وأيد هذا العمل عن طريق المنح وAG027818 AG030709 من المعاهد الوطنية للصحة / NIA ، 2005/2E من مؤسسة لاري Hillblom L. ، IIRG - 07-58334 من جمعية الزهايمر ، و07-65798 من قسم الصحة العامة في ولاية كاليفورنيا.

1. إعداد الببتيد <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ~ خارج تزن 100-200 ميكروغرام من الببتيد مجفد باستخدام microbalance ونقل الى المسمى ، المغلفة السيليكون ، وأنابيب الممتزات microfuge المنخفضة. هنا ، فإننا نستخدم تسلسل الإنسان من Aβ40 ، Aβ42 ، الكالسيتونين ، وGRF. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> هنا ، فإننا نستخدم الببتيد قبل تعامل مع بروبانول 1،1،1،3،3،3 - hexafluoro - 2 (HFIP) للحصول على واحدة متجانسة ، خالية من مجموع الاستعدادات. هذه الخطوة كانت ضرورية لأن ما قبل تشكيل المجاميع حمل التجميع السريع للبروتينات amyloidogenic ، مما يؤدي إلى استنساخ التجارب بين الفقراء 5. أساليب أخرى مثل الترشيح والمجلس الأعلى للتعليم يمكن أن تستخدم أيضا للحصول على مجموع خالية من الاستعدادات لPICUP 6. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لعلاج الببتيدات مع HFIP ، قبل البرد الحاوية على الجليد HFIP داخل غطاء الدخان ترتدي الحماية الكافية (HFIP متقلبة والسامة). تبريد زجاجة 250 مل يتطلب عادة 10-15 دقيقة. إضافة إلى ما قبل HFIP المبردة التي تحتوي على أنابيب lyophilizates الببتيد للحصول على تركيز الببتيد اسمية قدرها 0.5 ملم. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> يصوتن الحلول الببتيد في sonicator مياه الاستحمام لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> دوامة بلطف واحتضان الأنابيب لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> البرد الأنابيب على الجليد (على 1 دقيقة) ، وتقسيم الحلول في 10 - 50 - ميكرولتر aliquots في المسمى أنابيب الممتزات منخفضة 0.6 مل. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إزالة HFIP عن طريق التبخر في ظل تيار لطيف من النيتروجين ، أو ترك أنابيب مفتوحة في غطاء الدخان بين عشية وضحاها. للتبخر بين عشية وضحاها ، وضع أنابيب فتح في رفوف وغطاء لهم مع ورقة كبيرة من Kimwipes لمنع الغبار وتلوث الجسيمات. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> يجفف في HFIP المتبقية في الخلاء في lyophilizer ، أو المكثف الطرد المركزي لمدة 30 دقيقة ، أو في exsiccator تعلق على مدخل فراغ لح 2 وسوف يكون المنتج النهائي فيلم الببتيد في الجزء السفلي من أنابيب microfuge. إذا مجفف بشكل صحيح ، يمكن تخزين أنابيب محكمة الإغلاق لفترات طويلة (أشهر) في -20 أو -80 درجة مئوية. </li></ol> 2. Solubilizing الببتيد HFIP المعاملة والصورة عبر ربط - <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> قبل solubilizing الببتيد HFIP معاملة لردود الفعل ، عبر ربط ، واحد يحتاج إلى إعداد عبر ربط والكواشف التبريد. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تزن خارج بيرسلفات الأمونيوم (الجزائرية ، السيد 228.2 غرام / مول) ، ويعد حل 20 ملي في 10 ملي فوسفات الصوديوم ، ودرجة الحموضة 7.4. مزيج باستخدام الدوامة حتى حل واضح. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد 1 ملم من حل تريس (2،2 - bipyridyl) dichlororuthenium (II) hexahydrate (RuBpy السيد 748.63 غ / مول) في 10 ملي فوسفات الصوديوم ، ودرجة الحموضة 7.4. مزيج باستخدام الدوامة والتحقق من حل كامل. حماية أنبوب من الضوء باستخدام رقائق الألومنيوم. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لSDS - PAGE التحليل التالي عبر ربط ، وكاشف تبريد مريحة هو 5 ٪ β - المركابتويثانول في 2 × SDS - PAGE العازلة العينة. بدلا من ذلك ، 1 م dithiothreitol (DTT ، السيد 154.5 غرام / مول) يمكن استخدامها في الماء منزوع الأيونات أو عازلة مناسبة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تذاب الأفلام الببتيد HFIP المعاملة في أول هيدروكسيد الصوديوم المخفف ثم يضاف الصوديوم الفوسفات عازلة للحصول على 30 ميكرومتر ~ الببتيد التركيز. ثم إضافة 60 ملم من الماء منزوع الأيونات هيدروكسيد الصوديوم في أنبوب يحتوي على فيلم الببتيد مثل هيدروكسيد الصوديوم والمياه التي تشكل 10 و 45 ٪ من الحجم النهائي ، على التوالي. كشط الفيلم الببتيد قبالة الجدران الداخلية للأنبوب microfuge به الطرف ، عن طريق مزيج pipetting صعودا وهبوطا ، ويصوتن لمدة 5 دقائق في حمام ماء sonicator. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة 45 ٪ فوسفات الصوديوم 20 ملم ، ودرجة الحموضة 7.4 ، من خلال مزيج pipetting ، والطرد المركزي في 16000 ز لمدة 10 دقيقة. جانبا من غير متقاطع aliquots المرتبطة الببتيدات مختلطة مع كاشف التبريد لعناصر سلبية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ضبط الكاميرا مصراع تأخير إلى 1 ثانية. في بعض الأحيان أعلى التشعيع ، قد يسبب ردود فعل متطرفة واسعة تدهور البروتين. تحميل مصراع الكاميرا. قد تحتاج إلى وقت تشعيع يكون الأمثل عند استخدام الأسلوب مع البروتين الجديد. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> يتم تنفيذ رد فعل PICUP نموذجية في حجم رد فعل 20 ميكرولتر. نقل 18 ميكروليتر من الحل الببتيد في أنبوب رقيقة الجدران ، واضحة ، PCR - 0.2 مل. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إلى الحل الببتيد ، إضافة 1 RuBpy ميكرولتر تليها وكالة الأنباء الجزائرية 1 ميكرولتر ومزج الكواشف التي pipetting (تركيز النهائي من وكالة الأنباء الجزائرية RuBpy في خليط التفاعل سيتم 0.05 و 1 ملم ، على التوالي). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> المكان بسرعة رد الفعل داخل أنبوب قارورة زجاجية 1.8 مل. مكان داخل القارورة الكير يعلق امام الكاميرا من الجسم. نعلق حامي العدسة واضغط على مصراع الكاميرا بحيث يتم المشع العينة لمدة 1 ق داخل الكير. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بعد التشعيع العينة ، بسرعة اتخاذ القارورة من الخوار وأنبوب PCR من القارورة. يشفي بسرعة رد الفعل وذلك بإضافة 1 DTT ميكرولتر أو 10 ميكرولتر عينة PAGE العازلة الحد. كرر رد الفعل لكل قسامة الببتيد. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ويمكن الآن للمخاليط الرد سيكون في المجمدة -20 درجة مئوية لمدة التخزين لمدة لا تزيد مدة 7 أيام أو أبقى على الجليد قبل التحليل SDS - PAGE والفضة تلطيخ. </li></ol> 3. SDS - PAGE وقطعة من الجبن ، تلطيخالمنتجات الببتيد عبر ربط <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> يتم إجراء روتيني SDS - PAGE والفضة إلى تلطيخ تصور عبر ربط الببتيدات. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تحميل 5 ميكرولتر من خليط التفاعل في الحصول على ممر ~ 130 بمول من الببتيد في الممر. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وتشمل كميات مماثلة من غير متقاطع المرتبطة الببتيدات للمقارنة. كما تتضمن سلما البروتين القياسية لتقريب بصرية من الوزن الجزيئي للنطاقات الببتيد. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تشغيل الجل باستخدام جهاز الفصل الكهربائي للهلام القياسية. نستخدم SureLock XCell مصغرة خلية النظام من Invitrogen وأداء الفضة وفقا لتلطيخ Invitrogen نشر IM - 1002 ، Novex الكهربائي جل ما قبل الصب الدليل. </li></ol> الجزء 4 : النتائج الممثل (الشكل 1) <img src="/files/ftp_upload/old/1071_2009_1_19_13/Result no demarcation.png" alt="الشكل 1" /> الشكل 1 : المواد الهلامية بولي أكريلاميد فضة الملطخة تظهر غير متقاطع مرتبطة (--) والصور عبر ربط بين (+) GRF ، الكالسيتونين ، Aβ40 وAβ42 SDS - PAGE والفضة تلطيخ تحليلات PICUP المولدة oligomers Aβ40 تظهر شدة الفرقة مماثلة تقريبا من خلال مونومر tetramer ، يليه انخفاض حاد في وفرة العالي oligomers 7. غير متقاطع مرتبطة Aβ40 يهاجر مع السيد يتفق مع مونومر 7. Aβ42 يظهر حجم قليل وحدات متميزة التوزيع. Aβ42 oligomers تضم 8 مجموعات 2-3. المجموعة الأولى ، من خلال مونومر ترايمر ، يعرض خفض كثافة مع النظام قليل وحدات متزايدة. في المجموعة الثانية ، لوحظ توزيع جاوس الشبيهة بين tetramer وheptamer ، مع كحد أقصى في مخموس ومسدوس. المجموعة الثالثة ، وهي ليست معروضة هنا ، ويحتوي على oligomers دا السيد 30،000-60،000 ~ 8. أعلى هذه oligomers السيد ويلاحظ عادة باستخدام SEC - معزولة LMW Aβ42 لكن ليس الببتيد الترشيح التي أعدتها أو المعاملة HFIP 6. غير متقاطع مرتبطة Aβ42 تنتج في الغالب شريطين ، فرقة مونومر واسعة ترايمر / tetramer الفرقة ، والذي هو الحرفية التي تحدثها SDS 5،9. كالسيتونين غلة توزيع حجم قليل وحدات أن يحيد بقوة من نقصان الأسي رتابة في المنطقة من خلال مونومر tetramer ، مما يشير إلى ما قبل وجود dimers ، trimers وtetramers 7. التحكم ببتيد ، GRF ، وتنتج توزيع رتيب قليل وحدات تتراوح بين ثنائيات من خلال مسدوس مثل هذه المبالغ واضحة الانخفاض النسبي للoligomers باطراد مع زيادة الكتلة الجزيئية. في تجارب أخرى ، وارتفاع oligomers يمكن أيضا تصور 7. قد يكون عدد الدقيق وكثافة نسبية للعصابات قليل وحدات تختلف نوعا ما بين التجارب اعتمادا على تركيز البروتين الفعلية ، وكمية البروتين تحميلها على هلام ، والوقت المستخدم للخطوة التنمية في البروتوكول الفضة تلطيخ.

<ol>
	<li>Bitan, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+study+of+metastable+amyloidogenic+protein+oligomers+by+photo-induced+cross-linking+of+unmodified+proteins.">Structural study of metastable amyloidogenic protein oligomers by photo-induced cross-linking of unmodified proteins.</a> Methods Enzymol. 413, 217-236 (2006).</li><li>Fancy, D. A., Kodadek, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemistry+for+the+analysis+of+protein-protein+interactions:+rapid+and+efficient+cross-linking+triggered+by+long+wavelength+light.">Chemistry for the analysis of protein-protein interactions: rapid and efficient cross-linking triggered by long wavelength light.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 96, 6020-6024 (1999).</li><li>Kluger, R., Alagic, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemical+cross-linking+and+protein-protein+interactions&#8212;a+review+with+illustrative+protocols.">Chemical cross-linking and protein-protein interactions&#8212;a review with illustrative protocols.</a> Bioorg. Chem. 32, 451-472 (2004).</li><li>Tomohiro, T., Hashimoto, M., Hatanaka, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cross-linking+chemistry+and+biology:+development+of+multifunctional+photoaffinity+probes.">Cross-linking chemistry and biology: development of multifunctional photoaffinity probes.</a> Chem. Rec. 5, 385-395 (2005).</li><li>Bitan, G., Fradinger, E. A., Spring, S. M., Teplow, D. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neurotoxic+protein+oligomers&#8212;what+you+see+is+not+always+what+you+get.">Neurotoxic protein oligomers&#8212;what you see is not always what you get.</a> Amyloid. 12, 88-95 (2005).</li><li>Bitan, G., Teplow, D. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation+of+aggregate-free,+low+molecular+weight+amyloid-&#946;+for+assembly+and+toxicity+assays.">Preparation of aggregate-free, low molecular weight amyloid-&#946; for assembly and toxicity assays.</a> Methods Mol. Biol. 299, 3-9 (2005).</li><li>Bitan, G., Lomakin, A., Teplow, D. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Amyloid+&#946;-protein+oligomerization:+prenucleation+interactions+revealed+by+photo-induced+cross-linking+of+unmodified+proteins.">Amyloid &#946;-protein oligomerization: prenucleation interactions revealed by photo-induced cross-linking of unmodified proteins.</a> J. Biol. Chem. 276, 35176-35184 (2001).</li><li>Bitan, G., Kirkitadze, M. D., Lomakin, A., Vollers, S. S., Benedek, G. B., Teplow, D. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Amyloid+&#946;-protein+(A&#946;)+assembly:+A&#946;40+and+A&#946;42+oligomerize+through+distinct+pathways.">Amyloid &#946;-protein (A&#946;) assembly: A&#946;40 and A&#946;42 oligomerize through distinct pathways.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 100, 330-335 (2003).</li><li>Hepler, R. W., Grimm, K. M., Nahas, D. D., Breese, R., Dodson, E. C., Acton, P., Keller, P. M., Yeager, M., Wang, H., Shughrue, P., Kinney, G., Joyce, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Solution+state+characterization+of+amyloid+&#946;-derived+diffusible+ligands.">Solution state characterization of amyloid &#946;-derived diffusible ligands.</a> Biochemistry (Mosc). 45, 15157-15167 (2006).</li><li>Bitan, G., Teplow, D. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+photochemical+cross-linking&#8212;a+new+tool+for+studies+of+metastable,+amyloidogenic+protein+assemblies).">Rapid photochemical cross-linking&#8212;a new tool for studies of metastable, amyloidogenic protein assemblies).</a> Acc. Chem. Res. 37, 357-364 (2004).</li><li>Piening, N., Weber, P., Hogen, T., Beekes, M., Kretzschmar, H., Giese, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Photo-induced+crosslinking+of+prion+protein+oligomers+and+prions.">Photo-induced crosslinking of prion protein oligomers and prions.</a> Amyloid. 13, 67-77 (2006).</li><li>Li, H. T., Lin, X. J., Xie, Y. Y., Hu, H. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+early+events+of+&#945;-synuclein+oligomerization+revealed+by+photo-induced+cross-linking.">The early events of &#945;-synuclein oligomerization revealed by photo-induced cross-linking.</a> Protein Pept. Lett. 13, 385-390 (2006).</li><li>Vollers, S. S., Teplow, D. B., Bitan, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Determination+of+Peptide+oligomerization+state+using+rapid+photochemical+crosslinking.">Determination of Peptide oligomerization state using rapid photochemical crosslinking.</a> Methods Mol. Biol. 299, 11-18 (2005).</li></ol>

وقد وضعت أصلا لدراسة PICUP مجمعات البروتين مستقرة 2. تم تطبيق الطريقة في وقت لاحق لدراسة كمية بروتين اميلويد متبدل الاستقرار الجمعيات ، بما في ذلك Aβ 10 ، بريون والمرض المرتبط بي ار بي بكالوريوس 11 و 12 α - ​​synuclein. أهم العوامل التي يجب أخذها في الاعتبار عند تصمي?...

<!DOCTYPE html PUBLIC "-//W3C//DTD XHTML 1.0 Transitional//EN" "http://www.w3.org/TR/xhtml1/DTD/xhtml1-transitional.dtd">
<html xmlns="http://www.w3.org/1999/xhtml" xml:lang="en" lang="en">	
		
		<div>
		<table border="1">
		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>Dolan-Jenner 200-W incandescent lamp</td>
<td>Other</td>
<td>Dolan-Jenner Industries</td>
<td>Model 170-D</td>
<td>The heat generated by the lamp does not affect samples for short incubation periods.</td>
</tr>
<tr>
<td>35-mm SLR camera body</td>
<td>Tool</td>
<td>Pentax</td>
<td>SP500 model</td>
<td>In our settings, a bellows is attached to the body of the camera to provide a convenient chamber for irradiation of the sample placed 10 cm away from the light source.</td>
</tr>
<tr>
<td>Clear, thin walled PCR tubes</td>
<td>Other</td>
<td>Eppendorf</td>
<td>951010006 supplied by Fisher L22-003-24</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Glass vials (1.8 mL)</td>
<td>Other</td>
<td>Kimble Chromatography</td>
<td>60940A 2, supplied by Fisher 03-340-60</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>GRF</td>
<td>Reagent</td>
<td>Bachem</td>
<td>H-3695</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>HFIP</td>
<td>Reagent</td>
<td>TCI America</td>
<td>H0424</td>
<td>Use in a fume hood.</td>
</tr>
<tr>
<td>A&beta;40 and A&beta;42</td>
<td>Reagent</td>
<td>UCLA Biopolymers Laboratory</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Calcitonin</td>
<td>Reagent</td>
<td>American Peptide</td>
<td>22-1-10</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Tris(2,2-bipridyl)dichlororuthenium(II) hexahydrate</td>
<td>Reagent</td>
<td>Sigma</td>
<td>224758-1G</td>
<td>Vortex until the solution is clear. Cover the RuBpy tube with foil to protect the reagent from ambient light. RuBpy is prepared freshly each time and should be used within 48 h.</td>
</tr>
<tr>
<td>Ammonium persulfate</td>
<td>Reagent</td>
<td>Sigma</td>
<td>A-7460</td>
<td>Vortex until the solution is clear. APS is prepared freshly each time and should be used within 48 h. </td>
</tr>
<tr>
<td>&beta;-mercaptoethanol</td>
<td>Reagent</td>
<td>Sigma</td>
<td>M7154-25 ML</td>
<td>Can be used when SDS-PAGE analysis is performed.</td>
</tr>
<tr>
<td>Novex Tricine SDS Sample Buffer (2x)</td>
<td>Reagent</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>LC1676</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>XCell SureLock Mini-Cell</td>
<td>Tool</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>EI0001</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Novex Tricine Gels (10-20%)</td>
<td>Other</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>EC6625B0X</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Novex Tricine SDS Running Buffer (10x )</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>LC1675</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Silver Express Staining Kit</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>LC6100</td>
<td>&nbsp;</td>		</tbody>
		</table>
		</div>

photo-induced cross-linking of unmodified proteins (picup) applied to amyloidogenic peptides

تجميع البروتينات amyloidogenic في oligomers السامة هي الحدث البارز في التسبب في أمراض misfolding البروتين ، بما في ذلك مرض الزهايمر ، وباركنسون وأمراض هنتنغتون ، وراثي التصلب الجانبي ، وداء السكري من النوع 2. نظرا لطبيعة هذه التجمعات متبدل الاستقرار البروتين ، فمن الصعب تقدير حجم قليل وحدات توزيعها كميا باستخدام الطرق التقليدية ، مثل الكهربائي ، وتشتت الضوء اللوني ، مضان ، أو حيوية. Oligomers من البروتينات موجودة في الخلائط amyloidogenic متبدل الاستقرار ، الذي فصل في oligomers مونومرات والمنتسبين إلى أكبر التجمعات في نفس الوقت. PICUP استقرار السكان قليل وحدات من خلال لقطات عبر ربط وعند دمجها مع أساليب التجزئة ، مثل الكهربائي سلفات الصوديوم دوديسيل هلام بولي أكريلاميد (SDS - PAGE) أو الحجم الاستبعاد اللوني (SEC) ، ويوفر PICUP التساهمية من حجم التوزيعات التي كانت موجودة قبل قليل وحدات الصليب ربط. وبالتالي ، يمكن تصور PICUP والتحليل الكمي للسكان البروتين متبدل الاستقرار ، ويمكن استخدامها لمراقبة فك التجمع والعلاقات بين التعديلات وتسلسل oligomerization<sup&gt; 1</sup&gt;. ميكانيكيا ، PICUP ينطوي على الصورة للأكسدة من رو<sup&gt; 2 +</sup&gt; في (bipyridyl) تريس المعقدة (II) رو (RuBpy) لرو<sup&gt; 3 +</sup&gt; عن طريق التعرض للأشعة واضحة في وجود المتقبلة الإلكترون. RU<sup&gt; 3 +</sup&gt; قوي واحد الإلكترون مؤكسد قادرة على استخلاص إلكترون من جزيء البروتين المجاورة ، وتوليد البروتين جذرية<sup&gt; 1،2</sup&gt;. الراديكاليين وغير مستقرة ، شديدة التفاعل الأنواع وبالتالي تختفي بسرعة من خلال مجموعة متنوعة من ردود الفعل داخل والجزيئات. ويجوز للاستفادة من راديكالية الطاقة العالية الإلكترون غير مزاوج لتتفاعل مع بروتين آخر مونومر تشكيل جذرية مثنوي ، التي تفقد في وقت لاحق ذرة الهيدروجين وأشكال مستقرة ومرتبطة تساهميا ديمر. قد تتفاعل ثم ديمر مزيد من خلال آلية مماثلة مع مونومرات dimers أو أخرى لتشكيل العليا oligomers. مزايا النسبية PICUP إلى الأساليب الأخرى عبر ربط الصور أو كيميائية<sup&gt; 3،4</sup&gt; تشمل قصيرة (ق ≤ 1) التعرض لغير المدمرة الضوء المرئي ، لا حاجة ل<i&gt; ما قبل الأمر الواقع</i&gt; تعديل التسلسل الأصلي ، وذات طول صفري. التساهمية عبر ربط بالإضافة إلى ذلك ، تمكن PICUP عبر ربط البروتينات داخل درجة الحموضة واسعة وتتراوح درجة الحرارة ، بما في ذلك المعلمات الفسيولوجية. هنا ، علينا أن نظهر لتطبيق PICUP عبر ربط ثلاثة بروتينات amyloidogenic 40 -- 42 وبقايا من البروتين اميلويد β المتغيرات (Aβ40 وAβ42) ، والكالسيتونين ، والسيطرة على بروتين ، هرمون النمو الافراج عن عامل (GRF).

Watch this Scientific Journal Video about Photo-Induced Cross-Linking of Unmodified Proteins PICUP Applied to Amyloidogenic Peptides at JoVE.com

Photo-Induced Cross-Linking of Unmodified Proteins PICUP Applied to Amyloidogenic Peptides

الصورة التي يسببها عبر ربط بروتينات معدلة (PICUP) يسمح توصيف توزيع حجم قليل وحدات البروتين في الخلائط متبدل الاستقرار. علينا أن نظهر لتطبيق PICUP الببتيدات التمثيل الثلاثة amyloidogenic 40 -- 42 وبقايا أشكال اميلويد β البروتين ، والكالسيتونين ، والتحكم الببتيد هرمون النمو الافراج عن عامل.

الصور المستحثة عبر ربط بروتينات معدلة (PICUP) بالتطبيق على هضميدات Amyloidogenic

The assembly of amyloidogenic proteins into toxic oligomers is a seminal event in the pathogenesis of protein misfolding diseases, including Alzheimer's, ...

photo-induced-cross-linking-unmodified-proteins-picup-applied-to

Research

JoVE Journal

Biology

Photo-Induced Cross-Linking of Unmodified Proteins (PICUP) Applied to Amyloidogenic Peptides

21.3K Views.  University of California, Los Angeles. الصورة التي يسببها عبر ربط بروتينات معدلة (PICUP) يسمح توصيف توزيع حجم قليل وحدات البروتين في الخلائط متبدل الاستقرار. علينا أن نظهر لتطبيق PICUP الببتيدات التمثيل الثلاثة amyloidogenic 40 -- 42 وبقايا أشكال اميلويد β البروتين ، والكالسيتونين ، والتحكم الببتيد هرمون النمو ال?...

Video: Photo-Induced Cross-Linking of Unmodified Proteins PICUP Applied to Amyloidogenic Peptides

Electrophoretic Separation of Proteins

Electrophoresis is used to separate complex mixtures of proteins (e.g., from cells, subcellular fractions, column fractions, or immunoprecipitates), to investigate subunit compositions, and to verify homogeneity of protein samples. It can also serve to purify proteins for use in further applications. In polyacrylamide gel electrophoresis, proteins migrate in response to an electrical field through pores in a polyacrylamide gel matrix; pore size decreases with increasing acrylamide concentration. The combination of pore size and protein charge, size, and shape determines the migration rate of the protein. In this unit, the standard Laemmli method is described for discontinuous gel electrophoresis under denaturing conditions, i.e., in the presence of sodium dodecyl sulfate (SDS). 

In this video, we demonstrate a method for electrophoretic separation of proteins using poly-acrylimide gel electrophoresis (PAGE).

الكهربي فصل البروتينات

Electrophoresis is used to separate complex mixtures of proteins (e.g., from cells, subcellular fractions, column fractions, or immunoprecipitates), to ...

Staining Proteins in Gels

Following separation by electrophoretic methods, proteins in a gel can be detected by several staining methods. This unit describes protocols for detecting proteins by four popular methods. Coomassie blue staining is an easy and rapid method. Silver staining, while more time consuming, is considerably more sensitive and can thus be used to detect smaller amounts of protein. Fluorescent staining is a popular alternative to traditional staining procedures, mainly because it is more sensitive than Coomassie staining, and is often as sensitive as silver staining. Staining of proteins with SYPRO Orange and SYPRO Ruby are also demonstrated here.

Following separation by electrophoretic methods, proteins in a gel can be detected by several staining methods. Staining of proteins with Coomassie Blue, Silver Staining, SYPRO Orange, SYPRO Ruby are demonstrated in this video.

تلطيخ البروتينات في الهلام

Following separation by electrophoretic methods, proteins in a gel can be detected by several staining methods. This unit describes protocols for ...

A Lectin HPLC Method to Enrich Selectively-glycosylated Peptides from Complex Biological Samples

Glycans are an important class of post-translational modifications. Typically found on secreted and extracellular molecules, glycan structures signal the internal status of the cell. Glycans on tumor cells tend to have abundant sialic acid and fucose moieties. We propose that these cancer-associated glycan variants be exploited for biomarker development aimed at diagnosing early-stage disease. Accordingly, we developed a mass spectrometry-based workflow that incorporates chromatography on affinity matrices formed from lectins, proteins that bind specific glycan structures. The lectins Sambucus nigra (SNA) and Aleuria aurantia (AAL), which bind sialic acid and fucose, respectively, were covalently coupled to POROS beads (Applied Biosystems) and packed into PEEK columns for high pressure liquid chromatography (HPLC). Briefly, plasma was depleted of the fourteen most abundant proteins using a multiple affinity removal system (MARS-14; Agilent). Depleted plasma was trypsin-digested and separated into flow-through and bound fractions by SNA or AAL HPLC. The fractions were treated with PNGaseF to remove N-linked glycans, and analyzed by LC-MS/MS on a QStar Elite. Data were analyzed using Mascot software. The experimental design included positive controls&mdash;fucosylated and sialylated human lactoferrin glycopeptides&mdash;and negative controls&mdash;high mannose glycopeptides from Saccharomyces cerevisiae&mdash;that were used to monitor the specificity of lectin capture. Key features of this workflow include the reproducibility derived from the HPLC format, the positive identification of the captured and PNGaseF-treated glycopeptides from their deamidated Asn-Xxx-Ser/Thr motifs, and quality assessment using glycoprotein standards. Protocol optimization also included determining the appropriate ratio of starting material to column capacity, identifying the most efficient capture and elution buffers, and monitoring the PNGaseF-treatment to ensure full deglycosylation. Future directions include using this workflow to perform mass spectrometry-based discovery experiments on plasma from breast cancer patients and control individuals.

Lectin-conjugated POROS beads were employed for HPLC. Glycopeptide standards served as positive and negative controls. MARS-14 depleted, trypsin-digested human plasma was chromatographed and flow-through (FT) and bound fractions collected for ESI-LC-MS/MS analyses. Glycopeptides were enriched in the bound fraction as compared to FT.

وهناك طريقة HPLC Lectin لإثراء هضميدات انتقائية الغليكوزيلاتي من العينات البيولوجية المعقدة

Glycans are an important class of post-translational modifications. Typically found on secreted and extracellular molecules, glycan structures signal the ...

Isolation of Labile Multi-protein Complexes by in vivo Controlled Cellular Cross-Linking and Immuno-magnetic Affinity Chromatography

The dynamic nature of cellular machineries is frequently built on transient and/or weak protein associations. These low affinity interactions preclude stringent methods for the isolation and identification of protein networks around a protein of interest. The use of chemical crosslinkers allows the selective stabilization of labile interactions, thus bypassing biochemical limitations for purification. Here we present a protocol amenable for cells in culture that uses a homobifunctional crosslinker with a spacer arm of 12 &Aring;, dithiobis-(succinimidyl proprionate) (DSP). DSP is cleaved by reduction of a disulphide bond present in the molecule. Cross-linking combined with immunoaffinity chromatography of proteins of interest with magnetic beads allows the isolation of protein complexes that otherwise would not withstand purification. This protocol is compatible with regular western blot techniques and it can be scaled up for protein identification by mass spectrometry1.
Stephanie A. Zlatic and Pearl V. Ryder contributed equally to this work.

Isolation of Labile Multi-protein Complexes by in vivo Controlled Cellular Cross-Linking and Immuno-magnetic Affinity Chromatography

The cell permeable crosslinker DSP [dithiobis-(succinimidyl propionate)] stabilizes transient and labile interactions in vivo, which allows their isolation using stringent protein complex purification techniques. Here we present a technique for crosslinking cells grown in culture followed by isolation of protein complexes by immunoprecipitation.

عزل بروتين المجمعات المتعددة التي كتبها عطوب في الجسم الحي الشواهد الخلوية عبر ربط والمناعة المغناطيسي اللوني التقارب

The dynamic nature of cellular machineries is frequently built on transient and/or weak protein associations. These low affinity interactions preclude ...

Laser Microdissection Applied to Gene Expression Profiling of Subset of Cells from the Drosophila Wing Disc

Heterogeneous nature of tissues has proven to be a limiting factor in the amount of information that can be generated from biological samples, compromising downstream analyses. Considering the complex and dynamic cellular associations existing within many tissues, in order to recapitulate the in vivo interactions thorough molecular analysis one must be able to analyze specific cell populations within their native context. Laser-mediated microdissection can achieve this goal, allowing unambiguous identification and successful harvest of cells of interest under direct microscopic visualization while maintaining molecular integrity. We have applied this technology to analyse gene expression within defined areas of the developing Drosophila wing disc, which represents an advantageous model system to study growth control, cell differentiation and organogenesis. Larval imaginal discs are precociously subdivided into anterior and posterior, dorsal and ventral compartments by lineage restriction boundaries. Making use of the inducible GAL4-UAS binary expression system, each of these compartments can be specifically labelled in transgenic flies expressing an UAS-GFP transgene under the control of the appropriate GAL4-driver construct. In the transgenic discs, gene expression profiling of discrete subsets of cells can precisely be determined after laser-mediated microdissection, using the fluorescent GFP signal to guide laser cut. 
Among the variety of downstream applications, we focused on RNA transcript profiling after localised RNA interference (RNAi). With the advent of RNAi technology, GFP labelling can be coupled with localised knockdown of a given gene, allowing to determinate the transcriptional response of a discrete cell population to the specific gene silencing. To validate this approach, we dissected equivalent areas of the disc from the posterior (labelled by GFP expression), and the anterior (unlabelled) compartment upon regional silencing in the P compartment of an otherwise ubiquitously expressed gene. RNA was extracted from microdissected silenced and unsilenced areas and comparative gene expression profiling determined by quantitative real-time RT-PCR. We show that this method can effectively be applied for accurate transcriptomics of subsets of cells within the Drosophila imaginal discs. Indeed, while massive disc preparation as source of RNA generally assumes cell homogeneity, it is well known that transcriptional expression can vary greatly within these structures in consequence of positional information. Using localized fluorescent GFP signal to guide laser cut, more accurate transcriptional analyses can be performed and profitably applied to disparate applications, including transcript profiling of distinct cell lineages within their native context.

Laser Microdissection Applied to Gene Expression Profiling of Subset of Cells from the Drosophila Wing Disc

Laser microdissection was applied to analyse gene expression profiling in specific compartments of Drosophila wing disc subjected to localised RNAi in vivo. RNA extracted from equivalent areas of silenced and unsilenced compartments was analysed by quantitative RT-PCR to determine comparative gene expression profiling within the context of native tissue microecology.

التطبيقية ليزر Microdissection التنميط التعبير الجيني للخلايا من المجموعة الثانوية من ذبابة الفاكهة جناح القرص

Heterogeneous nature of tissues has proven to be a limiting factor in the amount of information that can be generated from biological samples, ...

High Throughput Quantitative Expression Screening and Purification Applied to Recombinant Disulfide-rich Venom Proteins Produced in E. coli

Escherichia coli (E. coli) is the most widely used expression system for the production of recombinant proteins for structural and functional studies. However, purifying proteins is sometimes challenging since many proteins are expressed in an insoluble form. When working with difficult or multiple targets it is therefore recommended to use high throughput (HTP) protein expression screening on a small scale (1-4&#160;ml cultures) to quickly identify conditions for soluble expression. To cope with the various structural genomics programs of the lab, a quantitative (within a range of 0.1-100 mg/L culture of recombinant protein) and HTP protein expression screening protocol was implemented and validated on thousands of proteins. The protocols were automated with the use of a liquid handling robot but can also be performed manually without specialized equipment.
Disulfide-rich venom proteins are gaining increasing recognition for their potential as therapeutic drug leads. They can be highly potent and selective, but their complex disulfide bond networks make them challenging to produce. As a member of the FP7 European Venomics project (<a href="http://www.venomics.eu">www.venomics.eu</a>), our challenge is to develop successful production strategies with the aim of producing thousands of novel venom proteins for functional characterization. Aided by the redox properties of disulfide bond isomerase DsbC, we adapted our HTP production pipeline for the expression of oxidized, functional venom peptides in the E. coli cytoplasm. The protocols are also applicable to the production of diverse disulfide-rich proteins. Here we demonstrate our pipeline applied to the production of animal venom proteins. With the protocols described herein it is likely that soluble disulfide-rich proteins will be obtained in as little as a week. Even from a small scale, there is the potential to use the purified proteins for validating the oxidation state by mass spectrometry, for characterization in pilot studies, or for sensitive micro-assays.

High Throughput Quantitative Expression Screening and Purification Applied to Recombinant Disulfide-rich Venom Proteins Produced in E. coli

A protocol for the quantitative, high throughput expression screening and analytical purification of fusion proteins from small-scale Escherichia coli cultures is described and applied to the expression of disulfide-rich animal venom protein targets.

عالية الإنتاجية التعبير الكمي فحص وتنقية تطبق على المؤتلف ثاني كبريتيد الغنية البروتينات السم المنتجة في<em&gt; E. القولونية</em

Escherichia coli (E. coli) is the most widely used expression system for the production of recombinant proteins for structural and functional studies. ...

Non-chromatographic Purification of Recombinant Elastin-like Polypeptides and their Fusions with Peptides and Proteins from Escherichia coli

Elastin-like polypeptides are repetitive biopolymers that exhibit a lower critical solution temperature phase transition behavior, existing as soluble unimers below a characteristic transition temperature and aggregating into micron-scale coacervates above their transition temperature. The design of elastin-like polypeptides at the genetic level permits precise control of their sequence and length, which dictates their thermal properties. Elastin-like polypeptides are used in a variety of applications including biosensing, tissue engineering, and drug delivery, where the transition temperature and biopolymer architecture of the ELP can be tuned for the specific application of interest. Furthermore, the lower critical solution temperature phase transition behavior of elastin-like polypeptides allows their purification by their thermal response, such that their selective coacervation and resolubilization allows the removal of both soluble and insoluble contaminants following expression in Escherichia coli. This approach can be used for the purification of elastin-like polypeptides alone or as a purification tool for peptide or protein fusions where recombinant peptides or proteins genetically appended to elastin-like polypeptide tags can be purified without chromatography. This protocol describes the purification of elastin-like polypeptides and their peptide or protein fusions and discusses basic characterization techniques to assess the thermal behavior of pure elastin-like polypeptide products.

Non-chromatographic Purification of Recombinant Elastin-like Polypeptides and their Fusions with Peptides and Proteins from Escherichia coli

Elastin-like polypeptides are stimulus-responsive biopolymers with applications ranging from recombinant protein purification to drug delivery. This protocol describes the purification and characterization of elastin-like polypeptides and their peptide or protein fusions from Escherichia coli using their lower critical solution temperature phase transition behavior as a simple alternative to chromatography.

تنقية الكروماتوغرافي من غير البروتينية المؤتلف الإيلاستين مثل والإنشطار مع الببتيدات والبروتينات من<em&gt; كولاي</em

Elastin-like polypeptides are repetitive biopolymers that exhibit a lower critical solution temperature phase transition behavior, existing as soluble ...

Use of MALDI-TOF Mass Spectrometry and a Custom Database to Characterize Bacteria Indigenous to a Unique Cave Environment (Kartchner Caverns, AZ, USA)

MALDI-TOF mass spectrometry has been shown to be a rapid and reliable tool for identification of bacteria at the genus and species, and in some cases, strain levels. Commercially available and open source software tools have been developed to facilitate identification; however, no universal/standardized data analysis pipeline has been described in the literature. Here, we provide a comprehensive and detailed demonstration of bacterial identification procedures using a MALDI-TOF mass spectrometer. Mass spectra were collected from 15 diverse bacteria isolated from Kartchner Caverns, AZ, USA, and identified by 16S rDNA sequencing. Databases were constructed in BioNumerics 7.1. Follow-up analyses of mass spectra were performed, including cluster analyses, peak matching, and statistical analyses. Identification was performed using blind-coded samples randomly selected from these 15 bacteria. Two identification methods are presented: similarity coefficient-based and biomarker-based methods. Results show that both identification methods can identify the bacteria to the species level.

Use of MALDI-TOF Mass Spectrometry and a Custom Database to Characterize Bacteria Indigenous to a Unique Cave Environment Kartchner Caverns, AZ, USA

This work details procedures for rapid identification of bacteria using MALDI-TOF MS. The identification procedures include spectrum acquisition, database construction, and follow up analyses. Two identification methods, similarity coefficient-based and biomarker-based methods, are presented.

استخدام MALDI-TOF الطيف الكتلي وقاعدة بيانات مخصصة لتوصيف البكتيريا الأصلية إلى فريد كهف البيئة (Kartchner الكهوف، AZ، ​​الولايات المتحدة الأمريكية)

MALDI-TOF mass spectrometry has been shown to be a rapid and reliable tool for identification of bacteria at the genus and species, and in some cases, ...

A Method for Selecting Structure-switching Aptamers Applied to a Colorimetric Gold Nanoparticle Assay

Small molecules provide rich targets for biosensing applications due to their physiological implications as biomarkers of various aspects of human health and performance. Nucleic acid aptamers have been increasingly applied as recognition elements on biosensor platforms, but selecting aptamers toward small molecule targets requires special design considerations. This work describes modification and critical steps of a method designed to select structure-switching aptamers to small molecule targets. Binding sequences from a DNA library hybridized to complementary DNA capture probes on magnetic beads are separated from nonbinders via a target-induced change in conformation. This method is advantageous because sequences binding the support matrix (beads) will not be further amplified, and it does not require immobilization of the target molecule. However, the melting temperature of the capture probe and library is kept at or slightly above RT, such that sequences that dehybridize based on thermodynamics will also be present in the supernatant solution. This effectively limits the partitioning efficiency (ability to separate target binding sequences from nonbinders), and therefore many selection rounds will be required to remove background sequences. The reported method differs from previous structure-switching aptamer selections due to implementation of negative selection steps, simplified enrichment monitoring, and extension of the length of the capture probe following selection enrichment to provide enhanced stringency. The selected structure-switching aptamers are advantageous in a gold nanoparticle assay platform that reports the presence of a target molecule by the conformational change of the aptamer. The gold nanoparticle assay was applied because it provides a simple, rapid colorimetric readout that is beneficial in a clinical or deployed environment. Design and optimization considerations are presented for the assay as proof-of-principle work in buffer to provide a foundation for further extension of the work toward small molecule biosensing in physiological fluids.

A protocol is provided to select structure-switching aptamers for small molecule targets based on a tunable stringency magnetic bead selection method. Aptamers selected with structure-switching properties are beneficial for assays that require a conformational change to signal the presence of a target, such as the described gold nanoparticle assay.

منهج في اختيار الأبتامرات تبديل الهيكل تطبيقها على اللونية الذهب جسيمات متناهية الصغر الفحص

Small molecules provide rich targets for biosensing applications due to their physiological implications as biomarkers of various aspects of human health ...

Enrichment of Extracellular Matrix Proteins from Tissues and Digestion into Peptides for Mass Spectrometry Analysis

The extracellular matrix (ECM) is a complex meshwork of cross-linked proteins that provides biophysical and biochemical cues that are major regulators of cell proliferation, survival, migration, etc. The ECM plays important roles in development and in diverse pathologies including cardio-vascular and musculo-skeletal diseases, fibrosis, and cancer. Thus, characterizing the composition of ECMs of normal and diseased tissues could lead to the identification of novel prognostic and diagnostic biomarkers and potential novel therapeutic targets. However, the very nature of ECM proteins (large in size, cross-linked and covalently bound, heavily glycosylated) has rendered biochemical analyses of ECMs challenging. To overcome this challenge, we developed a method to enrich ECMs from fresh or frozen tissues and tumors that takes advantage of the insolubility of ECM proteins. We describe here in detail the decellularization procedure that consists of sequential incubations in buffers of different pH and salt and detergent concentrations and that results in 1) the extraction of intracellular (cytosolic, nuclear, membrane and cytoskeletal) proteins and 2) the enrichment of ECM proteins. We then describe how to deglycosylate and digest ECM-enriched protein preparations into peptides for subsequent analysis by mass spectrometry.

This protocol describes a procedure for enriching ECM proteins from tissues or tumors and deglycosylating and digesting the ECM-enriched preparations into peptides to analyze their protein composition by mass spectrometry.

إثراء خارج الخلية مصفوفة البروتينات من الأنسجة والهضم في الببتيدات لتحليل الطيف الكتلي

The extracellular matrix (ECM) is a complex meshwork of cross-linked proteins that provides biophysical and biochemical cues that are major regulators of ...