Valutazione della dominanza sociale nei modelli murini utilizzando il test in provetta

Riepilogo

Questo protocollo descrive un test comportamentale per valutare la dominanza sociale nei roditori utilizzando il test in provetta. La dominanza sociale rimane stabile nel tempo e diversi modelli di disturbi dello sviluppo e neurologici mostrano robuste anomalie della dominanza sociale. Pertanto, il test in provetta funge da comoda misura dell'esito per studi meccanicistici o screening terapeutico preclinico.

Abstract

La dominanza sociale è alterata nelle malattie dello sviluppo neurologico e neurodegenerative e funge da utile misura di esito negli studi preclinici di questi disturbi. Il test in provetta è un semplice test comportamentale per valutare la dominanza sociale che non richiede attrezzature costose. In questo test, due topi entrano alle estremità opposte di un tubo di plastica trasparente e, dopo essersi incontrati nel mezzo, uno (il meno dominante) deve indietreggiare. Il test in provetta può essere utilizzato sia per topi maschi che femmine e include diversi parametri adattabili per soddisfare le esigenze dello sperimentatore. I topi possono essere testati contro più avversari unici per fornire un indice di dominanza sociale. La dominanza sociale nel test in provetta rimane stabile rispetto ai test ripetuti ed è correlata alle prestazioni in altri test sociali. Inoltre, il test può essere condotto tra compagni di gabbia per valutare le gerarchie di dominanza sociale all'interno della gabbia. Il test in provetta è particolarmente utile negli studi terapeutici preclinici, in quanto consente di eseguire test longitudinali prima e dopo gli interventi sperimentali. Pertanto, funge da comoda misura di esito per gli studi meccanicistici e lo screening terapeutico preclinico.

Introduzione

L'interruzione del comportamento sociale è una caratteristica di molti disturbi umani, inclusi i disturbi dello sviluppo, psichiatrici e neurodegenerativi ^1,2. I modelli murini vengono utilizzati per ottenere informazioni sulla patogenesi di questi disturbi e per fornire una piattaforma per i test preclinici delle terapie. Tuttavia, molti saggi per il comportamento sociale dei topi richiedono molto tempo per essere eseguiti, richiedono attrezzature costose e/o software di tracciamento video per l'analisi o hanno algoritmi di punteggio soggettivi. Al contrario, il test in provetta per la dominanza sociale è rapido e semplice da eseguire e non richiede attrezzature specializzate o tracciamento video. Il test ha un esito binario win/lose, rendendo semplice l'interpretazione dei risultati.

Il test in provetta per la dominanza sociale è stato sviluppato da Lindzey e colleghi nel tentativo di valutare la dominanza sociale nei topi³. Sin dal suo sviluppo, il test del tubo è stato anche stabilito come un modo per valutare le gerarchie di dominanza sociale all'interno della gabbia⁴. I fenotipi del test in provetta sono correlati ad altre misure di dominanza sociale come il barbiere, la competizione di ricompensa e la produzione di urina nei topi maschi⁵. Tuttavia, ci sono risultati contrastanti del test in provetta e la sua correlazione con la competizione per l'accesso al cibo e all'acqua e l'aggressività ^3,6,7. È importante sottolineare che i fenotipi del test in provetta sono correlati ad altri fenotipi sociali come la socialità a tre camere ^8,9.

Un vantaggio del test in provetta è che la sua anatomia è ben definita, il che lo rende particolarmente utile in vari modelli murini, inclusi modelli di disturbi dello spettro autistico e altre malattie caratterizzate da deficit sociali come la demenza frontotemporale 8,9,10,11,12,13,14,15,16 . La corteccia prefrontale mediale (mPFC) è un mediatore chiave del comportamento del test della provetta di topo⁶. Wang e colleghi hanno dimostrato che l'attività nella mPFC guida la dominanza sociale nei topi⁶, e dati più recenti hanno perfezionato questa intuizione dimostrando che l'input talamico mediale alle cortecce cingolate prelimbiche e anteriori guida la dominanza sociale¹⁷. Coerentemente con un ruolo chiave per la mPFC nella dominanza sociale del test in provetta, anomalie negli alberi dendritici, nelle spine dendritiche, nei recettori del glutammato e/o nell'eccitabilità neuronale, la mPFC è stata associata ad anomalie del test in provetta in modelli di roditori di disturbi dello spettro autistico^15,18, demenza frontotemporale ^8,19, stress cronico²⁰ e isolamento sociale²¹.

Un altro vantaggio chiave del test in provetta è la capacità di testare la dominanza sociale sia prima che dopo l'intervento terapeutico, poiché la dominanza sociale del topo nel test in provetta è stabile nel tempo, consentendo test ripetuti sia prima che dopo un intervento sperimentale 6,8,22,23. Un esempio di ciò proviene da modelli murini eterozigoti con progranulina (Grn^+/-) di demenza frontotemporale causata da mutazioni della progranulina (GRN), una malattia da aploinsufficienza. I topi eterozigoti con progranulina hanno un deficit di dominanza sociale⁸. Questo deficit del test in provetta può essere invertito ripristinando la progranulina con la terapia genica AAV-progranulina²² o la somministrazione di anticorpi anti-sortilina progettati per ridurre la degradazione della progranulina²³. Questi esempi dimostrano l'utilità del test in provetta nella progettazione di studi preclinici per la ricerca correlata alla demenza.

Questo protocollo fornisce metodi di base per eseguire il test in provetta tra non-cagemati per valutare le differenze tra i gruppi sperimentali e tra i cagemati per valutare le gerarchie di dominanza sociale all'interno della gabbia.

Protocollo

Tutte le procedure sperimentali sono state approvate dal Comitato Istituzionale per la Cura e l'Uso degli Animali dell'Università dell'Alabama a Birmingham ed eseguite in conformità con l'Associazione per la Valutazione e l'Accreditamento della Cura degli Animali da Laboratorio (AAALAC). Topi eterozigoti con progranulina sono stati generati e incrociati su un background C57BL/6J come precedentemente descritto⁹. I topi utilizzati per questo studio erano stati reincrociati sullo sfondo C57BL/6J per almeno 12 generazioni. Nei dati del campione sono stati utilizzati topi di età compresa tra 9 e 16 mesi. In questo studio sono stati utilizzati sia maschi che femmine. I topi sono stati mantenuti su un ciclo luce/buio delle 12:12 con le luci accese alle 06:00 e tutti i test sono stati condotti durante la fase di luce. Ai topi è stato dato accesso ad libitum a cibo e acqua durante tutti gli esperimenti. I dettagli dei reagenti e delle attrezzature utilizzate sono elencati nella Tabella dei Materiali.

1. Design della corrispondenza del test del tubo

1. Pianificare le partite di prova in provetta prima di eseguire il test. Assicurarsi che non ci sia alcuna nota sul genotipo per mantenere lo sperimentatore cieco ai gruppi (vedere la Tabella supplementare 1).
   NOTA: Di solito testiamo i topi contro 3 avversari unici del gruppo sperimentale opposto 8,9,22,23, ma alcuni studi riportano test contro più avversari 10,11,13.
2. Controbilanciare l'assegnazione dei topi sperimentali ai lati sinistro e destro del tubo per evitare potenziali effetti confondenti della distorsione laterale.
3. Quando si testano i non compagni di gabbia, ridurre al minimo il movimento delle gabbie per evitare di stressare i topi più del necessario. Per ridurre al minimo il movimento della gabbia, sovrapponi il più possibile le corrispondenze tra le stesse due gabbie.
4. Quando si testano i compagni di gabbia, testare ogni topo da una gabbia contro ogni altro topo in un round robin. Se si ripete il test per più giorni, il lato del tubo in cui il mouse è assegnato per entrare (cioè sinistro o destro) deve essere alternato di giorno in giorno.

2. Scelta dei tubi

NOTA: Tipicamente, il test del tubo viene eseguito con tubi di plastica trasparente in PVC disponibili in commercio (vedi Tabella dei materiali). È importante notare che questo protocollo è ottimizzato per i topi, ma può essere applicato ad altri modelli di roditori come ratti, arvicole e criceti².

1. Tagliare il tubo in PVC a una lunghezza di 30,5 cm. Il tubo in PVC è leggermente flessibile e viene spesso conservato in rotoli, quindi potrebbe essere necessario raddrizzarlo prima dell'uso. Un leggero riscaldamento aiuterà a raddrizzare i tubi curvi.
2. Il diametro interno del tubo è fondamentale per il successo del test. Assicurati che il tubo sia abbastanza grande da consentire ai topi di muoversi, ma non abbastanza grande da consentire ai topi di incrociarsi l'uno sull'altro.
   NOTA: Il test non funzionerà se il tubo è abbastanza grande da consentire ai topi di passarsi l'un l'altro senza impegnarsi in una gara di dominanza sociale. Di seguito sono riportate le linee guida approssimative per le dimensioni appropriate dei tubi nei topi C57BL/6J: (1) diametro interno (ID) di 1 pollice/2,5 cm per topi maschi di <6 mesi, topi femmine di <9 mesi; (2) ID di 1,25 pollici/3,2 cm per topi maschi di 6-9 mesi, topi femmine di >9 mesi; e (3) ID da 1,5 pollici/3,5 cm per topi maschi di >9 mesi.
3. Se possibile, utilizzare una provetta della stessa dimensione per tutti i test all'interno di un gruppo di topi. Se i topi si incrociano durante le prime partite, esegui tutte le corrispondenze successive con il tubo più piccolo successivo.

3. Luogo di test

1. Eseguire il test del tubo su qualsiasi superficie piana e stabile o cappa filtrata in condizioni di illuminazione ambientale.
   NOTA: Il test viene in genere eseguito durante il giorno tra le 8 e le 17. Per i casi in cui i topi vengono testati per più giorni, ogni topo dovrebbe essere testato durante la stessa ora del giorno per ogni test (ad esempio, tra le 11 e le 15). Per quanto ne sappiamo, gli effetti dell'ora del giorno non sono stati studiati in precedenza.
2. Eseguire il test della provetta in un luogo silenzioso con stimoli esterni minimi. Idealmente, l'investigatore dovrebbe essere l'unica persona nella stanza.

4. Assuefazione

1. L'assuefazione è una pratica importante nei test comportamentali che consente ai topi di familiarizzare con l'ambiente di test, il che può portare a risultati più coerenti e affidabili²⁴. Per il test in provetta, acclimatare i topi alla sala prove prima del test. Se il test non viene eseguito nella stanza di stabulazione degli animali, lasciare che i topi si abituino almeno 1 ora alla nuova stanza prima di eseguire il test.
2. (Facoltativo) Se lo si desidera, i topi possono essere abituati alla provetta prima del test. Per abituarsi al tubo, posizionare il mouse nel tubo senza un avversario e lasciarlo attraversare attraverso il tubo 2-3 volte, 2-3 giorni prima del test. Questa non è la nostra pratica standard.

5. Test in provetta standard

NOTA: (Facoltativo) I ricercatori che non conoscono il test della provetta potrebbero voler esercitarsi a posizionare i topi nella provetta utilizzando un gruppo separato di topi non sperimentali. Gli investigatori spesso devono esercitarsi a posizionare i topi nel tubo. Un investigatore esperto indurrà meno stress nei topi sottoposti al test. Ulteriori informazioni sul posizionamento dei topi nella provetta sono fornite al punto 5.3.

1. Metti tutte le gabbie contenenti topi dello stesso sesso da testare su un carrello. Gabbie di trasporto all'area di prova. Pulire le provette e l'area di prova con clorexidina al 2% seguita da etanolo al 70%. Le provette possono essere facilmente pulite utilizzando una pipetta sierologica da 50 ml spingendo un tovagliolo di carta attraverso la provetta.
2. Posiziona le due gabbie per il primo fiammifero sulla superficie di prova. Togliete i coperchi e posizionateli vicino ad ogni gabbia.
3. Individua i due mouse da testare. Tieni un mouse in ogni mano, corrispondente al lato assegnato del tubo. Dopo aver trovato il primo topo, tieni delicatamente la sua coda e tienilo nella gabbia mentre cerchi il secondo.
   NOTA: Tenere la coda del topo vicino al centro della sua lunghezza consentirà all'investigatore di controllare delicatamente il mouse senza trattenerlo troppo strettamente. Tieni il topo in modo che tutte e quattro le sue zampe rimangano sulla lettiera della gabbia per evitare di stressare inutilmente il topo.
4. Rimuovi contemporaneamente entrambi i topi da ciascuna gabbia e posizionali delicatamente con la testa all'ingresso del tubo.
   NOTA: Se i topi sono stati abituati o hanno precedenti esperienze di test, in genere entrano nella provetta entro pochi secondi. Se i topi sono ingenui nei confronti del tubo, potrebbero essere riluttanti a entrare per la prima prova. Se necessario, i mouse possono essere spostati sul tubo successivo più grande per incoraggiare l'ingresso nel tubo.
5. Mantieni una presa sulla coda di ciascun mouse per evitare che i topi entrino in contatto prematuramente. Assicurarsi che i mouse non siano forzati nel tubo. Tuttavia, una volta che iniziano a entrare nel tubo, possono essere spinti delicatamente per incoraggiare l'ingresso completo nel tubo.
6. Quando entrambi i topi sono entrati nel tubo, rilasciare le code e allontanarsi dal tubo (Figura 1A). Entrambi i topi dovrebbero avanzare nel tubo e incontrarsi vicino al centro (Figura 1B).
   1. Osserva la partita e registra il vincitore e il perdente. Si ritiene che un topo abbia perso la corrispondenza quando due delle sue zampe escono dal tubo e toccano la superficie di prova (Figura 1C).
      NOTA: Un mouse in genere spinge l'altro fuori dal tubo, anche se alcuni mouse eseguono una ritirata non forzata dopo aver contattato il mouse avversario. Occasionalmente, entrambi i topi si ritirano contemporaneamente, oppure un topo si ritira immediatamente dopo essere entrato nel tubo senza entrare in contatto con il topo avversario. Se si verifica uno di questi eventi, rimetti entrambi i mouse nel tubo e riavvia la corrispondenza. I topi in genere eseguono una corrispondenza più standard al secondo tentativo. Se nessuno dei due mouse si è ritirato entro 2 minuti, interrompi la partita ed eseguila di nuovo alla fine della sessione.
7. Al termine della partita, riporta i topi nelle loro gabbie di casa. Pulire la provetta e la superficie di prova con etanolo al 70%.
8. Continua a eseguire le partite utilizzando il design descritto nel passaggio 1. Ogni round inizia immediatamente dopo il round precedente. Quando tutte le partite di un sesso sono state eseguite, rimetti le gabbie nella rastrelliera/carrello e testa i topi del sesso opposto usando la stessa procedura.
   1. Pulire accuratamente la superficie di prova e i tubi tra i topi femmina e maschio in esecuzione. Al termine del test, pulire sia le provette che l'area di test con clorexidina al 2%.
9. Per l'analisi statistica, contare il numero di vittorie per ciascun gruppo e analizzare utilizzando il test binomiale per confrontare la distribuzione osservata rispetto a quella prevista, con la distribuzione prevista impostata al 50% di vittorie per ciascun gruppo.
   1. Calcola la percentuale di vincita per ogni mouse dividendo il numero di vittorie per il numero di partite (in genere tre partite a meno che una partita non sia stata annullata a causa di un mouse mancante o di altri problemi). Confronta la percentuale di vittoria per ogni gruppo utilizzando il test di Mann-Whitney.
      NOTA: Se ripetute, queste corrispondenze producono risultati simili in assenza di ulteriori manipolazioni sperimentali. Ad esempio, uno studio precedente ha osservato che 40 partite su 47 hanno prodotto lo stesso risultato quando sono state eseguite in giorni successivi⁸.

6. Test in provetta all'interno della gabbia per valutare le gerarchie di dominanza sociale

NOTA: I topi formano stabili gerarchie di dominanza sociale che possono essere rivelate dal test in provetta round-robin di tutti i topi all'interno di una gabbia ^4,6. Sia i topi maschi che le femmine formano queste gerarchie⁸. Le gerarchie di dominanza sociale sono meglio valutate in gabbie contenenti almeno 5 topi.

1. Pianificare le corrispondenze in anticipo, con il controbilanciamento come descritto nel passaggio 1.
2. Eseguire le corrispondenze dei test delle provette come descritto nel passaggio 5. Testa una gabbia alla volta e testa tutti i topi in un round robin. Pulisci la provetta e l'area di test con etanolo al 70% tra ogni partita.
3. Testa ogni gabbia una volta al giorno per almeno 5 giorni per stabilire gli ordini di rango stabili di ciascun topo.
4. Per l'analisi statistica, valutare il numero di vittorie per topo. Classifica ogni mouse in base al numero di vittorie.

7. Utilizzo del test in provetta per lo screening terapeutico preclinico

NOTA: La robustezza e la stabilità dei fenotipi di dominanza sociale in molti modelli murini, così come la facilità di esecuzione del test in provetta, rendono il test in provetta un paradigma utile per la sperimentazione preclinica delle strategie terapeutiche. Per questo, il test in provetta può essere eseguito utilizzando un design all'interno dell'animale, poiché il test può essere eseguito in serie. È anche possibile fare un disegno cross-over con il farmaco, quindi il controllo o viceversa. Il test in provetta è stato precedentemente utilizzato per valutare terapie di potenziamento della progranulina in topi Grn^{+/− 22,23}, che hanno dimostrato che i fenotipi di dominanza sociale sono reversibili in questo modello murino. Per chiarezza della discussione che segue, i topi saranno descritti come "controllo" (wild-type, non transgenici, ecc.) o "modello" (knockout, transgenici, ecc.), e gli interventi sperimentali saranno descritti come "veicolo" o "trattati" (intervento terapeutico). Mentre i topi sono indicati come "controllo" e "modello" di seguito, è ideale utilizzare i compagni di cucciolata per ciascuno di questi gruppi.

1. Prima di un intervento sperimentale, eseguire un pre-test per confermare la presenza del fenotipo di dominanza sociale atteso nei topi modello da utilizzare per il test. Testa l'intero pool di topi di controllo e modelli l'uno contro l'altro e utilizza questi dati per assegnare i topi ai gruppi di trattamento per garantire che i gruppi siano bilanciati al basale.
2. Possono essere necessarie durate diverse del trattamento in base alla terapia. Ad esempio, se il farmaco è un AAV, consentire ai topi di riprendersi dall'intervento chirurgico e avere il tempo di far effetto al farmaco. Se il farmaco è una piccola molecola, determinare i paradigmi di trattamento prima del test in provetta²².
3. Assegnare i topi a gruppi sperimentali in modo tale che i topi veicolo e trattati di ciascun genotipo abbiano fenotipi di dominanza sociale di base di grado simile. Se i topi vengono testati più volte contro diversi avversari, la percentuale di vittoria di ciascun topo (descritta nel passaggio 5.9) può essere utilizzata per creare due gruppi con fenotipi simili.
   1. Per una distribuzione veramente casuale dei topi in gruppi in base alle linee guida ARRIVE, utilizzare un protocollo di randomizzazione a blocchi basato sulla percentuale di vittorie di ciascun topo⁸.
4. Dopo che i gruppi sono stati assegnati, testare i topi in più punti temporali durante il trattamento. Per i dettagli sui confronti eseguiti in genere, vedere la NOTA seguente:
   NOTA: (1) Mouse di controllo del veicolo vs. topi modello di veicolo (questo è un confronto di controllo per dimostrare che il trattamento con il veicolo non oscura il fenotipo del modello murino); (2) mouse per il controllo del veicolo vs. topi modello trattati (questo verifica l'ipotesi che i topi modello trattati siano diversi dai normali controlli); (3) Modello di veicolo MICE vs. topi modello trattati (questo verifica l'ipotesi che il trattamento alteri il fenotipo del modello murino); (4) mouse per il controllo del veicolo vs. topi di controllo trattati (questo è un confronto di controllo per determinare gli effetti del trattamento nei topi senza un fenotipo di dominanza sociale).
5. In genere, i test verranno eseguiti nell'arco di due giorni, con circa 6 partite al giorno, con i confronti (1-4) menzionati nel passaggio 7.4. Per evitare test eccessivi, eseguire i confronti (1) e (2) il giorno 1 e i confronti (3) e (4) il giorno 2. Poiché i mouse di controllo del veicolo vengono testati contro entrambi i gruppi di modelli il giorno 1, le corrispondenze di ogni confronto devono essere intervallate.
6. Al termine del test, riporta i topi nelle loro gabbie domestiche. Pulire la provetta e la superficie di prova con etanolo al 70%.

Risultati

Il test in provetta è stato ampiamente utilizzato in un modello murino di demenza frontotemporale dovuta a mutazioni della progranulina, Grn^+/- topi 8,9,22,23,25. Questi topi mostrano una bassa dominanza sociale entro i 9 mesi di età (Figura 2A-D)⁸. Il fenotipo a bassa dominanza sociale dei topi Grn^+/− più anziani è stabile attraverso test ripetuti (Figura 2A)⁸, il che lo rende una robusta misura dell'esito sperimentale^22,25.

Il test all'interno della gabbia è stato eseguito anche in topi Grn^+/− per studiare le gerarchie di dominanza sociale tra i cagemati (Figura 3A-D)⁸. È importante sottolineare che sia i topi maschi (Figura 3A, B) che le femmine (Figura 3C, D) formano queste gerarchie, e anche i topi Grn^+/- mostrano una bassa dominanza sociale tra i loro cagemati (Figura 3E). È interessante notare che i topi Grn^-/- non presentavano questa anomalia (Figura 3E).

Il basso fenotipo di dominanza sociale esibito dai topi Grn^+/-- più anziani (Figura 2) lo rende una misura di esito interessante per gli interventi terapeutici che stimolano la progranulina. Prima dell'iniezione di AAV, i topi Grn^+/−  mostrano un fenotipo a bassa dominanza sociale (Figura 4A). I topi Grn^+/−  iniettati con un virus di controllo mostrano ancora un fenotipo a bassa dominanza (Figura 4B). I topi Grn^+/−  iniettati con un virus per aumentare i livelli di progranulina non hanno più il fenotipo a bassa dominanza sociale (Figura 4C). Quando si confrontano i topi Grn^+/−  iniettati con AAV di controllo con i topi Grn^+/−  iniettati con AAV potenziante la progranulina, i topi Grn^+/−  iniettati con AAV di controllo mostrano una bassa dominanza sociale (Figura 4D).

Figura 1: Schema del test in provetta. (A) Gli sperimentatori rilasciano i topi una volta che sono entrati nella provetta con tutte e quattro le zampe. Il tubo dovrebbe essere abbastanza piccolo da impedire a un topo di girarsi o scavalcare un altro topo. (B) Entrambi i topi si spostano quindi al centro del tubo, dove si incontrano. (C) Il topo più dominante rimarrà nel tubo, mentre il topo meno dominante si tirerà indietro. Il topo viene conteggiato come perdente una volta che due zampe escono dal tubo. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 2: Risultati rappresentativi utilizzando il test in provetta per identificare un fenotipo di dominanza sociale. Questo studio è stato condotto nel modello murino Grn^+/−  di demenza frontotemporale. I topi sono stati testati 3 round contro 3 nuovi avversari, come descritto nel passaggio 1. Vengono mostrati diversi metodi di presentazione dei dati. (A) I topi Grn^+/−  di età superiore ai 9 mesi hanno un fenotipo di dominanza sociale basso che è stabile su test ripetuti (* = test binomiale, p < 0,05; i punti dati rappresentano le percentuali di vittorie di ciascun genotipo). (B) Dati aggregati dei tre cicli di test che tracciano la percentuale di vittorie complessive per genotipo (*** = test binomiale, p = 0,0004). (C) Traccia il numero di vittorie di ciascun mouse in tutte e 3 le sue partite. I topi Grn^+/−  hanno avuto un numero inferiore di vittorie (**** = test di Mann-Whitney, p < 0,0001). Ogni punto è un topo. (D) Grafico della percentuale di topi in ciascun genotipo con una data percentuale di vittoria. I topi Grn^+/−  avevano maggiori probabilità di avere una bassa percentuale di vittorie. (**** = test di Mann-Whitney, p < 0,0001). Topi di 9-16 mesi, n = 58 topi per gruppo. I dati sono stati adattati con il permesso di Arrant et ^al.8. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 3: Risultati rappresentativi utilizzando il test in provetta per determinare la gerarchia di dominanza sociale all'interno della gabbia. Le gabbie di topi maschi o femmine (n = 4 gabbie per sesso di 4-5 topi ciascuna) sono state testate in modo round-robin per 5 giorni per consentire di testare la gerarchia di dominanza sociale.  (A,B) I punteggi di dominanza sociale per i topi maschi e femmine sono stati determinati dal numero di vittorie, con 5 che è il topo più dominante e 1 è il topo meno dominante in ogni gabbia. Al giorno 5, sia i topi maschi (A) che le femmine (B) sono rimasti in media entro un rango dal loro punteggio iniziale. La codifica a colori è in base alla classifica del giorno 1. (C, D) Il rango del giorno 5 aveva una correlazione molto significativa con il rango del giorno 1 per entrambi i sessi. (E) Utilizzando questo paradigma all'interno della gabbia per valutare le gabbie in cui i topi Grn^+/+, Grn^+/− e Grn^-/- -erano alloggiati insieme in gruppo, i topi Grn^+/- hanno anche mostrato una bassa dominanza sociale (test di Kruskal-Wallis, p = 0,0063, * = p < 0,05 secondo il test post-hoc di Dunn). È interessante notare che una bassa dominanza sociale non è stata osservata nei topi Grn^-/- . I dati sono adattati con il permesso di Arrant et al., 2016⁸. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 4: Risultati rappresentativi utilizzando il test in provetta per valutare l'efficacia terapeutica preclinica. (A) Nei test di base prima dell'iniezione di AAV, i topi Grn^+/- avevano una bassa dominanza sociale (* = test di Mann-Whitney, p = 0,0157; o * = test binomiale, p = 0,0281). Utilizzando la randomizzazione a blocchi, i topi sono stati quindi assegnati a gruppi di trattamento, un AAV per aumentare i livelli di proteina progranulina (AAV-Grn) o un AAV di controllo (AAV-GFP). (B) I topi Grn^+/− iniettati con il controllo AAV-GFP avevano una bassa dominanza sociale (* = test di Mann-Whitney, p = 0,0196; o * = test binomiale, p = 0,0330). (C) I topi Grn^+/− iniettati con l'AAV-Grn non avevano più una bassa dominanza sociale. (D) Confrontando i topi con iniezione di AAV-GFP con Grn^+/− rispetto ad AAV-Grn, i topi iniettati con AAV-Grn avevano una dominanza sociale più elevata rispetto ai topi con AAV-GFP iniettati con controllo (** = Mann-Whitney, p = 0,0034; o ** = binomiale, p = 0,0062). n = 19-36 topi per gruppo. I dati sono adattati con il permesso di Arrant et ^al.22. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Tabella supplementare 1 e 2: Disegno sperimentale. Un esempio di foglio di progettazione della corrispondenza del test del tubo. Notare la distribuzione di ciascun gruppo sperimentale tra i lati sinistro e destro del tubo e lo sforzo per ridurre al minimo il movimento delle gabbie dentro e fuori l'area di prova. Il gruppo A è nero e il gruppo B è elencato in rosso per visualizzare questa distribuzione. Clicca qui per scaricare questo file.

Discussione

Il test in provetta per la dominanza sociale fornisce un test facilmente adottato e di rapida esecuzione che i ricercatori possono trovare utile sia come misura di esito primaria che come parte di una batteria di test comportamentali in modelli murini. Questo articolo fornisce i protocolli di base per l'esecuzione del test in provetta tra estranei o tra compagni di gabbia.

Gli investigatori devono essere consapevoli di diversi parametri che possono influenzare il comportamento del test in provetta. Per tutti questi parametri, sono consigliabili studi pilota per determinare i loro effetti su un particolare modello murino. Sia i topi maschi che le femmine possono eseguire il test in provetta, ma i topi di ciascun sesso dovrebbero essere analizzati separatamente poiché alcuni modelli murini mostrano differenze di sesso nel fenotipo di dominanza sociale²⁶, mentre altri non lo fanno 8,15,27,28. Il test in provetta può essere ripetuto più volte nello stesso animale, sia all'interno di una sessione di test (consentendo il calcolo di una percentuale di vittoria per ciascun topo) sia tra più sessioni (consentendo test longitudinali per valutare l'età o gli effetti dell'intervento). Tuttavia, la ripetizione del test può influenzare i fenotipi di dominanza sociale in alcuni modelli murini ^8,11,26. Infine, la deformazione di fondo ha un effetto sul comportamento del test in provetta, come notato nella primissima pubblicazione del test in provetta³. Tutto il lavoro qui descritto è stato eseguito su topi sullo sfondo C57BL/6J, e recenti articoli seminali sul test in provetta sono stati eseguiti anche su topi C57BL/6 o C57BL/6J 4,6,17,29. I ricercatori che lavorano su altri ceppi potrebbero voler confermare la stabilità e la riproducibilità del comportamento di dominanza sociale prima di procedere a nuovi esperimenti.

La misura primaria dell'esito del test in provetta è la vittoria/perdita. Tuttavia, altri gruppi hanno registrato la durata di ogni corrispondenza e persino i comportamenti secondari all'interno di ogni corrispondenza. Gli investigatori potrebbero, quindi, voler raccogliere tali informazioni per aumentare la ricchezza dei dati ottenuti da ciascun test. Wang e colleghi hanno riferito che le corrispondenze erano più brevi quando si accoppiavano topi con grandi differenze nelle gerarchie all'interno della gabbia rispetto a quando si accoppiavano topi strettamente classificati, dimostrando che i topi più dominanti vincono^{rapidamente le} corrispondenze. Zhou e colleghi hanno valutato diversi sotto-comportamenti nel test in provetta: "spinta-iniziata", "spinta-indietro", "resistenza" e "ritirata", e hanno scoperto che i topi vincenti si impegnavano in più spinta e resistenza, ma meno in ritirata rispetto ai topi perdenti¹⁷. Sebbene la registrazione video delle corrispondenze non sia necessaria, gli investigatori interessati a queste analisi più dettagliate del comportamento di dominanza sociale potrebbero voler registrare ogni corrispondenza.

Come per molti test comportamentali, il test in provetta può essere confuso da altri deficit non correlati al comportamento sociale. È probabile che la compromissione motoria influisca sulle prestazioni del test del tubo, quindi gli investigatori potrebbero voler eseguire uno screening di base per i fenotipi motori con test come il rota-rod, il campo aperto, il test del palo, ecc. I segnali olfattivi sono un aspetto importante del comportamento sociale dei topi^30,31, quindi gli investigatori dovrebbero anche esaminare i deficit olfattivi che potrebbero influire sul comportamento del test in provetta. Un modo semplice per farlo è misurare il tempo che i topi trascorrono a studiare l'urina di un topo sconosciuto rispetto all'acqua⁹.

I ricercatori che caratterizzano il comportamento sociale in nuovi modelli murini dovrebbero prendere in considerazione l'utilizzo del test in provetta come parte di una batteria di test sociali. I modelli murini con anomalie del test in provetta spesso mostrano un comportamento sociale anormale in altri test come il test di socievolezza a tre camere, il test residente-intruso e il punteggio qualitativo dell'interazione sociale 9,10,11,12,13,14,15,20,27,32,33,34 ^,35. La dominanza sociale nel test in provetta è correlata alla dominanza sociale in altri compiti come il barbiere, la marcatura delle urine e la competizione per un posto caldo in una gabbia 17,36,37. Tuttavia, la dominanza sociale in altri compiti, come la competizione per il cibo, l'acqua o l'accesso a topi femmine, è meno ben correlata con la dominanza sociale del test in provetta ^7,38. Utilizzando una serie di test, gli investigatori possono ottenere misure di dominanza sociale, aggressività, indagine sociale e riconoscimento sociale nei loro modelli murini.

Il test in provetta è stato utilizzato come misura dell'esito primario nel test di approcci terapeutici preclinici ^22,23,25 nel modello murino Grn^+/- a causa della stabilità dei fenotipi di dominanza sociale nel tempo e della capacità di testare ripetutamente i topi. I ricercatori interessati a utilizzare il test in provetta per lo screening degli interventi dovrebbero prima determinare la stabilità dei fenotipi di dominanza sociale attraverso test ripetuti nel loro modello murino. Per fare ciò, prima testa i topi, quindi testa ripetutamente le stesse corrispondenze a intervalli di un giorno, una settimana o un mese. Se sono necessarie tempistiche sperimentali più lunghe, queste ripetizioni possono essere eseguite a intervalli ancora più lunghi. L'accordo tra queste corrispondenze può essere determinato statisticamente calcolando il valore kappa tra i test. Se il test in provetta raggiunge un'adeguata stabilità nel modello murino, è un test di screening ideale grazie alla sua semplicità e velocità.

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
Animals diet	Envigo	NIH-31 diet #7917	Animals chow
CHLORHEXIDINE 2% SOLUTION 1GAL	Patterson Veterinary Supply INC	78924243	For cleaning tubes and surface
Ethanol 70%	Vion Biosciences	VNEE0069CS/4	For cleaning tubes and surface
Large tube for male mice > 9 months old	Home Depot	Store SKU # 1000017942	1-7/8 in. O.D. x 1-1/2 in. I.D. x 24 in. Clear PVC Vinyl Tube
Medium tube for male mice 6–9 months old, female mice > 9 months old	Home Depot	Store SKU # 1000017945	1-5/8 in. O.D. x 1-1/4 in. I.D. x 24 in. Clear PVC Vinyl Tube
Small tube for male mice < 6 months old, female mice < 9 months old	Home Depot	Store SKU # 1000017938	1-3/8 in. O.D. x 1 in. I.D. x 24 in. Clear PVC Braided Vinyl Tube