 12:12 ساعة مع إضاءة الأضواء في الساعة 06:00 ، وتم إجراء جميع الاختبارات خلال مرحلة الضوء. تم منح الفئران إمكانية الوصول إلى الطعام والماء خلال جميع التجارب. تفاصيل الكواشف والمعدات المستخدمة مدرجة في جدول المواد.

1. تصميم مطابقة اختبار الأنبوب

1. خطط لمباريات اختبار الأنبوب قبل الاختبار. تأكد من عدم وجود ملاحظة للنمط الجيني لإبقاء المجرب أعمى عن المجموعات (انظر الجدول التكميلي 1).
   ملاحظة: عادة ما نختبر الفئران ضد 3 خصوم فريدين من المجموعة التجريبية المعاكسة^8،9،22،23 ، لكن بعض الدراسات تشير إلى إجراء اختبار ضد المزيد من المعارضين^10،11،13.
2. موازنة تعيين الفئران التجريبية على الجانبين الأيسر والأيمن من الأنبوب لتجنب أي آثار مربكة محتملة للتحيز الجانبي.
3. عند اختبار غير الأقفاص ، قلل من حركة الأقفاص لتجنب إجهاد الفئران أكثر من اللازم. لتقليل حركة القفص ، تداخل المباريات بين نفس القفصين قدر الإمكان.
4. عند اختبار رفقاء القفص ، اختبر كل فأر من قفص ضد كل فأر آخر بطريقة مستديرة. في حالة تكرار الاختبار على مدى عدة أيام ، يجب تبديل جانب الأنبوب الذي تم تعيين الماوس لإدخاله (أي اليسار أو اليمين) من يوم لآخر.

2. اختيار الأنابيب

ملاحظة: عادة ما يتم إجراء اختبار الأنبوب باستخدام أنابيب بلاستيكية شفافة متوفرة تجاريا مصنوعة من PVC (انظر جدول المواد). من المهم ملاحظة أن هذا البروتوكول محسن للفئران ولكن يمكن تطبيقه على نماذج القوارض الأخرى مثل الفئران والفئران والهامستر².

1. قطع الأنابيب البلاستيكية بطول 30.5 سم ، وتتميز الأنابيب البلاستيكية بالمرونة قليلا وغالبا ما يتم تخزينها على شكل لفات ، لذلك قد تحتاج إلى تقويمها قبل الاستخدام. سيساعد التسخين الخفيف على تقويم الأنابيب المنحنية.
2. القطر الداخلي للأنبوب أمر بالغ الأهمية لنجاح الاختبار. تأكد من أن الأنبوب كبير بما يكفي لتحرك الفئران ، ولكنه ليس كبيرا بما يكفي للسماح للفئران بالعبور فوق بعضها البعض.
   ملاحظة: لن ينجح الاختبار إذا كان الأنبوب كبيرا بما يكفي بحيث يمكن للفئران اجتياز بعضها البعض دون الانخراط في مسابقة الهيمنة الاجتماعية. فيما يلي إرشادات تقريبية لأحجام الأنابيب المناسبة في الفئران C57BL / 6J: (1) 1 بوصة / 2.5 سم القطر الداخلي (ID) للفئران الذكور <6 أشهر ، إناث الفئران <9 أشهر ؛ (2) معرف 1.25 بوصة / 3.2 سم للفئران الذكور الذين تتراوح أعمارهم بين 6-9 أشهر ، إناث الفئران >9 أشهر ؛ و (3) 1.5 بوصة / 3.5 سم للفئران الذكور >9 أشهر.
3. إذا أمكن ، استخدم أنبوبا من نفس الحجم لجميع الاختبارات داخل مجموعة من الفئران. إذا عبرت الفئران خلال المباريات القليلة الأولى ، فقم بتشغيل جميع المباريات اللاحقة باستخدام الأنبوب الأصغر التالي.

3. موقع الاختبار

1. قم بإجراء اختبار الأنبوب على أي سطح مستو ومستقر أو غطاء مفلتر تحت الإضاءة المحيطة.
   ملاحظة: يتم إجراء الاختبار عادة خلال النهار بين الساعة 8 صباحا و 5 مساء. في الحالات التي يتم فيها اختبار الفئران على مدار عدة أيام ، يجب اختبار كل فأر خلال نفس الوقت من اليوم لكل اختبار (على سبيل المثال ، بين الساعة 11 صباحا و 3 مساء). على حد علمنا ، لم تتم دراسة تأثيرات الوقت من اليوم من قبل.
2. قم بإجراء اختبار الأنبوب في مكان هادئ مع الحد الأدنى من المحفزات الخارجية. من الناحية المثالية ، يجب أن يكون المحقق هو الشخص الوحيد في الغرفة.

4. التعود

1. التعود هو ممارسة مهمة في المقايسات السلوكية التي تسمح للفئران بالتعرف على بيئة الاختبار ، مما قد يؤدي إلى نتائج أكثر اتساقا وموثوقية²⁴. بالنسبة لاختبار الأنبوب ، تأقلم الفئران مع غرفة الاختبار قبل الاختبار. إذا لم يتم إجراء الاختبار في غرفة سكن ، فاسمح للفئران لمدة ساعة على الأقل بالتعود على الغرفة الجديدة قبل الاختبار.
2. (اختياري) إذا رغبت في ذلك ، قد تعتاد الفئران على الأنبوب قبل الاختبار. للتعود على الأنبوب ، ضع الماوس في الأنبوب بدون خصم واتركه يعبر الأنبوب 2-3 مرات ، قبل 2-3 أيام من الاختبار. هذه ليست ممارستنا المعتادة.

5. اختبار الأنبوب القياسي

ملاحظة: (اختياري) قد يرغب الباحثون الجدد في اختبار الأنبوب في التدرب على وضع الفئران في الأنبوب باستخدام مجموعة منفصلة غير تجريبية من الفئران. غالبا ما يحتاج المحققون إلى التدرب على وضع الفئران في الأنبوب. سيؤدي المحقق المتمرس إلى تقليل الضغط على الفئران التي تخضع للاختبار. يتم تقديم مزيد من المعلومات حول وضع الفئران في الأنبوب في الخطوة 5.3.

1. ضع جميع الأقفاص التي تحتوي على فئران من نفس الجنس لاختبارها على عربة. أقفاص النقل إلى منطقة الاختبار. نظف الأنابيب ومنطقة الاختبار باستخدام 2٪ كلورهيكسيدين متبوعا بنسبة 70٪ إيثانول. يتم تنظيف الأنابيب بسهولة باستخدام ماصة مصلية سعة 50 مل عن طريق دفع منشفة ورقية عبر الأنبوب.
2. ضع القفصين للمباراة الأولى على سطح الاختبار. قم بإزالة الأغطية وضعها بجوار كل قفص.
3. حدد موقع الفأرين المراد اختبارهما. أمسك فأرة واحدة في كل يد ، بما يتوافق مع الجانب المخصص لها من الأنبوب. بعد العثور على الماوس الأول ، أمسك ذيله برفق واحتفظ به في القفص أثناء البحث عن الثاني.
   ملاحظة: إن إمساك ذيل الماوس بالقرب من مركز طوله سيسمح للمحقق بالتحكم في الماوس برفق دون تقييده بإحكام شديد. أمسك الماوس بحيث تظل جميع كفوفه الأربعة على فراش القفص لتجنب الضغط على الماوس دون داع.
4. قم بإزالة كلا الفئران في نفس الوقت من كل قفص وضعها برفق مع رؤوسهم عند مدخل الأنبوب.
   ملاحظة: إذا كانت الفئران معتادة أو لديها خبرة سابقة في الاختبار ، فإنها عادة ما تدخل الأنبوب في غضون ثوان قليلة. إذا كانت الفئران ساذجة بالنسبة للأنبوب ، فقد تكون مترددة في الدخول في التجربة الأولى. إذا لزم الأمر ، يمكن تحويل الفئران إلى ثاني أكبر أنبوب لتشجيع دخول الأنبوب.
5. حافظ على قبضة ذيل كل فأر لمنع الفئران من الاتصال قبل الأوان. تأكد من عدم إجبار الفئران على الدخول إلى الأنبوب. ومع ذلك ، بمجرد أن يبدأوا في دخول الأنبوب ، قد يتم دفعهم برفق لتشجيع الدخول الكامل إلى الأنبوب.
6. عندما يدخل كلا الفئران إلى الأنبوب ، حرر ذيولهما وابتعد عن الأنبوب (الشكل 1 أ). يجب أن يتقدم كلا الفأرين إلى الأنبوب ويلتقيان بالقرب من المركز (الشكل 1 ب).
   1. راقب المباراة وسجل الفائز والخاسر. يعتبر الماوس قد فقد المباراة عندما يخرج اثنان من كفوفه من الأنبوب ويلامسون سطح الاختبار (الشكل 1 ج).
      ملاحظة: عادة ما يدفع أحد الماوس الآخر من الأنبوب ، على الرغم من أن بعض الفئران ستقوم بتراجع غير قسري بعد الاتصال بفأر الخصم. من حين لآخر ، يتراجع كلا الفأران في وقت واحد ، أو يتراجع فأر واحد فور دخوله الأنبوب دون الاتصال بفأر الخصم. في حالة حدوث أي من هذين الحدثين ، ضع كلا الفئران مرة أخرى في الأنبوب وأعد بدء المباراة. عادة ما تقوم الفئران بإجراء مباراة قياسية أكثر في المحاولة الثانية. إذا لم يتراجع أي من الماوس في غضون دقيقتين ، فقم بإجهاض المباراة وتشغيلها مرة أخرى في نهاية الجلسة.
7. بعد انتهاء المباراة ، أعد الفئران إلى أقفاص منزلها. نظف الأنبوب وسطح الاختبار بنسبة 70٪ من الإيثانول.
8. استمر في تشغيل المباريات باستخدام التصميم الموضح في الخطوة 1. تبدأ كل جولة مباشرة بعد الجولة السابقة. عندما يتم تشغيل جميع المباريات من جنس واحد ، أعد الأقفاص إلى الرف / العربة واختبر الفئران من الجنس الآخر باستخدام نفس الإجراء.
   1. قم بتنظيف سطح الاختبار والأنابيب جيدا بين الفئران الإناث والذكور الجارية. بعد اكتمال الاختبار ، قم بتنظيف كل من الأنابيب ومنطقة الاختبار باستخدام 2٪ كلورهيكسيدين.
9. للتحليل الإحصائي ، احسب عدد الانتصارات لكل مجموعة وحللها باستخدام الاختبار ذي الحدين لمقارنة التوزيع المرصود مقابل التوزيع المتوقع ، مع تعيين التوزيع المتوقع عند 50٪ من المكاسب لكل مجموعة.
   1. احسب النسبة المئوية للفوز لكل ماوس بقسمة عدد الانتصارات على عدد المباريات (عادة ثلاث مباريات ما لم يتم إلغاء المباراة بسبب فقدان الماوس أو مشكلات أخرى). قارن النسبة المئوية للفوز لكل مجموعة باستخدام اختبار مان ويتني.
      ملاحظة: إذا تكررت هذه التطابقات ، فإنها تؤدي إلى نتائج مماثلة في حالة عدم وجود معالجات تجريبية إضافية. على سبيل المثال ، لاحظت دراسة سابقة أن 40 من أصل 47 مباراة أسفرت عن نفس النتيجة عند تشغيلها في أيام^{متتالية 8}.

6. اختبار الأنبوب داخل القفص لتقييم التسلسلات الهرمية للهيمنة الاجتماعية

ملاحظة: تشكل الفئران تسلسلات هرمية مستقرة للهيمنة الاجتماعية يمكن الكشف عنها عن طريق اختبار أنبوب روبن المستدير لجميع الفئران داخل قفص^4،6. يشكل كل من الفئران من الذكور والإناث هذه التسلسلات^{الهرمية 8}. من الأفضل تقييم التسلسلات الهرمية للهيمنة الاجتماعية في أقفاص تحتوي على 5 فئران على الأقل.

1. خطط للمباريات مسبقا، مع الموازنة كما هو موضح في الخطوة 1.
2. قم بتشغيل مطابقات اختبار الأنبوب كما هو موضح في الخطوة 5. اختبر قفصا واحدا في كل مرة واختبر جميع الفئران بطريقة مستديرة. نظف الأنبوب ومنطقة الاختبار بنسبة 70٪ من الإيثانول بين كل مباراة.
3. اختبر كل قفص مرة واحدة يوميا لمدة 5 أيام على الأقل لإنشاء أوامر الرتب المستقرة لكل فأر.
4. للتحليل الإحصائي ، قم بتقييم عدد الانتصارات لكل ماوس. رتب كل فأرة حسب عدد الانتصارات.

7. استخدام اختبار الأنبوب للفحص العلاجي قبل السريري

ملاحظة: إن متانة واستقرار الأنماط الظاهرية للهيمنة الاجتماعية في العديد من نماذج الفئران ، بالإضافة إلى سهولة إجراء اختبار الأنبوب ، تجعل اختبار الأنبوب نموذجا مفيدا للاختبار قبل السريري للاستراتيجيات العلاجية. لهذا ، يمكن إجراء اختبار الأنبوب باستخدام تصميم داخل ، حيث يمكن إجراء الاختبار بشكل متسلسل. من الممكن أيضا القيام بتصميم متقاطع مع الدواء ، ثم التحكم أو العكس. تم استخدام اختبار الأنبوب سابقا لتقييم العلاجات المعززة للبروجرانولين في الفئران ^{Grn +/- 22،23} ، مما أظهر أن الأنماط الظاهرية للهيمنة الاجتماعية قابلة للعكس في نموذج الفأر هذا. لتوضيح المناقشة أدناه ، سيتم وصف الفئران بأنها "تحكم" (من النوع البري ، وغير المعدلة وراثيا ، وما إلى ذلك) أو "نموذج" (بالضربة القاضية ، المعدلة وراثيا ، وما إلى ذلك) ، وسيتم وصف التدخلات التجريبية بأنها إما "مركبة" أو "معالجة" (تدخل علاجي). بينما يشار إلى الفئران باسم "التحكم" و "النموذج" أدناه ، فمن المثالي استخدام زملاء القمامة لكل مجموعة من هذه المجموعات.

1. قبل التدخل التجريبي ، قم بإجراء اختبار مسبق لتأكيد وجود النمط الظاهري للهيمنة الاجتماعية المتوقعة في الفئران النموذجية لاستخدامها في الاختبار. اختبر المجموعة الكاملة من الفئران الضابطة والنموذجية ضد بعضها البعض واستخدم هذه البيانات لتعيين الفئران لمجموعات العلاج لضمان توازن المجموعات عند خط الأساس.
2. قد تكون هناك حاجة إلى فترات مختلفة من العلاج بناء على العلاج. على سبيل المثال ، إذا كان الدواء عبارة عن AAV ، فاسمح للفئران بالتعافي من الجراحة والحصول على وقت حتى يصبح الدواء ساري المفعول. إذا كان الدواء عبارة عن جزيء صغير ، فحدد نماذج العلاج قبل اختبار الأنبوب²².
3. قم بتعيين الفئران لمجموعات تجريبية بحيث يكون للفئران المعالجة والمعالجة من كل نمط وراثي أنماط ظاهرية للهيمنة الاجتماعية الأساسية بدرجة مماثلة. إذا تم اختبار الفئران عدة مرات ضد العديد من الخصوم ، فيمكن استخدام النسبة المئوية للفوز لكل فأر (الموضحة في الخطوة 5.9) لإنشاء مجموعتين لهما أنماط ظاهرية متشابهة.
   1. للحصول على توزيع عشوائي حقيقي للفئران إلى مجموعات بناء على إرشادات ARRIVE ، استخدم بروتوكول التوزيع العشوائي للكتلة بناء على النسبة المئوية الفائزة لكل فأر⁸.
4. بعد تعيين المجموعات ، اختبر الفئران في نقاط زمنية متعددة أثناء العلاج. للحصول على تفاصيل حول المقارنات التي يتم إجراؤها عادة ، راجع الملاحظة أدناه:
   ملاحظة: (1) فئران التحكم في السيارة مقابل. فئران طراز السيارة (هذه مقارنة تحكم لإظهار أن معالجة السيارة لا تحجب النمط الظاهري لنموذج الفأر) ؛ (2) فئران التحكم في السيارة مقابل. الفئران النموذجية المعالجة (هذا يختبر الفرضية القائلة بأن الفئران النموذجية المعالجة تختلف عن الضوابط العادية) ؛ (3) طراز السيارة الفئران مقابل. الفئران النموذجية المعالجة (هذا يختبر الفرضية القائلة بأن العلاج يغير النمط الظاهري لنموذج الفأر) ؛ (4) فئران التحكم في المركبات مقابل. الفئران الضابطة المعالجة (هذه مقارنة تحكم لتحديد آثار العلاج في الفئران بدون نمط ظاهري للهيمنة الاجتماعية).
5. عادة ، سيتم إجراء الاختبار على مدار يومين ، مع ما يقرب من 6 مباريات في اليوم ، مع المقارنات (1-4) المذكورة في الخطوة 7.4. لتجنب الإفراط في الاختبار ، قم بإجراء المقارنات (1) و (2) في اليوم 1 ، والمقارنات (3) و (4) في اليوم 2. نظرا لأن فئران التحكم في السيارة يتم اختبارها مقابل كلتا مجموعتي النموذج في اليوم الأول ، يجب أن تتخللها مباريات كل مقارنة.
6. بعد انتهاء الاختبار ، أعد الفئران إلى أقفاصها المنزلية. نظف الأنبوب وسطح الاختبار بنسبة 70٪ من الإيثانول.

النتائج

تم استخدام اختبار الأنبوب على نطاق واسع في نموذج فأر للخرف الجبهي الصدغي بسبب طفرات البروجرانولين ، Grn ^+/-  الفئران^{8،9،22،23،25}. تظهر هذه الفئران هيمنة اجتماعية منخفضة بعمر 9 أشهر (الشكل 2 أ - د) ⁸. النمط الظاهري للهيمنة الاجتماعية المنخفضة للفئران الأكبر سنا من Grn ^+/- مستقر من خلال الاختبار المتكرر (الشكل 2 أ) ⁸ ، مما يجعله مقياسا قويا للنتائج^{التجريبية 22،25}.

كما تم إجراء اختبار داخل القفص في الفئران Grn ^{+ / -} للتحقيق في التسلسلات الهرمية للهيمنة الاجتماعية بين cagemates (الشكل 3A-D) ⁸. الأهم من ذلك ، أن كلا من الفئران الذكور (الشكل 3 أ ، ب) والإناث (الشكل 3 ج ، د) تشكل هذه التسلسلات الهرمية ، وتظهر الفئران Grn ^{+ / -} أيضا هيمنة اجتماعية منخفضة بين أجمعها (الشكل 3 ه). ومن المثير للاهتمام أن الفئران Grn ^{− / -} لم يكن لديها هذا الشذوذ (الشكل 3E).

إن النمط الظاهري للهيمنة الاجتماعية المنخفضة الذي أظهرته الفئران الأكبر سنا ^{Grn + / -}  (الشكل 2) يجعله مقياسا جذابا للنتائج للتدخلات العلاجية المعززة للبروgranulin. قبل حقن AAV ، تظهر الفئران Grn ^+/-  نمطا ظاهريا منخفضا للهيمنة الاجتماعية (الشكل 4 أ). لا تزال الفئران Grn ^+/-  التي تم حقنها بفيروس تحكم تظهر نمطا ظاهريا منخفض الهيمنة (الشكل 4 ب). لم  تعد الفئران التي تم حقنها بفيروس لزيادة مستويات البروجرالينين تتمتع بالنمط الظاهري المنخفض للهيمنة الاجتماعية (الشكل 4 ج). عند مقارنة الفئران Grn ^+/-  المحقونة بالتحكم AAV بالفئران Grn ^+/-  المحقونة ب AAV المعزز للبروgranulين ، تظهر الفئران Grn ^+/-  المحقونة بالتحكم AAV هيمنة اجتماعية منخفضة (الشكل 4 د).

الشكل 1: تخطيطي لاختبار الأنبوب. (أ) يطلق المجربون الفئران بمجرد دخولها الأنبوب بالكفوف الأربعة. يجب أن يكون الأنبوب صغيرا بما يكفي بحيث لا يستطيع الفأر الالتفاف أو التسلق فوق فأر آخر. (ب) ثم ينتقل كلا الفئران إلى منتصف الأنبوب، حيث يلتقيان. (ج) سيبقى الفأر الأكثر هيمنة في الأنبوب ، بينما سيتراجع الفأر الأقل هيمنة. يتم احتساب الفأر على أنه الخاسر بمجرد خروج مخلبين من الأنبوب. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل 2: النتائج التمثيلية باستخدام اختبار الأنبوب لتحديد النمط الظاهري للهيمنة الاجتماعية. كانت هذه الدراسة في نموذج Grn ^+/-  الفأر للخرف الجبهي الصدغي. تم اختبار الفئران 3 جولات ضد 3 خصوم جديين ، كما هو موضح في الخطوة 1. يتم عرض وسائل مختلفة لتقديم البيانات. (أ) Grn ^+/-  الفئران التي تزيد أعمارها عن 9 أشهر لديها نمط ظاهري منخفض للهيمنة الاجتماعية مستقر في الاختبار المتكرر (* = اختبار ذي الحدين ، ص < 0.05 ؛ تمثل نقاط البيانات النسبة المئوية من انتصارات كل نمط وراثي). (ب) البيانات المجمعة من الجولات الثلاث للاختبار التي ترسم النسبة المئوية الإجمالية للفوز لكل نمط وراثي (*** = اختبار ذي الحدين ، ص = 0.0004). (ج) ارسم عدد انتصارات كل فأرة في جميع مبارياتها الثلاث. كان لدى Grn ^{+ / -}  عدد أقل من الانتصارات (**** = اختبار مان ويتني ، ص < 0.0001). كل نقطة عبارة عن ماوس. (د) مخطط النسبة المئوية للفئران في كل نمط وراثي بنسبة فوز معينة. كانت الفئران Grn ^+/-  أكثر عرضة لأن يكون لديها نسبة فوز منخفضة. (**** = اختبار مان ويتني ، ص < 0.0001). الفئران البالغة من العمر 9-16 شهرا ، ن = 58 فأرا لكل مجموعة. يتم تكييف البيانات بإذن من Arrant et ^al.8. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل 3: النتائج التمثيلية باستخدام اختبار الأنبوب لتحديد التسلسل الهرمي للهيمنة الاجتماعية داخل القفص. تم اختبار أقفاص الفئران من الذكور أو الإناث (ن = 4 أقفاص لكل جنس من 4-5 فئران لكل منهما) بطريقة مستديرة لمدة 5 أيام للسماح باختبار التسلسل الهرمي للهيمنة الاجتماعية.  (أ ، ب) تم تحديد درجات الهيمنة الاجتماعية للفئران من الذكور والإناث من خلال عدد الانتصارات ، حيث كان 5 هو الفأر الأكثر هيمنة و 1 هو الفأر الأقل هيمنة في كل قفص. في اليوم الخامس ، ظل كل من الفئران من الذكور (أ) والإناث (ب) ضمن رتبة واحدة من درجاتهم الأولية في المتوسط. الترميز اللوني حسب ترتيب اليوم 1. (ج، د) كان للتصنيف في اليوم 5 ارتباط كبير للغاية بالرتبة في اليوم 1 لكلا الجنسين. (ه) باستخدام هذا النموذج داخل القفص لتقييم الأقفاص حيث تم تجميع الفئران Grn ^+/+ و Grn ^+/- و Grn ^{− / -}  معا ، أظهرت الفئران ^{Grn +/-} أيضا هيمنة اجتماعية منخفضة (اختبار Kruskal-Wallis ، ص = 0.0063 ، * = ص < 0.05 بواسطة اختبار Dunn اللاحق). ومن المثير للاهتمام ، أنه لم يلاحظ انخفاض الهيمنة الاجتماعية في Grn ^{− / -}  الفئران. يتم تكييف البيانات بإذن من Arrant et al. ، 2016⁸. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل 4: النتائج التمثيلية باستخدام اختبار الأنبوب لتقييم الفعالية العلاجية قبل السريرية. (أ) في الاختبار الأساسي قبل حقن AAV ، كان لدى الفئران Grn ^+/- هيمنة اجتماعية منخفضة (* = اختبار مان ويتني ، ص = 0.0157 ؛ أو * = اختبار ذي حدين ، ص = 0.0281). باستخدام التوزيع العشوائي للكتل ، تم تعيين الفئران بعد ذلك إلى مجموعات العلاج ، إما AAV لزيادة مستويات بروتين البروگرانولين (AAV-Grn) ، أو AAV للتحكم (AAV-GFP). (ب) الفئران Grn ^{+ / -} التي تم حقنها بالتحكم AAV-GFP كان لها هيمنة اجتماعية منخفضة (* = اختبار مان ويتني ، ص = 0.0196 ؛ أو * = اختبار ذي الحدين ، ص = 0.0330). (ج) لم تعد الفئران Grn ^{+ / -} التي تم حقنها ب AAV-Grn تتمتع بهيمنة اجتماعية منخفضة. (د) عند مقارنة الفئران Grn ^{+ / -} المحقونة ب AAV-GFP مقابل AAV-Grn ، كان للفئران المحقونة AAV-Grn هيمنة اجتماعية أعلى مقارنة بالفئران المحقونة AAV-GFP (** = Mann-Whitney ، p = 0.0034 ؛ أو ** = ذات الحدين ، p = 0.0062). ن = 19-36 فأرا لكل مجموعة. يتم تكييف البيانات بإذن من Arrant et ^al.22. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الجدول التكميلي 1 و 2: التصميم التجريبي. مثال على ورقة تصميم مطابقة اختبار الأنبوب. لاحظ توزيع كل مجموعة تجريبية بين الجانبين الأيسر والأيمن من الأنبوب ، والجهد المبذول لتقليل حركة الأقفاص داخل وخارج منطقة الاختبار. المجموعة أ سوداء ، والمجموعة ب مدرجة باللون الأحمر لتصور هذا التوزيع. الرجاء النقر هنا لتنزيل هذا الملف.

Discussion

يوفر اختبار الأنبوب للهيمنة الاجتماعية فحصا يسهل اعتماده وتنفيذه بسرعة قد يجده الباحثون مفيدا إما كمقياس للنتائج الأولية أو كجزء من مجموعة من الاختبارات السلوكية في نماذج الفئران. توفر هذه المقالة بروتوكولات أساسية لإجراء اختبار الأنبوب بين الغرباء أو بين زملائه في القفص.

يجب أن يكون المحققون على دراية بالعديد من المعلمات التي قد تؤثر على سلوك اختبار الأنبوب. بالنسبة لجميع هذه المعلمات ، ينصح بإجراء دراسات تجريبية لتحديد آثارها على نموذج فأر معين. قد يقوم كل من الفئران من الذكور والإناث بإجراء اختبار الأنبوب ، ولكن يجب تحليل الفئران من كل جنس بشكل منفصل لأن بعض نماذج الفئران تظهر اختلافات بين الجنسين في النمط الظاهري للهيمنة الاجتماعية²⁶ ، بينما لا يظهر البعض الآخر^{8،15،27،28}. يمكن تكرار اختبار الأنبوب عدة مرات في نفس ، سواء خلال جلسة الاختبار (السماح بحساب النسبة المئوية الفائزة لكل فأر) وبين عدة جلسات (مما يسمح بالاختبار الطولي لتقييم العمر أو تأثيرات التدخل). ومع ذلك ، قد يؤثر تكرار الاختبار على الأنماط الظاهرية للهيمنة الاجتماعية في بعض نماذج الفئران^8،11،26. أخيرا ، يؤثر إجهاد الخلفية على سلوك اختبار الأنبوب ، كما هو مذكور في منشور اختبار الأنبوب^{الأول 3}. تم تنفيذ جميع الأعمال الموصوفة هنا في الفئران على خلفية C57BL / 6J ، كما تم إجراء الأوراق الأساسية الحديثة حول اختبار الأنبوب في الفئران C57BL / 6 أو C57BL / 6J^4،6،17،29. قد يرغب الباحثون العاملون في سلالات أخرى في تأكيد استقرار وقابلية تكرار سلوك الهيمنة الاجتماعية قبل الشروع في تجارب جديدة.

مقياس النتيجة الأولية لاختبار الأنبوب هو الفوز / الخسارة. ومع ذلك ، سجلت مجموعات أخرى طول كل مباراة وحتى السلوكيات الفرعية داخل كل مباراة. ولذلك، قد يرغب المحققون في جمع هذه المعلومات لزيادة ثراء البيانات التي يتم الحصول عليها من كل اختبار. أفاد وانغ وزملاؤه أن المباريات كانت أقصر عند إقران الفئران باختلافات كبيرة في التسلسلات الهرمية داخل القفص مقارنة بإقران الفئران المصنفة عن كثب ، مما يدل على أن الفئران الأكثر هيمنة تفوز بالمباريات بسرعة⁶. سجل تشو وزملاؤه العديد من السلوكيات الفرعية في اختبار الأنبوب: "بدء الدفع" ، و "الدفع للخلف" ، و "المقاومة" ، و "التراجع" ، ووجدوا أن الفئران الفائزة انخرطت في مزيد من الدفع والمقاومة ، ولكنها أقل تراجعا من الفئران^{الخاسرة 17}. في حين أن تسجيل الفيديو للمباريات ليس ضروريا ، فقد يرغب المحققون المهتمون بهذه التحليلات الأكثر تفصيلا لسلوك الهيمنة الاجتماعية في تسجيل كل مباراة.

كما هو الحال مع العديد من المقايسات السلوكية ، قد يتم الخلط بين اختبار الأنبوب بسبب أوجه القصور الأخرى التي لا علاقة لها بالسلوك الاجتماعي. من المحتمل أن يؤثر ضعف المحرك على أداء اختبار الأنبوب ، لذلك قد يرغب الباحثون في إجراء فحص أساسي للأنماط الظاهرية الحركية مع اختبارات مثل قضيب الدوران ، والمجال المفتوح ، واختبار القطب ، وما إلى ذلك. تعد الإشارات الشمية جانبا مهما من السلوك الاجتماعي للفأر^30،31 ، لذلك يجب على المحققين أيضا فحص العجز الشمي الذي يمكن أن يؤثر على سلوك اختبار الأنبوب. طريقة بسيطة للقيام بذلك هي قياس الوقت الذي تقضيه الفئران في فحص البول من فأر غير مألوف مقابل الماء⁹.

يجب على الباحثين الذين يميزون السلوك الاجتماعي في نماذج الفئران الجديدة التفكير في استخدام اختبار الأنبوب كجزء من مجموعة من الاختبارات الاجتماعية. غالبا ما تظهر نماذج الفئران ذات تشوهات اختبار الأنبوب سلوكا اجتماعيا غير طبيعي في فحوصات أخرى مثل اختبار التواصل الاجتماعي المكون من ثلاث غرف ، واختبار الدخيل المقيم ، والدرجات النوعية للتفاعل الاجتماعي^{9،10،11،12،13،14،15،20،27،32،33،34، 35}. ترتبط الهيمنة الاجتماعية في اختبار الأنبوب بالهيمنة الاجتماعية في مهام أخرى مثل الحلاقة وعلامات البول والتنافس على بقعة دافئة في قفص^17،36،37. ومع ذلك ، فإن الهيمنة الاجتماعية في المهام الأخرى ، مثل المنافسة على الطعام أو الماء أو الوصول إلى إناث الفئران ، أقل ارتباطا بالهيمنة الاجتماعية لاختبار الأنبوب^7،38. باستخدام مجموعة من الاختبارات ، قد يحصل المحققون على مقاييس للهيمنة الاجتماعية والعدوان والتحقيق الاجتماعي والاعتراف الاجتماعي في نماذج الفئران الخاصة بهم.

تم استخدام اختبار الأنبوب كمقياس للنتائج الأولية في اختبار الأساليب العلاجية قبل السريرية^22،23،25 في نموذج الفأر Grn ^+/- بسبب استقرار الأنماط الظاهرية للهيمنة الاجتماعية بمرور الوقت والقدرة على اختبار الفئران بشكل متكرر. يجب على الباحثين المهتمين باستخدام اختبار الأنبوب لفحص التدخلات أولا تحديد استقرار الأنماط الظاهرية للهيمنة الاجتماعية عبر الاختبارات المتكررة في نموذج الفأر الخاص بهم. للقيام بذلك ، اختبر الفئران أولا ، ثم اختبر نفس التطابقات بشكل متكرر على فترات يوم واحد أو أسبوع واحد أو شهر واحد. إذا كانت هناك حاجة إلى جداول زمنية تجريبية أطول ، فيمكن تنفيذ هذه التكرارات على فترات أطول. يمكن تحديد الاتفاق بين هذه التطابقات إحصائيا عن طريق حساب قيمة كابا بين الاختبارات. إذا حقق اختبار الأنبوب ثباتا مناسبا في طراز الماوس ، فإنه يجعل فحص الفحص مثاليا نظرا لبساطته وسرعته.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Animals diet	Envigo	NIH-31 diet #7917	Animals chow
CHLORHEXIDINE 2% SOLUTION 1GAL	Patterson Veterinary Supply INC	78924243	For cleaning tubes and surface
Ethanol 70%	Vion Biosciences	VNEE0069CS/4	For cleaning tubes and surface
Large tube for male mice > 9 months old	Home Depot	Store SKU # 1000017942	1-7/8 in. O.D. x 1-1/2 in. I.D. x 24 in. Clear PVC Vinyl Tube
Medium tube for male mice 6–9 months old, female mice > 9 months old	Home Depot	Store SKU # 1000017945	1-5/8 in. O.D. x 1-1/4 in. I.D. x 24 in. Clear PVC Vinyl Tube
Small tube for male mice < 6 months old, female mice < 9 months old	Home Depot	Store SKU # 1000017938	1-3/8 in. O.D. x 1 in. I.D. x 24 in. Clear PVC Braided Vinyl Tube