Preparação e manutenção dos neurônios da raiz dorsal Gânglios em culturas Compartmented

Resumo

Aqui, descrevemos a técnica de preparação e manutenção de câmaras compartimentada para os neurônios sensoriais cultura do gânglio da raiz dorsal.

Resumo

Neurônios estender os processos axonal que estão longe do corpo celular para inervar tecidos-alvo, onde alvo derivado fatores de crescimento são necessários para a sobrevivência neuronal e na função. Neurotrofinas são especificamente necessárias para manter a sobrevivência e diferenciação de neurônios sensoriais que inervam mas a questão de como esses neurotrofinas-alvo derivado comunicar para o corpo celular dos neurônios que inervam tem sido uma área de pesquisa ativa por mais de 30 anos. O modelo mais comumente aceita de como sinais de neurotrofina chegar ao corpo celular propõe que a sinalização endossomos transportar este sinal retrogradamente ao longo do axônio. A fim de estudar o transporte retrógrado, um sistema de cultura foi originalmente concebido por Robert Campenot, em que os corpos celulares estão isolados de seus axônios. A técnica de preparação destas câmaras compartimentado para recapitula cultura sensorial neurônios a estimulação seletiva dos terminais dos neurônios que ocorre na liberação in vivo de seguir-alvo derivado neurotrofinas. Retrógrada eventos que requerem sinalização de longo alcance microtúbulos transporte retrógrado dependentes têm implicações importantes para o tratamento de doenças neurodegenerativas.

Protocolo

Preparação de reagentes

1. Revestimento de colágeno: colágeno casaco p35 placas de cultura de tecidos e coloque em um forno a 37 ° C por 2 dias antes da lubrificação os divisores. A concentração final de colágeno deve ser a 0,71 mg / ml diluída em HCl 0,001 N. Em seguida, adicionar 1 ml da mistura por placa.
2. Carregadores de graxa: A fim de preencher o carregador de graxa, uma seringa de 60mL primeiro deve ser preenchido com Corning graxa de vácuo. Use a seringa para encher o carregador de graxa, envolvê-la em papel alumínio e depois autoclave por 45 minutos.
3. Teflon divisores: os divisores podem ser reutilizados depois de cada experiência, mas deve primeiro ser devidamente limpos. Remover o divisor da placa, limpe toda a graxa restante e coloque em ácido sulfúrico por 2 dias. Após a remoção do ácido, lavar com água ferver, 3X por 20 minutos, deixar secar, coloque em um prato de vidro petri p100 e autoclave por 20 minutos.
4. N2-metilcelulose: Pesar 1,5 g de metilcelulose e colocá-lo em uma garrafa de 500ml. Adicionar uma barra de agitação e autoclave por 20 minutos a seca (a partir deste ponto todo o trabalho deve ser estéril). Em seguida, adicione 500 ml de soro de mídia livre (N _2), e mexa em uma sala fria até que se dissolva. Alíquota em 50 conicals mL e congelar a -20 ° C. Para trabalhar ações alíquota, uma das 50 conicals mL em tubos de 1 ml e congelar a -20 ° C.
5. DRG mídia: DMEM, 5% soro de cavalo calor inativada, e 1% de estreptomicina penicilina.
6. 100ng/mL DRGN mídia: A concentração de ações de ambas fator de crescimento neural (NGF) e cérebro fator neurotrófico derivado do cérebro (BDNF) é 1mg/mL. Diluir cada uma das neurotrofinas 1:10.000 na mídia DRG. Culturas podem ser cultivadas em NGF sozinho, isso altera o complemento de neurônios que sobrevivem nas culturas.
   
   Nota: Quando necessário, a concentração de (citosina arabinosídeo) ARAC é 1um e usado em uma concentração final de 0.3uM. Isso vai inibir o crescimento de células de Schwann e células gliais outros.
   
   
7. 10ng/ml DRGN mídia: Diluir o 100ng/mL DRGN media (1:10) com a mídia DRG.
   
   
   
   
   Figura 1. Ferramentas necessárias para set-up
   

Criação de câmaras compartimentada (iniciar este processo de 1-2 dias antes da dissecção)

1. Faça um arranhão no meio de um prato de colágeno p35 revestido com um movimento para fora.
2. 30ul lugar de metilcelulose N2-on no meio do zero. Conjunto de pratos de lado até divisor é lubrificada.
3. Anexar um adaptador de 23-gauge esboço luer para o carregador de graxa. Divisor de aderência do Teflon com um par de 90 ° hemostats ângulo e coloque-o deitado, com o divisor para cima sob um microscópio. Traçar o divisor com graxa certificando-se que cada vez que o adaptador é colocado em um novo ponto de partida o adaptador é inserido na graxa da etapa anterior para que haja uma linha contínua de graxa (ver diagrama). Uma vez que a graxa é aplicada ao divisor inteiro, por sua vez um dos pratos preparados p35 de cabeça para baixo e colocá-lo de modo que o N2 metilcelulose é sobre o compartimento do meio. Pressione para baixo no fundo do prato com um par de pinças. Certifique-se de imprensa no interior do divisor em quatro cantos (superior esquerdo, inferior direito, superior direito, inferior esquerdo, indicado no diagrama por "X").
   
   
   
   Figura 2: Passos para lubrificar o divisor
   
   Nota: É importante pressionar firmemente o suficiente para que a graxa faz uma vedação completa com o prato, mas se muita pressão é adicionado, os axônios não vai cruzar os compartimentos laterais.
   
   Pegue o hemostats, vire-o e unclamp o divisor. Por último, coloque o prato com o divisor firmemente presa sob o microscópio com foco na parte inferior do compartimento do meio. Com o carregador de graxa, fazer uma pequena barreira (0,25 centímetros), de modo que uma vez que as células são colocadas no compartimento central não podem vazar.
4. Depois de ter criado várias culturas, a mídia local DRG em cada um dos compartimentos laterais e coloque em uma incubadora na qual as células serão mantidas. Permitir que as culturas para sentar-se por várias horas e depois verificar se há vazamento. Se a mídia vazou dentro do compartimento do meio, então a cultura é inutilizável.
   
   Nota: Ao primeiro aprender esta técnica, é importante a criação de culturas mais do que o necessário para uma experiência, como várias será furado.
   
   
   
   Figura 3: "Boa vs leaky" cultura
   

Manutenção de neurônios DRG em culturas compartmented

1. Dia 1: Substituir DRG media nos compartimentos laterais com 100ng/mL DRGN media + ARAC. Realizar dissecção e adicionar células para o compartimento central (100 mil células).
2. Dia 2: Adicionar 10ng/ml media + ARAC para o exterior do divisor de Teflon até que a mídia flui sobre a barreira de graxa e fluido intercâmbio com o compartimento central.
3. Dia 3: Substitua media nos compartimentos laterais para 100ng/mL DRGN omitindo a ARAC eo surround com 10ng/ml DRGN omitindo a ARAC.
4. Dia 6: Substitua media nos compartimentos laterais para 1ng/mL + ARAC eo surround com DRG media + ARAC.
5. Dia 9: Use para a experimentação.
   
   
   
   
   Figura 4: imagens IHC de corpos celulares e axônios distais
   
   
   
   Nota: Ao mudar a mídia, é importante para aspirar o líquido da parte superior do compartimento de cada lado. Além disso, nunca alterar a mídia a partir do compartimento central em si, apenas a partir do surround, e deixe fluir por cima da barreira de graxa no centro.
   

Discussão

Neste vídeo, demonstramos como se preparar e manter câmaras compartimentado para uso em neurônios DRG cultura. Feito corretamente, este sistema permite a separação do corpo celular do axônio para estudar mecanismos pelos quais neurotrofinas sinal através axônios longos. Uma vez que não é o isolamento fluídico entre os compartimentos, que permite a estimulação seletiva ou tratamento de um compartimento sem a outros compartimentos sendo afetados. Culturas câmara compartimentada pode suportar outros tipos de células, incluindo n...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
collagen	Reagent	BD Biosciences	354249
N2-methylcellulose 400CPS	Reagent	Sel-Win Chemicals
Teflon divider	Other	Tyler Research	CAMP10	many other types of dividers are available
Pin rake	Tool	Tyler Research	Camp-PR
Grease loader	Tool	Tyler Research	Camp-GLSS
DMEM	Reagent	Fisher Scientific	MT10017CV
NGF	Reagent	PeproTech Inc	450-01
BDNF	Reagent	PeproTech Inc	450-02
High vacuum grease	Reagent	Fisher Scientific	14-635-5D
AraC	Reagent	Sigma-Aldrich	C-1768
23 gauge luer stub adapter	Tool	Fisher Scientific	427565
90° angle hemostats	Tool	Roboz Surgical Instruments Co.	RS-7035