إعداد وصيانة الخلايا العصبية العقد الجذرية الظهرية في الثقافات Compartmented

Summary

نحن هنا وصف أسلوب إعداد وصيانة غرف compartmented عن خلايا عصبية حسية للزراعة العقد الجذرية الظهرية.

Abstract

الخلايا العصبية توسيع عمليات محواري التي هي بعيدة كل البعد من خلايا الجسم ليعصب الأنسجة المستهدفة ، حيث هناك حاجة الهدف المستمدة من عوامل نمو الخلايا العصبية من أجل البقاء والوظيفة. مطلوبة على وجه التحديد Neurotrophins للحفاظ على البقاء والتفريق بين الخلايا العصبية الحسية التعصيب ولكن مسألة كيف يمكن لهذه neurotrophins الهدف المستمدة من التواصل لخلايا الجسم من الخلايا العصبية التعصيب كان مجال للبحث نشطة لأكثر من 30 عاما. النموذج الأكثر شيوعا عن كيفية قبول اشارات neurotrophin تصل إلى خلايا الجسم يقترح أن يشير الإندوسومات تحمل هذه الإشارة retrogradely على طول محور عصبي. وكان من أجل دراسة النقل إلى الوراء ، وضعت أصلا لنظام الثقافة من خلال Campenot روبرت ، الذي يتم عزل أجسام الخلايا من المحاور الخاصة بهم. أسلوب إعداد هذه الدوائر compartmented لزراعة الخلايا العصبية الحسية يجمل تحفيز الانتقائي للمحطات التي تحدث في الخلايا العصبية بعد الافراج فيفو الهدف المستمدة neurotrophins. مما يشير إلى الوراء الأحداث التي تتطلب طويلة المدى تعتمد على النقل أنيبيب الوراء لها انعكاسات هامة لعلاج الاضطرابات العصبية.

Protocol

إعداد الكواشف

1. طلاء الكولاجين : الكولاجين معطف زراعة الأنسجة لوحات P35 ومكان في الفرن عند 37 درجة مئوية لمدة 2 قبل أيام تشحيم وفواصل. وينبغي تركيز النهائي من الكولاجين تكون على 0.71 ملغ / مل حمض الهيدروكلوريك المخفف في N 0.001. ثم ، إضافة 1 مل من مزيج لكل لوحة.
2. لوادر الشحوم : من أجل ملء المحمل الشحوم ، يجب أولا أن 60mL حقنة مليئة الشحوم فراغ كورنينج. استخدام حقنة لملء المحمل الشحوم ، وذلك في التفاف احباط ومن ثم تعقيم لمدة 45 دقيقة.
3. تفلون فواصل : يجب أولا أن تكون فواصل إعادة استخدامها بعد كل تجربة لكن يجب تنظيفها بشكل صحيح. إزالة حاجز من لوحة ، وتمحو كل ما تبقى من الشحوم ومكان في حامض الكبريتيك لمدة 2 ايام. بعد إزالة من الحامض ، شطف مع غلي الماء ، 3X لمدة 20 دقيقة ، والسماح ليجف ، ومكان في طبق بتري P100 الزجاج وتعقيم لمدة 20 دقيقة.
4. N2 - methylcellulose : زن من 1.5G من methylcellulose ووضعه في زجاجة 500mL. إضافة بقضيب والأوتوكلاف أنه لمدة 20 دقيقة على الجاف (من هذه النقطة يجب أن تكون جميع الأعمال العقيمة). المقبل ، إضافة 500 مليليتر من الدم وسائل الاعلام الحرة (N ₂₎ ، واثارة في غرفة باردة حتى يذوب. قسامة إلى 50 مل وتجميد conicals في -20 درجة مئوية. قسامة للعمل ، واحدة من الأسهم conicals 50 مل في أنابيب 1mL وتجميد في -20 درجة مئوية.
5. DRG وسائل الإعلام : DMEM ، 5 ٪ مصل الحصان الحرارة المعطل ، و 1 ٪ الستربتوميسين البنسلين.
6. 100ng/mL DRGN وسائل الإعلام : إن تركيز الأسهم على حد سواء عامل النمو العصبي (NGF) والدماغ الناجم عن عوامل عصبية (BDNF) هو 1mg/mL. تمييع كل من neurotrophins 1:10،000 إلى وسائل الإعلام DRG. يمكن زراعتها في الثقافات وحدها NGF ، وهذا يغير من الخلايا العصبية التي تكمل البقاء في الثقافات.
   
   ملاحظة : عند الحاجة ، وتركيز (السيتوزين الأرابينوزيد) أراك هو 1uM وتستخدم بتركيز نهائي 0.3uM. هذا وسوف تمنع نمو الخلايا الدبقية شوان وغيرها.
   
   
7. 10ng/mL DRGN وسائل الإعلام : خفف من وسائل الاعلام DRGN 100ng/mL (1:10) مع وسائل الاعلام DRG.
   
   
   
   
   الشكل 1. الأدوات اللازمة لانشاء
   

إعداد غرف compartmented (1-2 بدء هذه العملية قبل أيام من تشريح)

1. جعل الصفر في وسط صحن الكولاجين P35 المغلفة مع الحركة في الخارج.
2. 30ul مكان methylcellulose - N2 في منتصف الصفر. مجموعة الأطباق جانبا حتى يتم مدهون المفرق.
3. إرفاق عيار 23 محول كعب luer لودر الشحوم. وضع قبضة المفرق تفلون مع زوج من زاوية 90 درجة المرقأة وانها مسطحة مع مقسم مواجهة تحت المجهر. تتبع المفرق الشحوم مع التأكد من أنه في كل مرة يتم وضع محول على نقطة انطلاق جديدة يتم إدراج محول في الشحوم من الخطوة السابقة حتى لا يكون هناك خط متواصل من الشحوم (انظر الرسم البياني). حالما يتم تطبيق الشحوم إلى مقسم كامل ، بدوره واحدا من الأطباق المعدة P35 رأسا على عقب وضعه بحيث N2 - methylcellulose هو على المقصورة المتوسطة. اضغط لأسفل على الجزء السفلي من الطبق مع زوج من ملاقط. تأكد من الضغط على الداخل من مقسم في أربع زوايا (أعلى اليسار ، وانخفاض الحق ، والحق العلوي ، أسفل اليسار ، والمبينة في الرسم التخطيطي بواسطة "X").
   
   
   
   الشكل 2 : خطوات لتشحيم المفرق
   
   ملاحظة : من المهم للضغط بقوة كافية بحيث يجعل الشحوم ختم كاملة مع الطبق ، ولكن إذا تم إضافة الكثير من الضغط ، والمحاور ولن العبور الى الجانب مقصورات.
   
   التقط المرقأة ، اقلبه وunclamp المفرق. أخيرا ، ضع الطبق مع المفرق ترتبط بقوة تحت المجهر التركيز على الجزء السفلي من المقصورة المتوسطة. مع المحمل الشحوم ، وجعل حاجز صغير (0.25 سم) مرة واحدة بحيث توضع الخلايا في وسط المقصورة التي لا يمكن تسرب.
4. بعد اقامة عدة ثقافات ، ووسائل الإعلام في كل مكان DRG من المقصورات الجانبية ومكان في حاضنة التي سيتم الإبقاء على الخلايا. السماح للثقافات على الجلوس لعدة ساعات ومن ثم تحقق من وجود تسرب. إذا كانت وسائل الاعلام قد تسربت الى حجرة متوسطة ، ثم ثقافة غير قابلة للاستخدام.
   
   ملاحظة : عندما تعلم الاولى من هذا الأسلوب ، فإنه من المهم لاقامة المزيد من الثقافات وهناك حاجة لإجراء التجربة ، كما سيتم عدة تتسرب منها المياه.
   
   
   
   الشكل 3 : "جيد ضد تسرب" ثقافة
   

الحفاظ على الخلايا العصبية في الثقافات compartmented DRG

1. اليوم 1 : استبدال DRG وسائل الإعلام في المقصورات جنب مع 100ng/mL DRGN أراك + وسائل الإعلام. إجراء تشريح الخلايا وإضافة إلى مركز صحي (100،000 الخلايا).
2. يوم 2 : إضافة وسائل الاعلام + 10ng/mL أراك إلى خارج الفاصل تفلون حتى وسائل الإعلام أكثر من التدفقات حاجز الشحوم والسوائل التبادلات مع مركز صحي.
3. اليوم 3 : استبدال وسائل الإعلام في المقصورات الجانبية لDRGN 100ng/mL إهمال أراك وتحيط مع 10ng/mL DRGN إهمال أراك.
4. اليوم 6 : استبدال وسائل الإعلام في المقصورات الجانبية ل1ng/mL + أراك وتحيط مع وسائل الاعلام DRG + أراك.
5. يوم 9 : استخدام لالتجريب.
   
   
   
   
   الشكل 4 : صور IHC الهيئات الخلية والمحاوير القاصي
   
   
   
   ملاحظة : عند تغيير وسائل الإعلام ، من المهم أن نضح السائل من أعلى المقصورة الجانبية لكل منهما. أيضا ، لا تتغير أبدا وسائل الإعلام من منتصف المقصورة نفسها ، فقط من المحيط ، والسماح لها تدفق أكثر من حاجز الشحوم في المركز.
   

Discussion

في هذا الفيديو ، لقد أثبتنا كيفية إعداد وصيانة غرف compartmented لاستخدامها في زراعة الخلايا العصبية DRG. ذلك صحيح ، وهذا النظام يسمح الفصل بين خلايا الجسم من محور عصبي ، من أجل دراسة الآليات التي neurotrophins إشارة عبر محاور عصبية طويلة. لأنه ليس هناك عزلة fluidic بين المقصورات ، لأنها تتيح لتحف...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
collagen	Reagent	BD Biosciences	354249
N2-methylcellulose 400CPS	Reagent	Sel-Win Chemicals
Teflon divider	Other	Tyler Research	CAMP10	many other types of dividers are available
Pin rake	Tool	Tyler Research	Camp-PR
Grease loader	Tool	Tyler Research	Camp-GLSS
DMEM	Reagent	Fisher Scientific	MT10017CV
NGF	Reagent	PeproTech Inc	450-01
BDNF	Reagent	PeproTech Inc	450-02
High vacuum grease	Reagent	Fisher Scientific	14-635-5D
AraC	Reagent	Sigma-Aldrich	C-1768
23 gauge luer stub adapter	Tool	Fisher Scientific	427565
90° angle hemostats	Tool	Roboz Surgical Instruments Co.	RS-7035