بتمويل من مؤسسة العلوم الوطنية (وسط).

مقدمة وOMT هو تكييف نظام الحبل المغناطيسي [1] تهدف إلى إدماج &quot;محاكاة عمود افتراضية&quot;. والبروتوكولات التالية تشرح كيفية الذباب الحبل بشكل صحيح (جزء 1) وتقديم استراتيجيات لإعداد مغناطيس (جزء 2) وكتلة التدفق التسليم رائحة ينظم النظام (Part3). هو الأمثل للمعلومات وصفها هنا لنظام معين وهذا قد تختلف عن المكونات مع المواصفات التقنية الأخرى. الجزء 1 : الربط الذباب خطوات الربط الموصوفة هنا مشابهة لكثير من الدراسات السابقة [2] ولكن تكييفها لاستخدامها في السياحة العالمية [3]. الربط المناسبة أمر حاسم لضمان إجراء محاكمات تجريبية قوية وقابلة للتكرار. لا يمكن على أهمية الربط الدقيق لا يمكن المبالغة فيها. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> جمع الذباب 4-6 eclosion آخر أيام وتجويعهم لمدة 4-6 ساعات. kimwipe مكان مبلل بالماء في القنينة لمنع جفاف foodless. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نقل دفعة من الذباب من زجاجة إلى قارورة صغيرة وأدخلها في كتلة النحاس في مرحلة التبريد بلتيير وضعت في حوالي 4 درجات مئوية. درجة الحرارة المناسبة يخدر الذباب داخل ما يقرب من 30 ثانية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> فرز الذباب على السطح البارد للمرحلة التبريد. A Kimwipe رطبة يضمن تبريد مستمر وفتل الرطوبة من إهاب. حدد أكبر من الإناث عن الربط. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> باستخدام فرشاة غرامة ، ودفع ذبابة واحدة في موقف في التابوت مبنية خصيصا لاستيعاب شكل واحد البرية ذبابة الفاكهة نوع من الإناث. <img src="/files/ftp_upload/old/1063_2008_11_26_2/1063_Figure-01_thumb.png" alt="" /> الشكل 1. <a href="https://www.jove.com/files/1063_2008_10_28_1/1063_Figure-01.png">الرجاء النقر هنا لرؤية نسخة أكبر من الرقم.</a> </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نحن موقف دبوس minutien (الغرامات أدوات العلوم) بقضيب مغناطيسي شنت على micromanipulator. دبوس هو أن تكون مثل هذه محاذاة نهاية حادة اللمسات القفص الصدري الظهري خلف الرأس بين الجناحين. ينبغي أن تكون رأسية دبوس تماما عندما ينظر اليها وجها لوجه في اتجاه العينين. لا يمكن حتى كمية صغيرة من &quot;لفة&quot; بين الذبابة ودبوس يمكن السكوت عنه. ينبغي زاوية جانبية النظر بين دبوس ومحور طويل من الجسم تكون في زاوية الانف حتى 30 درجة بالنسبة إلى الأفق (الشكل 1). ملاحظة : للحصول على التشغيل الأمثل في الحبل المغناطيس ، ودبابيس قد تحتاج إلى قطع لأطوال أقصر. هذا سيعتمد كليا على المسافة بين المغناطيس التعليق. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> حالما يتم محاذاة minutien دبوس ، واستخدام أسلاك الفولاذ رقيقة لتطبيق قطرة صغيرة من الأشعة فوق البنفسجية التي تنشط الغراء (ElectroLite كورب) إلى نهاية حادة من طرف minutien. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> التلاعب دبوس حتى قطرة الغراء اللمسات الصدر الذبابة فقط فوق رأسه. مع انخفاض حجم المناسبة ، يجب أن يصلب الغراء وتدفق من دبوس على القفص الصدري. يجب الحرص على عدم استخدام الغراء كثيرا. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> علاج الغراء مع اثنين من 20 رشقات الثانية من الأشعة فوق البنفسجية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ضع جانبا الطيران الثابتة وتكرار. شريحة صغيرة من المربعات Kimwipe بالملقط وتعطي واحدة ليطير كل المربوطة لكبح الرحلة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بعد ساعة واحدة من الانتعاش ، والذباب المربوطة على استعداد لإجراء التجارب. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> قد تعيق قدرة غير لائق الإلتصاق ذبابة على الأداء في الساحة المغناطيس. يجب فحص كل يطير للتناوب على نحو سلس في بداية كل تجربة للتأكد من لصقها بشكل صحيح الذباب. ويمكن تحقيق ذلك عن طريق تناوب نمط شريطية مع فترة المكانية كبيرة بما فيه الكفاية للحصول على ردود قوية optomotor [4]. إذا تم لصقها على ذبابة في زاوية الملعب خاطئ أو مائلة على طرف فيما يتعلق المحور لفة ، وربما يطير (ط) لا تدور على الإطلاق ، (الثاني) لديها مجموعة محدودة من الحركة ، أو (الثالث) في تدوير يتعارض السرعة. وينبغي في الحالات المذكورة أعلاه يمكن تجاهل يطير واستبدالها بأخرى جديدة. إذا كان هذا لا يحل المشكلة لأنه على الأرجح حالة من الإلتصاق غير لائق. (إذا كان استبدال ذبابة لا يحل المشكلة ، راجع الجزء 2.4) </li></ol> الجزء 2 : محاذاة المغناطيس محاذاة مغناطيس (النادرة الأرض وmagnets.com) هو صحيح اللازمة للسفر إلى تحقيق سلاسة نطاق 360 درجة من الحركة. اتبع الخطوات التالية لمحاذاة بشكل صحيح المغناطيس. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وعقدت حلقة أفقيا المغناطيس أقل من الغلاف البلاستيكي ووضعها مباشرة في أعلى غرفة فراغ واضح (الشكل 1 ؛ صفها بمزيد من التفصيل في الجزء 3). تم إصلاح قضيب المغناطيس العلوي عموديا تقريبا 3 / 4 &quot;فوق أدنى المغناطيس. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> محاذاة تقريبا المغناطيس العلوي والسفلي بصريا عن طريق وضع قضيب المغناطيس العلوي مباشرة فوق نقطة وسط انخفاض المغناطيس الدائري. فمن المفيد أن نعلق المغناطيس العلوي إلى micromanipulator (Siskiyou شركة) لتعديل حجم الغرامة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الايبوكسي تأثير V - جوهرة (أجزاء صغيرة) على السطح السفلي من المغناطيس العلوي لتقليل الاحتكاك وتوحيد المواقع التناوب الطيران. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وضع الطيران في الساحة وضبط الأفقي والخامسيمكن وضع ertical من المغناطيس العلوي حتى يطير بشكل سلس ومطرد تدوير 360 درجة في محور ياو. يجب فحص كل يطير للتناوب على نحو سلس في بداية كل تجربة للتأكد من محاذاة بشكل صحيح والمغناطيس لا التالفة التي دبابيس minutien الفردية (انظر الجزء 1.11). إذا لم يتم بشكل صحيح محاذاة المغناطيس قد يطير (ط) لا تدور على الإطلاق (الثاني) لديها مجموعة محدودة من الحركة (ج) تناوب على سرعات غير متناسقة. إذا تم حل المشكلة عن طريق استبدال يطير مع واحدة جديدة ، كانت على الأرجح بسبب مشكلة الإلتصاق (انظر الجزء 1). إذا كانت هذه المشاكل موجودة في كل ذبابة ، فمن المرجح مشكلة مع المواءمة بين المغناطيس ، وسوف تكون هناك حاجة مزيد من التعديل. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تحذير : بينما كان يلعب مع مغناطيس الأرضية النادرة يمكن أن تكون ممتعة ، لأنها خطرة جدا. سوء النتائج في المعدات المتضررة و / أو ضرر جسدي طفيفة. توخي الحذر الشديد مع هذه مغناطيس المغري بعد الاستهانة بسهولة. </li></ol> الجزء 3 : تسليم رائحة <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ويستند نظام التسليم الرائحة على أحد الموصوفة سابقا [5] و هو الجزء الاصعب لتحسين (الشكل 1). انها تتطلب الكثير من الصبر والتجربة والخطأ. اتبع هذه الخطوات لتحقيق الاستقرار تتبع الرائحة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> مجموعة المتابعة الأولية للنظام رائحة يتطلب تشغيل أنابيب ضيقة تفلون قياس (أجزاء صغيرة) من الغاز المضاعف (سابل الأنظمة الدولية) إلى قوارير المياه المخصصة / الرائحة بناؤها. المخرج من هذه القوارير يربط مباشرة إلى ميناء أنابيب تحت الجلد باستخدام أنابيب من التفلون نفسه. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> يتم وضع فراغ الغرفة واضحة الاكريليك تحت الساحة لدعم المغناطيس. نستخدم أنبوب زجاجي 4mm شنت تحت ذبابة متصلا فراغ الغرفة لتحقيق الفراغ افتتاح أقرب إلى الطيران وتخفيض القطر من الافتتاح. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> مكان ذبابة المربوطة الى الساحة باستخدام ملقط. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بدوره على رائحة جذابة (خل التفاح يعمل بشكل جيد) ، والتحقق بصريا أن يطير المسارات رائحة. إذا كانت تطير على ما يبدو ليس لديه تفضيل لرائحة ، اتبع الخطوات الثلاث التالية. وهذا قد يتطلب عدة الذباب ، وعدة محاكمات. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ضبط موضع الميناء الرائحة حتى يطير ويبدو أن تتبع الرائحة. شنت علينا المنافذ على رائحة micromanipulators (Siskiyou شركة) والمتمركزة 4mm الأمامية الظهرية و3mm ل رأس ذبابة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ضبط معدل التدفق الجماعي حتى يطير ويبدو أن تتبع الرائحة. ضبط لدينا هي 7ml/min (سابل أنظمة الدولية MFC - 4). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ضبط معدل تدفق الفراغ حتى يطير ويبدو أن تتبع الرائحة. وضعنا معدل التدفق في فراغ 13l/min باستخدام منظم التدفق (كول Parmer). ملاحظة : بناء خطوط الإمداد فراغ يمكن أن يتغير بمرور الوقت يسبب تقلبات في هيكل عمود. قد يكون من المفيد لتوصيل مضخة فراغ خارجي لمنظم التدفق المستمر لظروف تدفق الفراغ. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> حالما يتم تعيين موضع الميناء ومعدلات التدفق ، والتبديل دوريا بين بخار الماء والبخار تقديم رائحة باستخدام المضاعف للتحويل باستخدام الغاز والتحقق بصريا أن يطير المسارات فقط عندما رائحة رائحة غير. أحيانا ، يمكن أن رائحة المتبقية داخل الميناء رائحة تثير تتبع الرائحة عند تشغيل رائحة الخروج. ويمكن التخلص من هذا المنفذ دون إزالة الرائحة وضعه بشكل صحيح عن طريق ملء أنابيب تحت الجلد مع الإيثانول وجمع مثل هذه المعلومات في نهاية التسليم مع Kimwipe. استخدام الهواء المضغوط ، أي ضربة من الايثانول المتبقية واستئناف التجارب. </li></ol> ممثل النتائج : وينبغي عند اتباع هذه الخطوات بشكل صحيح يمكن ملاحظة أمرين. أولا ، تحت مؤثرات بصرية ثابتة الدورية ينبغي ذبابة المربوطة وضعها في OMT بسلاسة تدوير 360 درجة في محور ياو. &quot;متشنج&quot; يتحول (وتسمى saccades) هي سمة السلوك العفوي تحول في غياب محفزات بصرية ثابتة. إذا كان الذباب لا يمكن أن يبدو تدوير بسلاسة ، قد لصق غير لائق (انظر الجزء 1) والمغناطيس المنحرفة يمكن القاء اللوم على (انظر الجزء 2). الثانية ، عندما يتم تشغيل على رائحة ، ينبغي أن يطير رأسه في اتجاه الرائحة. عند تشغيل قبالة رائحة ، ينبغي أن يطير رمش عفويا دون تفضيل أي موقف واحد في الساحة. إذا الذباب قد لا تتبع بنشاط السحابة رائحة ، والموقف من الميناء الرائحة ، ومعدل تدفق الهواء و / أو معدل تدفق فراغ تحتاج إلى تعديل (انظر الجزء 3).

<ol>
	<li>Bender, J. A., Dickinson, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visual+stimulation+of+saccades+in+magnetically+tethered+Drosophila.">Visual stimulation of saccades in magnetically tethered Drosophila.</a> J. Exp. Biol. 209, 3170-3182 (2006).</li><li>Tammero, L. F., Dickinson, M. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Collision-avoidance+and+landing+responses+are+mediated+by+separate+pathways+in+the+fruit+fly,+Drosophila+melanogaster.">Collision-avoidance and landing responses are mediated by separate pathways in the fruit fly, Drosophila melanogaster.</a> J. Exp. Biol. 205, 2785-2798 (2002).</li><li>Duistermars, B. J., Frye, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Crossmodal+visual+input+for+odor+tracking+during+fly+flight.">Crossmodal visual input for odor tracking during fly flight.</a> Curr. Biol. 18, 270-275 (2008).</li><li>Reiser, M. B., Dickinson, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+modular+display+system+for+insect+behavioral+neuroscience.">A modular display system for insect behavioral neuroscience.</a> J. Neurosci. Methods. 167, 127-139 (2008).</li><li>Frye, M. A., Dickinson, M. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Motor+output+reflects+the+linear+superposition+of+visual+and+olfactory+inputs+in+Drosophila.">Motor output reflects the linear superposition of visual and olfactory inputs in Drosophila.</a> J. Exp. Biol. 207, 123-131 (2004).</li></ol>

الربط الذباب وانتزاع مستقرة تتبع الرائحة في هذا المجال واضحة نسبيا. فإنه يتطلب ممارسة وصبر والتجربة والخطأ. يمكن أن أجزاء كثيرة من هذه الساحة الأمثل أخرى أو استبدال لانتاج التغيرات المحتملة في التجريبية. على سبيل المثال ، أحدث الإصدارات من فراغ الغرفة هي أصغر بكثير ، وإتاحة الم...

<!DOCTYPE html PUBLIC "-//W3C//DTD XHTML 1.0 Transitional//EN" "http://www.w3.org/TR/xhtml1/DTD/xhtml1-transitional.dtd">
<html xmlns="http://www.w3.org/1999/xhtml" xml:lang="en" lang="en">	
		
		<div>
		<table border="1">
		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>Cooling Stage</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Teca</td>
<td>LHP-300CP</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Brass Cooling Block</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Custom Machined</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>~4 x 8 x 2cm</td>
</tr>
<tr>
<td>Sarcophagus</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Custom Machined</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Contact us for details</td>
</tr>
<tr>
<td>UV-Activated Glue</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Kemxert corp</td>
<td>KOA300</td>
<td>1oz bottle lasts years</td>
</tr>
<tr>
<td>Panel System</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Caltech</td>
<td>http://www.dickinson.caltech.edu/panels</td>
<td>[4]</td>
</tr>
<tr>
<td>Minutien Pins</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fine Science Tools</td>
<td>26002-20</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Lower Ring Magnets</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Rare-earth-magnets.com</td>
<td>NSN0615</td>
<td>5 - 0.75"o.d. x 0.375" i.d. x 0.125"</td>
</tr>
<tr>
<td>Upper Rod Magnet</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Rare-earth-magnets.com</td>
<td>NSN0750</td>
<td>0.125" x 1"</td>
</tr>
<tr>
<td>V-Jewel Bearing</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Small Parts</td>
<td>VJ-0469-01</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>MFC-4 Flow Regulators</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sable Systems International</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Gas Multiplexer</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sable Systems International</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Teflon Tubing</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Small Parts</td>
<td>STT-20-C</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>20 Gauge Hypodermic Tubes</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Small Parts</td>
<td>HTX-20R-06</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Glass Tubing</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>4mm o.d.</td>
</tr>
<tr>
<td>Vacuum Flow Regulator</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Cole Parmer</td>
<td>EW-32464-52</td>
<td>&nbsp;</td>		</tbody>
		</table>
		</div>

a magnetic tether system to investigate visual and olfactory mediated flight control in drosophila

فقد كان واضحا منذ سنوات عديدة أن الحشرات استخدام الإشارات البصرية لتحقيق الاستقرار في البند في تيار الرياح. كثير من الحيوانات تتبع الروائح نفذت في مهب الريح. مثل الاستقرار البصري عكس الريح تتبع مساعدات مباشرة في تتبع الرائحة. ولكن لا تؤثر تأثيرا مباشرا الاشارات البصرية الشمية السلوك تتبع بشكل مستقل عن إشارات الريح؟ أيضا ، كان الدافع وراء طوفان الأخيرة للبحث في علم الأعصاب وعلم الوراثة في السلوك العصبي في ذبابة الفاكهة الشم المقايسات سلوكية أكثر تطورا من الناحية التقنية والكمية. هنا ، علينا تعديل نظام الحبل المغناطيسي وضعت أصلا لتجارب الرؤية من خلال تجهيز الساحة الضيقة مع أعمدة رائحة تدفق الصفحي. يتم لصقها وتطير إلى دبوس الصلب الصغيرة وعلقت في مجال مغناطيسي التي تمكنه من ياو بحرية. وتوجه أعمدة صغيرة قطرها رائحة الطعام النزولي على رأس يطير ثانية ، تتبع انتزاع مستقرة ذبابة الجياع. هنا علينا أن نركز على اليات حرجة من الربط والتوفيق بين المغناطيس ، ووضع عمود رائحة ، وتأكيد استقرار تتبع الرائحة.

Watch this Scientific Journal Video about A Magnetic Tether System to Investigate Visual and Olfactory Mediated Flight Control in Drosophila at JoVE.com

A Magnetic Tether System to Investigate Visual and Olfactory Mediated Flight Control in Drosophila

نحن هنا تصف كيفية الحبل ذبابة في جهاز الشم الحبل المغناطيسي (OMT). ونحن تصف كيفية محاذاة مغناطيس الأرضية النادرة والموانئ رائحة ، وكيفية تعيين معدلات التدفق الجماهيري على حد سواء وتقديم الحوافز لشفط فراغ إلى تحقيق أقصى قدر تتبع الرائحة.

: نظام الحبل المغناطيسي بالتحقيق البصرية والشمية التحكم الطيران توسط في ذبابة الفاكهة

It has been clear for many years that insects use visual cues to stabilize their heading in a wind stream. Many animals track odors carried in the wind. ...

a-magnetic-tether-system-to-investigate-visual-olfactory-mediated

Research

JoVE Journal

Biology

11.2K Views.  University of California, Los Angeles. نحن هنا تصف كيفية الحبل ذبابة في جهاز الشم الحبل المغناطيسي (OMT). ونحن تصف كيفية محاذاة مغناطيس الأرضية النادرة والموانئ رائحة ، وكيفية تعيين معدلات التدفق الجماهيري على حد سواء وتقديم الحوافز لشفط فراغ إلى تحقيق أقصى قدر تتبع الرائحة.

Video: A Magnetic Tether System to Investigate Visual and Olfactory Mediated Flight Control in Drosophila

Visually Mediated Odor Tracking During Flight in Drosophila

Flying insects use visual cues to stabilize their heading in a wind stream. Many animals additionally track odors carried in the wind. As such, visual stabilization of upwind tracking directly aids in odor tracking. But do olfactory signals directly influence visual tracking behavior independently from wind cues? Additionally, recent advances in olfactory molecular genetics and neurophysiology have motivated novel quantitative behavioral analyses to assess the behavioral influence of (e.g.) genetically inactivating specific olfactory activation circuits. We modified a magnetic tether system originally devised for vision experiments by equipping the arena with narrow laminar flow odor plumes. Here we focus on experiments that can be performed after a fly is tethered and is able to navigate in the magnetic arena. We show how to acquire video images optimized for measuring body angle, how to judge stable odor tracking, and we illustrate two experiments to examine the influence of visual cues on odor tracking.

Here we describe how to optimize the acquired video image for an olfactory magnetic-tether (OMT) apparatus. We also describe two sample experimental protocols for studying visuo-olfactory fusion.

تتبع الرائحة بصريا وساطة خلال الطيران في ذبابة الفاكهة

Flying insects use visual cues to stabilize their heading in a wind stream. Many animals additionally track odors carried in the wind. As such, visual ...

Single-cell Suction Recordings from Mouse Cone Photoreceptors

Rod and cone photoreceptors in the retina are responsible for light detection. In darkness, cyclic nucleotide-gated (CNG) channels in the outer segment are open and allow cations to flow steadily inwards across the membrane, depolarizing the cell. Light exposure triggers the closure of the CNG channels, blocks the inward cation current flow, and thus results in cell hyperpolarization. Based on the polarity of photoreceptors, a suction recording method was developed in 1970s that, unlike the classic patch-clamp technique, does not require penetrating the plasma membrane 1. Drawing the outer segment into a tightly-fitting glass pipette filled with extracellular solution allows recording the current changes in individual cells upon test-flash exposure. However, this well-established "outer-segment-in (OS-in)" suction recording is not suitable for mouse cone recordings, because of the low percentage of cones in the mouse retina (3%) and the difficulties in identifying the cone outer segments. Recently, an inner-segment-in (IS-in) recording configuration was developed to draw the inner segment/nuclear region of the photoreceptor into the recording pipette 2,3. In this video, we will show how to record from individual mouse cone photoresponses using single-cell suction electrode.

We will show how to record flash responses from single mouse cones using a suction electrode.

تسجيلات شفط وحيدة الخلية المستقبلة من المخروط ماوس

Rod and cone photoreceptors in the retina are responsible for light detection. In darkness, cyclic nucleotide-gated (CNG) channels in the outer segment ...

A Practical Approach to Genetic Inducible Fate Mapping: A Visual Guide to Mark and Track Cells In Vivo

Fate maps are generated by marking and tracking cells in vivo to determine how progenitors contribute to specific structures and cell types in developing and adult tissue. An advance in this concept is Genetic Inducible Fate Mapping (GIFM), linking gene expression, cell fate, and cell behaviors in vivo, to create fate maps based on genetic lineage.
GIFM exploits X-CreER lines where X is a gene or set of gene regulatory elements that confers spatial expression of a modified bacteriophage protein, Cre recombinase (CreERT). CreERT contains a modified estrogen receptor ligand binding domain which renders CreERT sequestered in the cytoplasm in the absence of the drug tamoxifen. The binding of tamoxifen releases CreERT, which translocates to the nucleus and mediates recombination between DNA sequences flanked by loxP sites. In GIFM, recombination typically occurs between a loxP flanked Stop cassette preceding a reporter gene such as GFP.
Mice are bred to contain either a region- or cell type-specific CreER and a conditional reporter allele. Untreated mice will not have marking because the Stop cassette in the reporter prevents further transcription of the reporter gene. We administer tamoxifen by oral gavage to timed-pregnant females, which provides temporal control of CreERT release and subsequent translocation to the nucleus removing the Stop cassette from the reporter. Following recombination, the reporter allele is constitutively and heritably expressed. This series of events marks cells such that their genetic history is indelibly recorded. The recombined reporter thus serves as a high fidelity genetic lineage tracer that, once on, is uncoupled from the gene expression initially used to drive CreERT.
We apply GIFM in mouse to study normal development and ascertain the contribution of genetic lineages to adult cell types and tissues. We also use GIFM to follow cells on mutant genetic backgrounds to better understand complex phenotypes that mimic salient features of human genetic disorders.
This video article guides researchers through experimental methods to successfully apply GIFM. We demonstrate the method using our well characterized Wnt1-CreERT;mGFP mice by administering tamoxifen at embryonic day (E)8.5 via oral gavage followed by dissection at E12.5 and analysis by epifluorescence stereomicroscopy. We also demonstrate how to micro-dissect fate mapped domains for explant preparation or FACS analysis and dissect adult fate-mapped brains for whole mount fluorescent imaging. Collectively, these procedures allow researchers to address critical questions in developmental biology and disease models.

A Practical Approach to Genetic Inducible Fate Mapping: A Visual Guide to Mark and Track Cells In Vivo

Genetic Inducible Fate Mapping (GIFM) marks and tracks cells with fine spatial and temporal control in vivo and elucidates how cells from a specific genetic lineage contribute to developing and adult tissues. Demonstrated here are the techniques required to fate map E12.5 mouse embryos for epifluorescent and explant analysis.

نهج عملي لرسم الخرائط الوراثية محرض مصير : دليل مرئي لمارك وتعقب خلايا في فيفو</em

Fate maps are generated by marking and tracking cells in vivo to determine how progenitors contribute to specific structures and cell types in developing ...

Rapid Homogeneous Detection of Biological Assays Using Magnetic Modulation Biosensing System

A magnetic modulation biosensing system (MMB) [1,2] rapidly and homogeneously detected biological targets at low concentrations without any washing or separation step. When the IL-8 target was present, a 'sandwich'-based assay attached magnetic beads with IL-8 capture antibody to streptavidin coupled fluorescent protein via the IL-8 target and a biotinylated IL-8 antibody. The magnetic beads are maneuvered into oscillatory motion by applying an alternating magnetic field gradient through two electromagnetic poles. The fluorescent proteins, which are attached to the magnetic beads are condensed into the detection area and their movement in and out of an orthogonal laser beam produces a periodic fluorescent signal that is demodulated using synchronous detection. The magnetic modulation biosensing system was previously used to detect the coding sequences of the non-structural Ibaraki virus protein 3 (NS3) complementary DNA (cDNA) [2]. The techniques that are demonstrated in this work for external manipulation and condensation of particles may be used for other applications, e.g. delivery of magnetically-coupled drugs in-vivo or enhancing the contrast for in-vivo imaging applications.

Magnetic modulation biosensing system is utilized to rapidly, sensitively and simply detect biological assays, such as DNA molecules and proteins.

متجانسة الكشف السريع عن طريق فحوصات البيولوجي المغناطيسي نظام Biosensing التحوير

A magnetic modulation biosensing system (MMB) [1,2] rapidly and homogeneously detected biological targets at low concentrations without any washing or ...

Lipid Vesicle-mediated Affinity Chromatography using Magnetic Activated Cell Sorting (LIMACS): a Novel Method to Analyze Protein-lipid Interaction

The analysis of lipid protein interaction is difficult because lipids are embedded in cell membranes and therefore, inaccessible to most purification procedures. As an alternative, lipids can be coated on flat surfaces as used for lipid ELISA and Plasmon resonance spectroscopy. However, surface coating lipids do not form microdomain structures, which may be important for the lipid binding properties. Further, these methods do not allow for the purification of larger amounts of proteins binding to their target lipids.
 To overcome these limitations of testing lipid protein interaction and to purify lipid binding proteins we developed a novel method termed lipid vesicle-mediated affinity chromatography using magnetic-activated cell sorting (LIMACS). In this method, lipid vesicles are prepared with the target lipid and phosphatidylserine as the anchor lipid for Annexin V MACS. Phosphatidylserine is a ubiquitous cell membrane phospholipid that shows high affinity to the protein Annexin V. Using magnetic beads conjugated to Annexin V the phosphatidylserine-containing lipid vesicles will bind to the magnetic beads. When the lipid vesicles are incubated with a cell lysate the protein binding to the target lipid will also be bound to the beads and can be co-purified using MACS. This method can also be used to test if recombinant proteins reconstitute a protein complex binding to the target lipid. 
 We have used this method to show the interaction of atypical PKC (aPKC) with the sphingolipid ceramide and to co-purify prostate apoptosis response 4 (PAR-4), a protein binding to ceramide-associated aPKC. We have also used this method for the reconstitution of a ceramide-associated complex of recombinant aPKC with the cell polarity-related proteins Par6 and Cdc42. Since lipid vesicles can be prepared with a variety of sphingo- or phospholipids, LIMACS offers a versatile test for lipid-protein interaction in a lipid environment that resembles closely that of the cell membrane. Additional lipid protein complexes can be identified using proteomics analysis of lipid binding protein co-purified with the lipid vesicles.

Lipid Vesicle-mediated Affinity Chromatography using Magnetic Activated Cell Sorting LIMACS: a Novel Method to Analyze Protein-lipid Interaction

To test the interaction of a protein with its target lipid we used MACS and Annexin V-conjugated magnetic beads and lipid vesicles synthesized from the target lipid and Annexin V-binding phosphatidylserine. Proteins bound to the target lipid are co-purified and analyzed after elution from the beads.

الكروماتوجراف الدهون تقارب الحويصلة بوساطة الفرز المغناطيسي باستخدام خلية المنشط (LIMACS) : طريقة جديدة لتحليل البروتين الدهني التفاعل

The analysis of lipid protein interaction is difficult because lipids are embedded in cell membranes and therefore, inaccessible to most purification ...

RNAi Screening to Identify Postembryonic Phenotypes in C. elegans

C. elegans has proven to be a valuable model system for the discovery and functional characterization of many genes and gene pathways1. More sophisticated tools and resources for studies in this system are facilitating continued discovery of genes with more subtle phenotypes or roles. 
Here we present a generalized protocol we adapted for identifying C. elegans genes with postembryonic phenotypes of interest using RNAi2. This procedure is easily modified to assay the phenotype of choice, whether by light or fluorescence optics on a dissecting or compound microscope. This screening protocol capitalizes on the physical assets of the organism and molecular tools the C. elegans research community has produced. As an example, we demonstrate the use of an integrated transgene that expresses a fluorescent product in an RNAi screen to identify genes required for the normal localization of this product in late stage larvae and adults. First, we used a commercially available genomic RNAi library with full-length cDNA inserts. This library facilitates the rapid identification of multiple candidates by RNAi reduction of the candidate gene product. Second, we generated an integrated transgene that expresses our fluorecently tagged protein of interest in an RNAi-sensitive background. Third, by exposing hatched animals to RNAi, this screen permits identification of gene products that have a vital embryonic role that would otherwise mask a post-embryonic role in regulating the protein of interest. Lastly, this screen uses a compound microscope equipped for single cell resolution.

RNAi Screening to Identify Postembryonic Phenotypes in C. elegans

We describe a sensitized method to identify postembryonic regulators of protein expression and localization in C. elegans using an RNAi-based genomic screen and an integrated transgene that expresses a functional, fluorescently tagged protein.

[رني الفرز لتحديد الظواهر تال للمرحلة الجنينية في C. ايليجانس</em

C. elegans has proven to be a valuable model system for the discovery and functional characterization of many genes and gene pathways1. More sophisticated ...

Quantitative Measurement of Invadopodia-mediated Extracellular Matrix Proteolysis in Single and Multicellular Contexts

Cellular invasion into local tissues is a process important in development and homeostasis. Malregulated invasion and subsequent cell movement is characteristic of multiple pathological processes, including inflammation, cardiovascular disease and tumor cell metastasis1. Focalized proteolytic degradation of extracellular matrix (ECM) components in the epithelial or endothelial basement membrane is a critical step in initiating cellular invasion. In tumor cells, extensive in vitro analysis has determined that ECM degradation is accomplished by ventral actin-rich membrane protrusive structures termed invadopodia2,3. Invadopodia form in close apposition to the ECM, where they moderate ECM breakdown through the action of matrix metalloproteinases (MMPs). The ability of tumor cells to form invadopodia directly correlates with the ability to invade into local stroma and associated vascular components3. 
Visualization of invadopodia-mediated ECM degradation of cells by fluorescent microscopy using dye-labeled matrix proteins coated onto glass coverslips has emerged as the most prevalent technique for evaluating the degree of matrix proteolysis and cellular invasive potential4,5. Here we describe a version of the standard method for generating fluorescently-labeled glass coverslips utilizing a commercially available Oregon Green-488 gelatin conjugate. This method is easily scaled to rapidly produce large numbers of coated coverslips. We show some of the common microscopic artifacts that are often encountered during this procedure and how these can be avoided. Finally, we describe standardized methods using readily available computer software to allow quantification of labeled gelatin matrix degradation mediated by individual cells and by entire cellular populations. The described procedures provide the ability to accurately and reproducibly monitor invadopodia activity, and can also serve as a platform for evaluating the efficacy of modulating protein expression or testing of anti-invasive compounds on extracellular matrix degradation in single and multicellular settings.

We describe the prototypical method for producing microscope coverslips coated with fluorescent gelatin for visualizing invadopodia-mediated matrix degradation. Computational techniques using available software are presented for quantifying the resultant levels of matrix proteolysis by single cells within a mixed population and for multicellular groups encompassing entire microscopic fields.

قياس كمية Invadopodia بوساطة التحلل البروتيني المصفوفة خارج الخلية في سياقات متعددة الخلايا واحدة و

Cellular invasion into local tissues is a process important in development and homeostasis.  Malregulated invasion and subsequent cell movement is ...

Design and Analysis of Temperature Preference Behavior and its Circadian Rhythm in Drosophila

The circadian clock regulates many aspects of life, including sleep, locomotor activity, and body temperature (BTR) rhythms1,2. We recently identified a novel Drosophila circadian output, called the temperature preference rhythm (TPR), in which the preferred temperature in flies rises during the day and falls during the night 3. Surprisingly, the TPR and locomotor activity are controlled through distinct circadian neurons3. Drosophila locomotor activity is a well&#160;known circadian behavioral output and has provided strong contributions to the discovery of many conserved mammalian circadian clock genes and mechanisms4. Therefore, understanding TPR will lead to the identification of hitherto unknown molecular and cellular circadian mechanisms. Here, we describe how to perform and analyze the TPR assay. This technique not only allows for dissecting the molecular and neural mechanisms of TPR, but also provides new insights into the fundamental mechanisms of the brain functions that integrate different environmental signals and regulate animal behaviors. Furthermore, our recently published data suggest that the fly TPR shares features with the mammalian BTR3. Drosophila are ectotherms, in which the body temperature is typically behaviorally regulated. Therefore, TPR is a strategy used to generate a rhythmic body temperature in these flies5-8. We believe that further exploration of Drosophila TPR will facilitate the characterization of the mechanisms underlying body temperature control in animals.

Design and Analysis of Temperature Preference Behavior and its Circadian Rhythm in Drosophila

We recently identified a novel Drosophila circadian output, temperature preference rhythm (TPR), in which the preferred temperature in flies rises during the day and falls during the night. TPR is regulated independently from another circadian output, locomotor activity. Here&#160;we describe the design and analysis of TPR in Drosophila.

تصميم وتحليل سلوك تفضيل درجة الحرارة وإيقاعها Circadian في Drosophila

The circadian clock regulates many aspects of life, including sleep, locomotor activity, and body temperature (BTR) rhythms1,2. We recently identified a ...

An Improved Method for Accurate and Rapid Measurement of Flight Performance in Drosophila

Drosophila has proven to be a useful model system for analysis of behavior, including flight. The initial flight tester involved dropping flies into an oil-coated graduated cylinder; landing height provided a measure of flight performance by assessing how far flies will fall before producing enough thrust to make contact with the wall of the cylinder. Here we describe an updated version of the flight tester with four major improvements. First, we added a &#34;drop tube&#34; to ensure that all flies enter the flight cylinder at a similar velocity between trials, eliminating variability between users. Second, we replaced the oil coating with removable plastic sheets coated in Tangle-Trap, an adhesive designed to capture live insects. Third, we use a longer cylinder to enable more accurate discrimination of flight ability. Fourth we use a digital camera and imaging software to automate the scoring of flight performance. These improvements allow for the rapid, quantitative assessment of flight behavior, useful for large datasets and large-scale genetic screens.

An Improved Method for Accurate and Rapid Measurement of Flight Performance in Drosophila

Here we describe a method for rapid and accurate measurement of flight performance in Drosophila, enabling high-throughput screening.

لتحسين طريقة لقياس دقة وسرعة الأداء في الطيران<em&gt; ذبابة الفاكهة</em

Drosophila has proven to be a useful model system for analysis of behavior, including flight. The initial flight tester involved dropping flies into an ...

Validation of a Mouse Model to Disrupt LINC Complexes in a Cell-specific Manner

Nuclear migration and anchorage within developing and adult tissues relies heavily upon large macromolecular protein assemblies called LInkers of the Nucleoskeleton and Cytoskeleton (LINC complexes). These protein scaffolds span the nuclear envelope and connect the interior of the nucleus to components of the surrounding cytoplasmic cytoskeleton. LINC complexes consist of two evolutionary-conserved protein families, Sun proteins and Nesprins that harbor C-terminal molecular signature motifs called the SUN and KASH domains, respectively. Sun proteins are transmembrane proteins of the inner nuclear membrane whose N-terminal nucleoplasmic domain interacts with the nuclear lamina while their C-terminal SUN domains protrudes into the perinuclear space and interacts with the KASH domain of Nesprins. Canonical Nesprin isoforms have a variable sized N-terminus that projects into the cytoplasm and interacts with components of the cytoskeleton. This protocol describes the validation of a dominant-negative transgenic mouse strategy that disrupts endogenous SUN/KASH interactions in a cell-type specific manner. Our approach is based on the Cre/Lox system that bypasses many drawbacks such as perinatal lethality and cell nonautonomous phenotypes that are associated with germline models of LINC complex inactivation. For this reason, this model provides a useful tool to understand the role of LINC complexes during development and homeostasis in a wide array of tissues.

Nuclear envelope proteins play a central role in many basic biological processes and have been implicated in a variety of human diseases. This protocol describes a new Cre/Lox-based mouse model that allows for the spatiotemporal control of LINC complexes disruption.

التحقق من صحة نموذج الفأر لعرقلة ينك مجمعات بطريقة خلية محددة

Nuclear migration and anchorage within developing and adult tissues relies heavily upon large macromolecular protein assemblies called LInkers of the ...