وأيد هذا العمل من قبل المشروع VENOMICS والأوروبية منحة المشروع N ° 278346 من خلال برنامج الإطاري السابع (FP7 الصحة 2011-2015). المشروع VENOMICS هو التعاون بين عدة مؤسسات البحوث والشركات في أوروبا: AFMB، إيكس مرسيليا جامعة (فرنسا)، CEA Saclay (فرنسا)، NZYTech (البرتغال)، SistemasGenomicos (إسبانيا)، جامعة لياج (بلجيكا)، VenomeTech (فرنسا)، Vitamib (فرنسا)، نيوزيلندا فارما (الدنمارك) وأيد هذا العمل من قبل البنية التحتية الفرنسية لعلم الأحياء الإنشائية المتكاملة (FRISBI) ANR-10-INSB-05-01. فإن الكتاب أود أيضا أن أشكر السيد جيريمي Turchetto للمساعدة في التحضير للإطلاق النار على الفيديو.

<ol>
	<li>Berrow, N. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recombinant+protein+expression+and+solubility+screening+in+Escherichia+coli:+a+comparative+study.">Recombinant protein expression and solubility screening in Escherichia coli: a comparative study.</a> Acta Crystallographica Section D-Biological Crystallography. 62, 1218-1226 (2006).</li><li>Correa, A., Oppezzo, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tuning+different+expression+parameters+to+achieve+soluble+recombinant+proteins+in+E.+coli:+advantages+of+high-throughput+screening.">Tuning different expression parameters to achieve soluble recombinant proteins in E. coli: advantages of high-throughput screening.</a> Biotechnol J. 6, 715-730 (2011).</li><li>Graslund, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+production+and+purification.">Protein production and purification.</a> Nat Methods. 5, 135-146 (2008).</li><li>Vera, A., Gonzalez-Montalban, N., Aris, A., Villaverde, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+conformational+quality+of+insoluble+recombinant+proteins+is+enhanced+at+low+growth+temperatures.">The conformational quality of insoluble recombinant proteins is enhanced at low growth temperatures.</a> Biotechnol Bioeng. 96, 1101-1106 (2007).</li><li>Graslund, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+use+of+systematic+N-+and+C-terminal+deletions+to+promote+production+and+structural+studies+of+recombinant+proteins.">The use of systematic N- and C-terminal deletions to promote production and structural studies of recombinant proteins.</a> Protein Expr Purif. 58, 210-221 (2008).</li><li>Bird, L. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+throughput+construction+and+small+scale+expression+screening+of+multi-tag+vectors+in+Escherichia+coli.">High throughput construction and small scale expression screening of multi-tag vectors in Escherichia coli.</a> Methods. 55, 29-37 (2011).</li><li>Davis, G. D., Elisee, C., Newham, D. M., Harrison, R. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+fusion+protein+systems+designed+to+give+soluble+expression+in+Escherichia+coli.">New fusion protein systems designed to give soluble expression in Escherichia coli.</a> Biotechnol Bioeng. 65, 382-388 (1999).</li><li>Kapust, R. B., Waugh, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Escherichia+coli+maltose-binding+protein+is+uncommonly+effective+at+promoting+the+solubility+of+polypeptides+to+which+it+is+fused.">Escherichia coli maltose-binding protein is uncommonly effective at promoting the solubility of polypeptides to which it is fused.</a> Protein science: a publication of the Protein Society. 8, 1668-1674 (1999).</li><li>LaVallie, E. R., Lu, Z., Diblasio-Smith, E. A., Collins-Racie, L. A., McCoy, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Thioredoxin+as+a+fusion+partner+for+production+of+soluble+recombinant+proteins+in+Escherichia+coli.">Thioredoxin as a fusion partner for production of soluble recombinant proteins in Escherichia coli.</a> Methods Enzymol. 326, 322-340 (2000).</li><li>Marblestone, J. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+SUMO+fusion+technology+with+traditional+gene+fusion+systems:+enhanced+expression+and+solubility+with+SUMO.">Comparison of SUMO fusion technology with traditional gene fusion systems: enhanced expression and solubility with SUMO.</a> Protein science: a publication of the Protein Society. 15, 182-189 (2006).</li><li>Nozach, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+throughput+screening+identifies+disulfide+isomerase+DsbC+as+a+very+efficient+partner+for+recombinant+expression+of+small+disulfide-rich+proteins+in+E.+coli.">High throughput screening identifies disulfide isomerase DsbC as a very efficient partner for recombinant expression of small disulfide-rich proteins in E. coli.</a> Microb Cell Fact. 12, 37 (2013).</li><li>Sachdev, D., Chirgwin, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fusions+to+maltose-binding+protein:+control+of+folding+and+solubility+in+protein+purification.">Fusions to maltose-binding protein: control of folding and solubility in protein purification.</a> Methods Enzymol. 326, 312-321 (2000).</li><li>Smith, D. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generating+fusions+to+glutathione+S-transferase+for+protein+studies.">Generating fusions to glutathione S-transferase for protein studies.</a> Methods Enzymol. 326, 254-270 (2000).</li><li>de Marco, A., Deuerling, E., Mogk, A., Tomoyasu, T., Bukau, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chaperone-based+procedure+to+increase+yields+of+soluble+recombinant+proteins+produced+in+E.+coli.">Chaperone-based procedure to increase yields of soluble recombinant proteins produced in E. coli.</a> BMC Biotechnol. 7, 32 (2007).</li><li>Hatahet, F., Nguyen, V. D., Salo, K. E., Ruddock, L. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Disruption+of+reducing+pathways+is+not+essential+for+efficient+disulfide+bond+formation+in+the+cytoplasm+of+E.+coli.">Disruption of reducing pathways is not essential for efficient disulfide bond formation in the cytoplasm of E. coli.</a> Microb Cell Fact. 9, 67 (2010).</li><li>de Marco, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recent+contributions+in+the+field+of+the+recombinant+expression+of+disulfide+bonded+proteins+in+bacteria.">Recent contributions in the field of the recombinant expression of disulfide bonded proteins in bacteria.</a> Microb Cell Fact. 11, 129 (2012).</li><li>Katzen, F., Beckwith, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Disulfide+bond+formation+in+periplasm+of+Escherichia+coli.">Disulfide bond formation in periplasm of Escherichia coli.</a> Methods Enzymol. 348, 54-66 (2002).</li><li>Klint, J. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Production+of+recombinant+disulfide-rich+venom+peptides+for+structural+and+functional+analysis+via+expression+in+the+periplasm+of+E.+coli.">Production of recombinant disulfide-rich venom peptides for structural and functional analysis via expression in the periplasm of E. coli.</a> PloS One. 8, e63865 (2013).</li><li>Braud, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dual+expression+system+suitable+for+high-throughput+fluorescence-based+screening+and+production+of+soluble+proteins.">Dual expression system suitable for high-throughput fluorescence-based screening and production of soluble proteins.</a> Journal of Proteome Research. 4, 2137-2147 (2005).</li><li>Douzi, B. G. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+system+for+expressing+recombinant+animal+toxins+in+E.+coli.+(Collection+Rencontres+en+Toxicologie,+Publications+de+la+SFET,+Chatenay-Malabry).">A new system for expressing recombinant animal toxins in E. coli. (Collection Rencontres en Toxicologie, Publications de la SFET, Chatenay-Malabry).</a> Advances and new technologies in toxinology. , 149-152 (2010).</li><li>Groisillier, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MARINE-EXPRESS:+taking+advantage+of+high+throughput+cloning+and+expression+strategies+for+the+post-genomic+analysis+of+marine+organisms.">MARINE-EXPRESS: taking advantage of high throughput cloning and expression strategies for the post-genomic analysis of marine organisms.</a> Microb Cell Fact.. 9, 45 (2010).</li><li>Vincentelli, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-throughput+protein+expression+screening+and+purification+in+Escherichia+coli.">High-throughput protein expression screening and purification in Escherichia coli.</a> Methods. 55, 65-72 .</li><li>Xiao, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+high-throughput+protein+sample+production+platform+of+the+Northeast+Structural+Genomics+Consortium.">The high-throughput protein sample production platform of the Northeast Structural Genomics Consortium.</a> Journal of Structural Biology. 172, 21-33 (2010).</li><li>Saez, N. J., Vincentelli, R., Chen, Y. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ch3+High-throughput+expression+screening+and+purification+of+recombinant+proteins+in+E.+coli.">Ch3 High-throughput expression screening and purification of recombinant proteins in E. coli.</a> Structural Genomics: General Applications : Methods in Molecular Biology. 1091, 33-53 (2014).</li><li>Katzen, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gateway+(R)+recombinational+cloning:+a+biological+operating+system.">Gateway (R) recombinational cloning: a biological operating system.</a> Expert. Opin. Drug Discov. 2, 571-589 (2007).</li><li>Vincentelli, R., Canaan, S., Offant, J., Cambillau, C., Bignon, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Automated+expression+and+solubility+screening+of+His-tagged+proteins+in+96-well+format.">Automated expression and solubility screening of His-tagged proteins in 96-well format.</a> Analytical Biochemistry. 346, 77-84 (2005).</li><li>Studier, F. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+production+by+auto-induction+in+high+density+shaking+cultures.">Protein production by auto-induction in high density shaking cultures.</a> Protein Expr Purif. 41, 207-234 (2005).</li><li>Spencer, C. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ion+channel+pharmacology+under+flow:+automation+via+well-plate+microfluidics.">Ion channel pharmacology under flow: automation via well-plate microfluidics.</a> Assay Drug Dev Technol. 10, 313-324 (2012).</li><li>Sala, E., de Marco, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Screening+optimized+protein+purification+protocols+by+coupling+small-scale+expression+and+mini-size+exclusion+chromatography.">Screening optimized protein purification protocols by coupling small-scale expression and mini-size exclusion chromatography.</a> Protein Expr Purif. 74, 231-235 (2010).</li><li>Moon, A. F., Mueller, G. A., Zhong, X., Pedersen, L. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+synergistic+approach+to+protein+crystallization:+combination+of+a+fixed-arm+carrier+with+surface+entropy+reduction.">A synergistic approach to protein crystallization: combination of a fixed-arm carrier with surface entropy reduction.</a> Protein science: a publication of the Protein Society. 19, 901-913 (2010).</li><li>Zanier, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Structural basis for hijacking of cellular LxxLL motifs by papillomavirus E6 oncoproteins. 339, 694-698 (2013).</li><li>Kapust, R. B., Tozser, J., Copeland, T. D., Waugh, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+P1'+specificity+of+tobacco+etch+virus+protease.">The P1' specificity of tobacco etch virus protease.</a> Biochemical and Biophysical Research Communications. 294, 949-955 (2002).</li><li>Vincentelli, R., Romier, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+in+Escherichia+coli:+becoming+faster+and+more+complex.">Expression in Escherichia coli: becoming faster and more complex.</a> Current Opinion in Structural Biology. 23, 326-334 (2013).</li><li>Jolma, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA-binding+specificities+of+human+transcription+factors.">DNA-binding specificities of human transcription factors.</a> Cell. 152, 327-339 (2013).</li><li>Aslanidis, C., de Jong, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ligation-independent+cloning+of+PCR+products+(LIC-PCR).">Ligation-independent cloning of PCR products (LIC-PCR).</a> Nucleic Acids Research. 18, 6069-6074 (1990).</li><li>Haun, R. S., Serventi, I. M., Moss, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid,+reliable+ligation-independent+cloning+of+PCR+products+using+modified+plasmid+vectors.">Rapid, reliable ligation-independent cloning of PCR products using modified plasmid vectors.</a> BioTechniques. 13, 515-518 (1992).</li><li>van den Ent, F., Lowe, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RF+cloning:+a+restriction-free+method+for+inserting+target+genes+into+plasmids.">RF cloning: a restriction-free method for inserting target genes into plasmids.</a> Journal of Biochemical and Biophysical Methods. 67, 67-74 (2006).</li><li>Vincentelli, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-throughput+automated+refolding+screening+of+inclusion+bodies.">High-throughput automated refolding screening of inclusion bodies.</a> Protein science: a publication of the Protein Society. 13, 2782-2792 (2004).</li></ol>

The authors declare that they have no competing financial interests.

ليس هناك بروتوكول عالمي واحد للتعبير عن ذوبان، مطوية، والبروتينات وظيفية. أن تكون التكاليف والوقت فعالة، معظم المختبرات أو المرافق الأساسية من البروتين العمل مع أهداف متعددة وبالتالي استخدام عالية الإنتاجية التعبير البروتين فحص للعثور على أفضل مزيج &#39;عام&#39; من المتغيرات للحصول على البروتين النشط للذوبان بالنسبة لغالبية الأهداف. حددنا DsbC باعتبارها شريكا الانصهار المطبقة عموما للتعبير قابلة للذوبان من الببتيدات والبروتينات الغنية ثاني كبريتيد 11. باستخدام اندماج DsbC وأساليب إنتاجية عالية، في غضون أسبوع التعبير القابلة للذوبان من أهداف متعددة يمكن ملاحظة 11 ثم متغيرات إضافية، مثل تلك التي نوقشت في المقدمة، ويمكن عرضه في الجولات اللاحقة على تلك الأهداف التي تتطلب مزيدا من التحسين. وتهدف البروتوكولات الموصوفة هنا في التعبير عن البروتينات ثاني كبريتيد الغنية والببتيدات. ومع ذلك، بالنسبة للمستخدمين الذين يرغبون في إكسبالبروتينات غير شبكية ريس بطريقة إنتاجية عالية، وقد نشرت البروتوكولات المقابلة سابقا ويمكن العثور عليها في أي مكان آخر 22،24. الإعداد إنتاجية عالية مثالية لعدد من التطبيقات، بما في ذلك فحص عدد كبير من البروتينات المختلفة للتعبير قابلة للذوبان أو فحص عدد كبير من بنيات التعبير (بما في ذلك مختلف الانصهار به) لعدة الجينات المستهدفة في نفس الوقت ( أو التعبير متعددة يبني لهدف واحد) من أجل تحسين معدلات النجاح. ويمكن أيضا أن تستخدم منصة لقياس والتحقق من بروتوكولات جديدة على عدد كبير من الأهداف. وتشمل التطبيقات الأخرى فحص المتغيرات لهدف صعب واحد، على سبيل المثال، كل orthologs أو أفراد من عائلة واحدة، أو لاختبار نجاح الإنتاج من لجنة من المسوخ من هدف واحد في تجربة واحدة. كما تم استخدام هذا البروتوكول في تركيبة مع ناقلات شارك في التعبير (الطرافة<html> ح واحد الموسومة البروتين فقط) للسماح للالمنسدلة وتوصيف الأولية للمجمعات البروتين البروتين يتبعه أكثر تحليل شامل الفيزيائية الحيوية لتأكيد تشكيل معقدة الصحيح والعناصر المتفاعلة 33. كمية البروتين المنقى مناسبة في بعض الأحيان لفحوصات الدقيقة (اختبارات وظيفية، البروتين DNA 34 أو البروتين البروتين المقايسات التفاعل). وهناك العديد من المزايا للإنتاجية عالية استراتيجية الفحص التعبير: (ط) القدرة على اختبار عدد كبير من الأهداف أو عدد كبير من المتغيرات في تجربة واحدة، (ب) الاختلاف محدودة دفعة إلى دفعة، (ج) و البساطة وسهولة العمل على نطاق أصغر باستخدام الآبار العميقة، (د) قابلية التوسع والتكاثر في نطاق أوسع، (ت) إمكانية التشغيل الآلي، و (السادس) بساطة تتبع والتعامل مع (أي وسم أنابيب الفردية، وأقل أخطاء أدخلت عند استخدام شكل لوحة من التعامل مع أنابيب الفردية في خلط أو تبادل من الحيوانات المستنسخة). الطبقة = &quot;jove_content&quot;&gt; على الرغم من أن لم تناقش في قسم البروتوكول، وهناك العديد من الاعتبارات الهامة لإعداد التجربة التي سيتم مناقشتها بإيجاز أدناه. للاطلاع على مناقشة أكثر شمولا يرجى الاطلاع على المنشور السابق 24. لأقصى قدر من الكفاءة، من المفيد أن يكون هناك نظام مناسب لإنتاجية عالية الاستنساخ، لتبسيط الاستنساخ الفرعي أعداد كبيرة من الأهداف. للمرحلة الأولى من المشروع VENOMICS، ونحن الاستفادة من نظام إعادة التركيب تنوعا بوابة 25 التي تسمح subcloning في أي ناقلات الوجهة بوتيرة مئات من الحيوانات المستنسخة في الأسبوع. بروتوكولات لبوابة إعادة التركيب الاستنساخ ويمكن الاطلاع على موقع إينفيتروجن. وتشمل بدائل أخرى لإنتاجية عالية الاستنساخ-ربط مستقلة الاستنساخ (LIC) 35،36 وخالية من التقييد (RF) استنساخ 37. هناك طرق متعددة للحصول على الجينات المستهدفة للتعبير، بما في ذلك عن طريق الحمض النووي PCR من القالب، من مجموعات استنساخ دخول أو كماالجينات الاصطناعية، والتي هي الاستراتيجية المختارة للمشروع VENOMICS. ويمكن طلب الجينات الاصطناعية مع مواقع إعادة التركيب على كل نهاية التوليف الجيني والجينات يتيح سهولة الأمثل كودون تسلسل الجين الهدف (استبعاد نادرة E. القولونية الكودونات). ويوصى هذا ولكنه ليس أساسيا. للأهداف دون كودون الأمثل التي تحتوي على عدد كبير من كودونات نادرة، رشيد 2 (DE3) pLysS (الذي يحمل tRNAs للكودونات النادرة التي لا يتم التعبير عن غاية في كولاي) قد يكون أكثر ملاءمة من BL21 (DE3) pLysS. في حين أن هناك سلالات المتاحة التي تحد من خفض السندات ثاني كبريتيد في البيئة والحد من عادة السيتوبلازم، في أيدينا أنها لم تكن ناجحة كما E. العادية القولونية سلالات 11. يتم إجراء تنقية تقارب نطاق والتحليلية من الثقافات اختبار التعبير من أجل استرداد البروتينات القابلة للذوبان والانصهار تقدير الغلة. ويمكن الحصول على البيانات الكمية على اله غلة قابلة للذوبان البروتينات الانصهار أعرب ضمن مجموعة من ،1-100 ملغ / لتر من الثقافة. إذا كان الهدف غير قابل للذوبان والتعبير والحث درجات الحرارة البديلة، والسلالات أو وسائل الإعلام يمكن اختبارها قبل أن يتم السعي شركاء الانصهار مختلفة. للتعبير عن ذوبان البروتينات ثاني كبريتيد الغنية، ونحن في المرتبة سابقا تأثير شركاء الانصهار كما DsbC&gt; DsbA&gt; GST&gt; MBP&gt; TRX&gt; HIS علامة للتعبير حشوية 11. التعبير محيط بالجبلة هو احتمال آخر قد تساعد للطي الناجح لأهداف ثاني كبريتيد الغنية. والجبلة المحيطية هي بيئة خفض أقل من السيتوبلازم ويحتوي على المحرمين الأكسدة مفيدة لمساعدة ثاني كبريتيد الترابط. يتم ترجمة DsbC، DsbA، وMBP البروتينات عادة إلى الجبلة المحيطية التي كتبها متواليات إشارة محيط بالجبلة بهم. هذا يتيح الفرصة لاستغلال هذه العلامات لتوجيه أهداف ثاني كبريتيد الغنية إلى الفضاء محيط بالجبلة من أجل مساعدة للطي. لأهداف مستعصية على الحل، فإن الخطوة التالية هي عurify الهدف غير قابلة للذوبان HIS الموسومة من الهيئات إدراج، وذوبان refold (هذا هو خارج نطاق هذا البروتوكول ولن يتم مناقشتها هنا 3 9). وهذا يمكن أن يكون بسيطا إلى حد ما للأهداف مع واحد فقط أو اثنين من السندات ثاني كبريتيد، ولكنه يصبح أكثر صعوبة حيث بلغ عدد السندات ثاني كبريتيد الزيادات. بدلا من ذلك، وخاصة بالنسبة للبروتينات والببتيدات مع أربعة أو أكثر من السندات ثاني كبريتيد، فإنه قد يكون من المفيد محاولة نظم الإنتاج أكثر تعقيدا مثل الخميرة، أو التعبير الحشرات الثدييات. مع التقدم في التصغير والأتمتة، سوف بالمشاركه الكهربية المختبر على واحد في رقاقة التكنولوجيات 28 سيكون بلا شك طريق المستقبل للتحليلات الوظيفية. ونحن نتصور أن لمعظم الأغراض (ربما باستثناء الدراسات البنيوية) وهذا سوف ينفي الحاجة إلى الثقافات على نطاق واسع. سوف الثقافات الصغيرة أن تكون مفيدة ليس فقط لفحص ظروف التعبير، ولكن أيضا أن تكون قادرة على توفير SUFتبلغ ficient من العينة لهذه المقايسات الفنية المنمنمة. فإن القدرة على إنتاج أهداف متعددة بالتوازي بكميات كافية لتوصيف وظيفي خفض تكاليف زراعة واستخدام هذا النوع من المنصات، والتعبير وتوصيف البروتينات المؤتلف تصبح أكثر تكلفة وفعالية من حيث الوقت. البروتوكولات هنا تم تطبيقها على التعبير عن الببتيدات والبروتينات الغنية ثاني كبريتيد في المرحلة الأولية للمشروع FP7 VENOMICS الأوروبي. السموم هي مصدر ممتاز من الببتيدات النشطة بيولوجيا التي غالبا ما تنطوي على إمكانات الدوائية مثيرة للاهتمام. ومع ذلك، إنتاجها يمثل تحديا بسبب أنماط معقدة ثاني كبريتيد الربط، وحجمها صغير. باستخدام منصات عالية الإنتاجية مثل واحد الموصوفة هنا، يهدف المشروع VENOMICS لإنشاء مكتبة من 10،000 الببتيدات السم رواية لإعادة إنتاج التنوع التي لوحظت في الطبيعة. سوف تستغل هذه المكتبة لتوصيف ثاني كبريتيد-Rالببتيدات معنوى مع الدوائية المحتملة أو التطبيقات العلاجية بهدف تطوير أدوية جديدة. ويجري حاليا استخدام منصة لقياس والتحقق من صحة بروتوكولات جديدة لاستخدامها في المشروع VENOMICS.

بدافع النهوض الجينوميات وتسارع معدل اكتشاف بروتينات جديدة، تم تطوير خطوط الأنابيب إنتاجية عالية ليوازي الأساليب التقليدية لفحص وتحديد استراتيجيات إنتاج البروتين الأمثل. وتشمل المتغيرات المحتملة ليكون الأمثل، ولكن ليس على سبيل الحصر، سلالات متفاوتة التعبير 1،2، 3،4 درجة الحرارة، ووسائل الإعلام 2،3، الهدف المتغيرات 5، شركاء الانصهار 6-13، وشارك في التعبير مع المحرمين 14،15، هيولي أو محيط بالجبلة التعبير 16-18، والعازلة تنقية مكونات 3. من خلال تنفيذ النهج إنتاجية عالية، العديد من المتغيرات أو العديد من الأهداف يمكن اختبار بالتوازي مع مستوى عال من الكفاءة، مع الحد من التباين دفعة إلى دفعة. في تجربتنا، كما يعطي استراتيجية استنساخ جيدة على نطاق المتابعة باستخدام نفس الثقافة (درجة الحرارة، ووسائل الإعلام، التهوية، الخ) والظروف تنقية (نفس ريسين، ومخازن، وغيرها). وقد استخدمت العديد من منصات إنتاجية عالية في العقد الماضي لتحديد الظروف الملائمة لذوبان البروتين التعبير، أي من خلال المعلمات متفاوتة مثل الشركاء الانصهار، والسلالات التعبير أو درجة حرارة 19-23. كنا مؤخرا نهجنا فحص إنتاجية عالية للتعبير عن ذوبان في ثاني كبريتيد الغنية البروتينات 11. كانت البروتينات المحددة ليس فقط من مصادر السامة، ولكن شملت أيضا مثبطات انزيم ثاني كبريتيد الغنية من مجموعة واسعة من الأنواع بما في ذلك النباتات والخنازير والأبقار والبشر. مقارنة التجربة آثار 12 شركاء الانصهار مختلفة وثلاث سلالات مختلفة التعبير على الذوبان وقابلة للطي من 28 البروتينات شبكية ثاني كبريتيد. أثبتنا أن استخدام DsbC كشريك الانصهار للإنتاج في BL21 سلالة (DE3) pLysS outproduced إلى حد كبير (في كل من المحصول وعدد من البروتينات القابلة للذوبان التي تم الحصول عليها) أي تركيبة أخرى من سلالة والانصهار اختبار 11. النتائج هذه التجربة شكلت الأساس للتكيف لدينا خط أنابيب الأصلي إنتاجية عالية عموما (والتي تم استخدامها لفحص التعبير عن مجموعة واسعة من البروتينات) 22،24 في واحدة أكثر ملاءمة للتعبير عن أهداف ثاني كبريتيد الغنية. البروتينات ثاني كبريتيد الغنية من السموم الحيوانية ذات أهمية خاصة. السموم هي خليط معقد من الببتيدات النشطة بيولوجيا والبروتينات، مع القيمة المحتملة عقاقيري وعلاجيا. ومع ذلك، التعبير عن ثاني كبريتيد البروتينات المحتوية على السندات ليست تافهة. تحتوي هذه البروتينات عادة ما بين 1-7 السندات ثاني كبريتيد، ويجب أن تتأكسد مع أنماط ثاني كبريتيد-الترابط الصحيح من أجل أن تكون نشطة. حاليا، يتم استخدام منصة لفحص التعبير عن عدد كبير من البروتينات الحيوانية السم ثاني كبريتيد الغنية كجزء من المشروع الأوروبي FP7 VENOMICS (www.venomics.eu) والقياس بروتوكولات الرواية للتعبير إنتاجية عالية الآلاف من الأهداف . هنا، أسلوب مؤتمتوتقدم لإنتاجية عالية الصغيرة الفرز التعبير وتنقية (انظر الشكل 1) تطبق على ثاني كبريتيد الغنية البروتينات الحيوانية السم. استراتيجية ثاني كبريتيد الببتيدات والبروتينات الغنية يستخدم علامة HIS لتنقية والشريك الانصهار الأكسدة الفعالة، DsbC، وخلق شطورة اندماج HIS-DsbC إلى البروتينات المستهدفة (انظر الشكل 2). في حين أن التركيز من البروتوكولات هو أتمتة هنا باستخدام السائل التعامل مع الروبوت وبالمشاركه الكهربائي، وهذه الأساليب هي أيضا مناسبة عن دليل نهج إنتاجية عالية، وهذا يعني أنه حتى مع مختبرات الإعداد الأساسي يمكن الاستفادة من البروتوكولات دون أي شرط مسبق لمعدات باهظة الثمن . وقد نشرت البروتوكولات دليل للتحول إلى تنقية وتحليل (ليست محددة لبروتينات ثاني كبريتيد الغنية) في أي مكان آخر و24 لن تتكرر هنا. مرت من الإجراء اليدوي (من استنساخ التعبير، التي تنتجها recombiالاستنساخ الوطني 25، لتحليل مستويات البروتين للذوبان) 96 (باستخدام الكشف SDS-PAGE) أو 384 (4 × 96، واستخدام لطخة نقطة وSDS-PAGE 26) الثقافات في الأسبوع (انظر الشكل 1). هذا ويمكن زيادة إذا أجريت بطريقة شبه الآلي (باستخدام الروبوت التعامل مع السائل وصمة عار نقطة أو 26 بالمشاركه الكهربائي، كما هو الحال مع نظام الفرجار GXII LabChip 22 لتحليل النتائج) لتصل إلى 1،152 (12 × 96) الثقافات بالتوازي أكثر من أسبوع واحد، كما هو موضح هنا. يتم إجراء زراعة في بئر عميقة 24 (DW24) شكل بحيث حاضنات تهز العادية يمكن استخدامها على النقيض من الثقافات التي تزرع في بئر عميقة 96 (DW96) شكل، والتي تستلزم استخدام قصيرة المدارية حاضنات عالية السرعة تهتز للتهوية كافية (الهز في 800 دورة في الدقيقة). استخدام وسائل الإعلام لصناعة السيارات في الحث 27 أيضا يبسط التعبير، والقضاء على خطوة الاستقراء دليل. حتى عندما تستخدم بالفعل مختبرات التعبير وبوري محددة مسبقاشروط fication، وهذه يمكن نقلها مباشرة إلى هذا النظام بالمشاركه ببساطة لتحسين الكفاءة. ويرد تخطيطي مفصل للأنابيب فحص إنتاجية عالية للبروتينات ثاني كبريتيد الغنية في الشكل 3. تم تحديد المعلمات في خط أنابيب استنادا إلى تجارب واسعة الفرز 11، 22، الأمر الذي سمح لنا لاختيار الظروف الأكثر فائدة للإنتاج البروتين. توصيف يمكن أن يؤديها على البروتينات الموسومة تنقية مباشرة من التعبيرات الصغيرة في دراسات تجريبية حيث عشرات ميكروغرام من عينة كافية، أو لفحوصات وظيفية حساسة وفحوصات ملزمة (على سبيل المثال، نظم انخفاض حجم بالمشاركه التصحيح المشبك 28). لا يمكن للنفس حتى يتم تنفيذ أهداف على معلم بعد الانقسام، شريطة أن يتم إزالة علامة والبروتيني (على سبيل المثال، من خلال عكس المرحلة HPLC). ويمكن أيضا لمراقبة الجودة أن يقوم بها مطياف الكتلة (للتأكد من حجم المتوقع والأكسدة الحادي وأكلت) أو طرق الكروماتوغرافي (لتأكيد نقاء أو عدم التجانس) 29. في بعض الأحيان علامة الانقسام غير ضروري أو حتى مرغوب فيه (ولا سيما بالنسبة للبروتينات قابلة للذوبان ضعيفة 30،31)، لذلك في هذا الانقسام بروتوكول اختياري. بغض النظر، في جميع بنيات هناك TEV البروتيني انشقاق موقع (ENLYFQ / [G] 32) التي سبقت مباشرة الجين المستهدف لإنتاج البروتين الأصلي بعد الانقسام (انظر الشكل 2 ومناقشة). إذا كان المطلوب الانقسام العلامة الانصهار، ويمكن اختبار الانقسام (على الكسر أو شطف &quot;على عمود &#39;) في نطاق صغير لتحليل الكفاءة، وتحسين الظروف إذا لزم الأمر والحصول على تقديرات موثوقة للعائدات للتجارب نطاق المتابعة اللاحقة. هناك خياران لحجم حبات استخدمت خلال تنقية تقارب، تبعا لأهداف وتطلعات التجربة. لتكون قادرة على التقاط أكبر قدر ممكن من البروتين (لتنقية لفحوصات تجريبية أو MS، أو لextrapolيأكلون الغلة النطاق متابعة) وينبغي أن تستخدم الحجم النهائي من 200 ميكرولتر من الراتنج، مما يتيح الكشف عن البروتينات القابلة للذوبان في مجموعة من 1-100 ملغ / لتر الثقافة قبل تشبع النظام (انظر بروتوكول (A) في القسم 8.1) . ومع ذلك، إذا كان الهدف من هذه التجربة هو الكشف عن كميات قليلة من البروتينات القابلة للذوبان ثم الحجم النهائي من 50 ميكرولتر من الراتنج هو مناسب، مما يسمح للكشف عن البروتين للذوبان في حدود 0،1 حتي 25 ملغ / لتر الثقافة (انظر البروتوكول (B ) في القسم 8.2). يمكن زيادتها إنتاج ما يصل، إذا لزم الأمر، للحصول على كميات مليغرام من الأهداف تنقيته لمزيد من الدراسات البنيوية والوظيفية باستخدام الظروف المحددة للتعبير قابلة للذوبان. وقد نوقشت تفاصيل البروتوكولات المستخدمة على نطاق والمتابعة في أماكن أخرى AFMB 22،24. مزيد من التفاصيل ذات الصلة الإعداد التجريبية، الخطوات الحاسمة في البروتوكول، وتقدم التعديلات وإصلاح الأعطال والقيود المفروضة على التقنية في القرصussion. يرجى قراءة المناقشة قبل بدء التجارب. في جميع أنحاء بروتوكولات نتوقع نسبة نجاح 90٪ في كل خطوة (على سبيل المثال، لا يقل عن 90٪ من الثقافات يجب أن تنمو في أي خطوة معينة). إذا كان معدل نجاح أي خطوة في التجربة يسقط أقل من 90٪ يتم تجاهل العينات ويتم تكرار التجربة لمجموعة كاملة من بنيات. ومع ذلك، وهذا معدل نجاح لا ينطبق على عدد من البنى التي تعبر عن البروتينات القابلة للذوبان مثل أو نسبة التركيبات التي يلتصق بكفاءة 100٪، وهذا سوف تعتمد بشكل كبير على البروتينات التي تم اختبارها. يتم تقديم تفاصيل محددة لمجموعة المتابعة من المنضدة روبوت لكل بروتوكول (أيضا انظر الشكل 4)، إلا أنها يمكن تكييفها على النحو المطلوب لالمنضدة بديل مجموعة عمليات. الأجهزة الروبوت (TECAN) ويتكون من ذراع 96-الأقنية (MCA96)، مناور الروبوتية (الغجر) و8 قنوات الرأس مناولة السائل (يحة). ويمكن أيضا الاستفادة من جميع الخطوات MCA96 أن يؤديها باستخدام يحة إذا كان MCA96 غير متوفرة، إلا أنها ستستغرق وقتا أطول لأن يحة سوف تحتاج إلى أن تغسل بين الخطوات. في حين أن الروبوت هو تقنيا ليس بيئة معقمة، وإدراج المضادات الحيوية عموما يضمن أنه لا توجد مشاكل مع التلوث أو العقم.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Tecan Freedom EVO 200 liquid handling robot</td>
			<td>Tecan Group Ltd.</td>
			<td></td>
			<td>Protocols can be adapted to any liquid handling robot with a vacuum manifold for plates. 
			http://www.tecan.com/platform/apps/product/index.asp?MenuID=2694&#38;ID=5270&#38;Menu=1&#38;Item=21.1.8</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-well PCR (PCR96) plates</td>
			<td>Greiner Bio-One</td>
			<td>652270</td>
			<td> 
			http://us.gbo.com/bioscience/detail/2504/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LB medium</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Autoclaved for sterility.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibiotic stocks</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Kanamycin (50 mg/ml), Ampicillin (100 mg/ml), Chloramphenicol (34 mg/ml in ethanol), store stocks at -20 &#176;C. Use a 1 in 1000 dilution.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Deep-well 96 (DW96) plate with 2.42 ml volume capacity</td>
			<td>Greiner Bio-One&#160;</td>
			<td>780270</td>
			<td>Autoclaved for sterility. 
			http://us.gbo.com/bioscience/detail/2462/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Expression vectors</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>For the expression of target constructs. Store at &#8722;20 &#176;C.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BL21 (DE3) pLysS competent cells</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Or alternative E. coli expression strain of the user&#39;s choice. Store at &#8722;80 &#176;C.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Breathseal breathable adhesive film</td>
			<td>Greiner Bio-One</td>
			<td>676050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PCR machine with 96-well plate block</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>For the transformation heat shock and boiling of SDS-PAGE/Caliper samples.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>24-well sterile tissue culture plates</td>
			<td>Greiner Bio-One</td>
			<td>662165</td>
			<td> 
			http://us.gbo.com/bioscience/detail/2220/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LB-agar</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Autoclaved for sterility.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>200 &#956;l sterile disposable tips</td>
			<td>Tecan Group Ltd.</td>
			<td>30 038 617</td>
			<td> 
			http://www.tecan.com/platform/apps/product/index.asp?MenuID=2283&#38;ID=4118&#38;Menu=1&#38;Item=21.4.1.2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Multitron Shaking Incubator, with 3 mm throw</td>
			<td>Infors</td>
			<td>AJ103</td>
			<td>Not essential, a regular shaking incubator can also be used. 
			http://www.infors-ht.com/index.php/en/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plate incubator&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microtiter plate</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>For glycerol stocks and elution using purification protocol B.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>For the preparation of glycerol stocks.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>200 &#956;l disposable tips</td>
			<td>Tecan Group Ltd.</td>
			<td>30 038 616</td>
			<td> 
			http://www.tecan.com/platform/apps/product/index.asp?MenuID=2283&#38;ID=4118&#38;Menu=1&#38;Item=21.4.1.2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Adhesive tape pads&#160;</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>19570</td>
			<td> 
			http://www.qiagen.com/Products/Catalog/Lab-Essentials-and-Accessories/Tape-Pads</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bactinyl</td>
			<td>Orapi Group</td>
			<td></td>
			<td>Or equivalent microbial disinfectant.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ZYP-5052 medium</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>See Table 1 for recipes of components.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Deep well 24 (DW24) plates,10 ml capacity&#160;</td>
			<td>Whatman</td>
			<td>7701-5102</td>
			<td>Autoclaved for sterility. 
			http://www.whatman.com/UNIPLATECollectionandAnalysisMicroplates.aspx#7701-5102</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flat-bottomed, clear microtiter plate</td>
			<td>Greiner Bio-One</td>
			<td>655101</td>
			<td>For absorbance readings. 
			http://us.gbo.com/bioscience/detail/2029/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plate reading spectrophotometer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Optional. For measuring OD600nm of cultures.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge with rotor for deep well plates&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Suitable for 3800 x g.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lysozyme</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>50 mg/ml in water. Store at &#8722;20 &#176;C.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Imidazole ACS grade</td>
			<td>Merck</td>
			<td>IX0005-1</td>
			<td>A high quality grade of imidazole must be used so that it will not interfere with A280 readings for calculating protein yield.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lysis buffer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>50 mM Tris, 300 mM NaCl, 10 mM imidazole pH 8 containing 0.25 mg/ml lysozyme (or your preferred buffer). Add lyzozyme from stocks each time and do not store for extended periods.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water bath</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plate sonicator (Ultrasonic processor XL, adapted for deep well plates)</td>
			<td>Misonix Inc.</td>
			<td></td>
			<td>Not essential. Lysozyme alone is normally sufficient for nearly complete lysis.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNase&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>2 mg/ml stock in water, filter sterilized. Store aliquots at &#8722;20 &#176;C.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium sulphate (MgSO4)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>2M stock in water, autoclaved.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SDS-PAGE or Caliper sample buffer&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Binding buffer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>50 mM Tris, 300 mM NaCl, 10 mM imidazole pH 8 (or your preferred buffer). Store at 4 &#176;C.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wash buffer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>50 mM Tris, 300 mM NaCl, 50 mM imidazole pH 8 (or your preferred buffer). Store at 4 &#176;C.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Elution buffer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>50 mM Tris, 300 mM NaCl, 250 mM imidazole pH 8 (or your preferred buffer). Store at 4 &#176;C.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-well Receiver/Filter Plate 20 &#181;m, 1.8 ml capacity</td>
			<td>Macherey-Nagel</td>
			<td>740686.4</td>
			<td> 
			http://www.mn-net.com/ProductsBioanalysis/Accessories/tabid/10909/language/en-US/Default.aspx</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>200 &#956;l disposable wide bore tips</td>
			<td>Tecan Group Ltd.</td>
			<td>30 050 348</td>
			<td> 
			http://www.tecan.com/platform/apps/product/index.asp?MenuID=2283&#38;ID=4118&#38;Menu=1&#38;Item=21.4.1.2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ni Sepharose 6 Fast Flow resin</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>17-5318-02</td>
			<td>For purification of target fusion proteins. Store at 4 &#176;C. Wash and equilibrate before use. 
			http://www.gelifesciences.com/webapp/wcs/stores/servlet/productById/en/GELifeSciences/17531802</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tobacco Etch Virus (TEV) protease</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Optional, for cleavage. 2 mg/ml, without reducing agents in storage buffer. Store at &#8722;80 &#176;C.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-well 0.22 &#181;m filter plate</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>MSGV N22 10</td>
			<td>Optional. To filter the soluble fraction after cleavage. 
			http://www.millipore.com/catalogue/item/msgvn2210</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SDS-PAGE/dot blot equipment or Caliper Labchip GXII equipment</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Electrophoresis apparatus and choice of gel type is at the user&#8217;s discretion.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spectrophotometer and cuvettes</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>For measuring absorbance at 280 nm (A280) to calculate yield of soluble proteins. Not required if the analysis is done on the Caliper.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ZipTip pipette tips</td>
			<td>Millipore</td>
			<td></td>
			<td>Optional. The type of ZipTip is at the user&#39;s discretion. C4 resin should be used for larger proteins, while for peptides C18 may be better. Alternative methods for desalting of samples may also be used to clean up samples before further quality control. 
			http://www.millipore.com/catalogue/module/c5737#0</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Materials are listed in the order in which they are required in the Protocol section. Reagents can be stored at room temperature unless noted otherwise. Reference numbers for the author&#8217;s preferred choice of materials are provided, however equivalent products may also be suitable. For reagents where the brand will not influence the outcome of the experiment, the company details have been omitted.</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

high throughput quantitative expression screening and purification applied to recombinant disulfide-rich venom proteins produced in e. coli

الإشريكية القولونية (E. كولاي) هو النظام الأكثر استخداما على نطاق واسع التعبير لإنتاج البروتينات المؤتلف للدراسات الهيكلية والوظيفية. ومع ذلك، وتنقية البروتينات يشكل تحديا في بعض الأحيان منذ يتم التعبير عن العديد من البروتينات في شكل غير قابل للذوبان. عند العمل مع الاهداف الصعبة أو متعددة لذلك ينصح باستخدام إنتاجية عالية (بالمشاركه) فحص البروتين التعبير على نطاق صغير (1-4 مل الثقافات) لتحديد الظروف بسرعة للتعبير قابلة للذوبان. للتعامل مع مختلف برامج الجينوميات الهيكلية للمختبر، والكمية (ضمن مجموعة من ،1-100 ملغم / لتر ثقافة البروتين المؤتلف) ونفذ البروتين بالمشاركه بروتوكول الفحص التعبير والتحقق من صحتها على الآلاف من البروتينات. تم الآلي البروتوكولات مع استخدام الروبوت التعامل مع السائل ولكن يمكن أيضا إجراء يدويا بدون المعدات المتخصصة. تكتسب البروتينات السم، ثاني كبريتيد الغنيةاعتراف متزايد لإمكاناتهم كما يؤدي العقاقير العلاجية. يمكن أن تكون قوية للغاية وانتقائية، ولكن شبكات السندات ثاني كبريتيد المعقدة التي جعلها صعبة لإنتاج. كعضو في مشروع FP7 Venomics الأوروبية ( <a href="http://www.venomics.eu">www.venomics.eu</a> )، التحدي الذي يواجهنا هو تطوير استراتيجيات الإنتاج الناجحة بهدف إنتاج الآلاف من البروتينات السم الرواية لتوصيف وظيفي. بمساعدة من خصائص الأكسدة من السندات ثاني كبريتيد مصاوغة DsbC، ونحن تكييفها خط الانتاج بالمشاركه دينا للتعبير عن أكسدة، الببتيدات السم وظيفية في E. السيتوبلازم القولونية. البروتوكولات تنطبق على إنتاج البروتينات ثاني كبريتيد الغنية المتنوعة أيضا. نحن هنا لشرح خط أنابيب لدينا تطبيقها على إنتاج البروتينات الحيوانية السم. مع بروتوكولات الموصوفة هنا فمن المرجح التي سيتم الحصول عليها بروتينات قابلة للذوبان في ثاني كبريتيد الغنية اقل من أسبوع. حتى من نطاق صغير، هناك احتمال لاستخدام اله تنقية البروتينات للتحقق من صحة وحالة الأكسدة بواسطة مطياف الكتلة، لتوصيف في الدراسات التجريبية، أو لفحوصات الحساسة الدقيقة.

وتظهر نتائج ممثلة في الشكل (6) لفحص التعبير من 96 ثاني كبريتيد الغنية البروتينات من خط الأنابيب VENOMICS. يتم ترتيب البروتينات من قبل عدد متزايد من السندات ثاني كبريتيد ثم زيادة عدد المخلفات. وأعرب عن الببتيدات في السيتوبلازم مع صاحب العلامة وDsbC شريك الانصهار. عند استخدام ظروف ثقافة الموصى بها، وOD 600 من 12 ويتحقق عادة. وتنقيته الببتيدات باستخدام بروتوكول 8.2-B مع الحجم النهائي من 50 ميكرولتر من النيكل الراتنج تقارب، لذلك يمكن أن يتم الكشف عن مدة أقصاها 25 ~ البروتين ملغم / لتر الانصهار في هذه التجربة. ويبين الشكل 6A نتيجة الكهربائي من نظام الفرجار LabChip (تبين الانصهار قبل الانقسام) ونظام التسجيل بناء على استقراء لانتاج الثقافة في ملغم / لتر من البروتين الانصهار (في مستويات 0،1-2 الثقافة ملغم / لتر، 2 ل 10 ملغم / لتر الثقافة، من 10 إلى 25 ملغ / لتر والثقافة لا<html> الكشف عن ر.) لاحظ أن العلامة DsbC المشقوق يعمل عادة في حوالي 32 كيلو دالتون، بدلا من 27 كيلو دالتون كما هو متوقع. وبالمثل، فإن اندماج DsbC أيضا تشغيل حوالي 5 كيلو دالتون أعلى مما كان متوقعا. بالنسبة للكثير من الأهداف التي نراها ليس فقط الانصهار سليمة (الشريط العلوي)، ولكن أيضا الشريك الانصهار وحده (الشريط السفلي). لبعض هذه الأهداف وتحسين الظروف الثقافة يمكن أن تحسن نسبة الانصهار سليمة (الشريط العلوي) مقارنة DsbC وحدها السماح بزيادة العائد النهائي. ويستند التهديف فقط على مستوى الانصهار سليمة. لا يمكن الكشف عن 16 فقط من أصل 96 على مستوى البروتينات الانصهار. وهذا يتوافق مع مستوى النجاح العام من 83٪. من 80 البروتينات التي يمكن أن يتم الكشف عن، تم الكشف عن 45 من هذه عند مستويات تزيد عن 2 ملغم / لتر الثقافة (56٪). اعتمادا على الهدف والانصهار، والمحاصيل البروتين وعادة ما تكون في حدود 2-100 ملغ / لتر الثقافة (رغم أنه في هذا المثال باستخدام بروتوكول 8.2 B كحد أقصى ~ البروتين 25 ملغم / لتر الانصهار يمكن الكشف). ر &quot;&gt; تحليل للنجاح حسب عدد السندات ثاني كبريتيد الحاضر (كما هو موضح في الشكل 6B) يبين نجاح معقولة لجميع الأرقام من السندات ثاني كبريتيد اختبار (بين 1 و 7)، مع أدنى مستوى النجاح إلى 66٪ للأهداف التي تحتوي على 6 ثاني كبريتيد السندات. تحليل توزيع نجاح التعبير على أساس نقطة تساوي الكهربية وعدد من بقايا (هو مبين في الشكل 6C) لا يظهر أي تحيز معين لهذه التقنية، مع كل الأهداف والغايات التي لم يتم الكشف عن المؤامرة المنتشرة في جميع أنحاء أعرب بنجاح. ويبين الشكل 6D مثال للنتائج التي تم الحصول عليها من قياس الطيف الكتلي electrospray التأين مطياف الكتلة (ESI-MS) لهدف واحد، قبل وبعد التخفيض من العينة مع التلفزيون الرقمي الأرضي. عادة، فإن مثل هذا التحليل الطيفي شاملة لا تحتاج إلى أن يتم تنفيذ (لن تحتاج إلى تخفيض عينة لتحليلها)، ولكن لأغراض demonstratio شاملن أظهرنا كل من النتائج. الهدف هو موضح هو 5.7 كيلو دالتون، ثاني كبريتيد الغنية البروتين المركب من السم مع السندات ثاني كبريتيد 4. الطيف على اليسار يظهر نتائج للبروتين قبل التخفيض مع التلفزيون الرقمي الأرضي، كما كان بعد انشقاق وتحلية دون مزيد من التدخل. الطيف على الجهة اليمنى يظهر البروتين بعد التخفيض مع DTT تليها تحلية لإزالة أي فائض DTT. وتتميز الأيونات المقابلة للجماهير التجريبية مع السهام على طيف وتسمية لكل أيون هو مبين باللون الأخضر. الجماهير الأم التجريبية المحسوبة لهذه الأيونات (للبروتين قبل التخفيض (-DTT) وبعد التخفيض (+ DTT)) وترد في الجدول. الجماهير (5709.6 دا للعينة قبل التخفيض و5717.6 دا لخفض عينة) يحمل فرقا كتلة 8 دا. وهناك فرق الشامل من 2 دا يتوافق مع وجود 1 تتأكسد السندات ثاني كبريتيد، وبالتالي اختلاف كتلة 8 دا يدل على وجود 4 السندات ثاني كبريتيد (كما هو متوقع) فيعدم تخفيض عينة. <img alt="الشكل 1" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51464/51464fig1highres.jpg" width="500" /> الشكل 1. تمثيل تخطيطي للإنتاجية عالية بروتوكول الفحص التعبير. باستخدام هذا البروتوكول، يمكن اختبار 96-384 الشروط قبل شخص واحد في أسبوع واحد باستخدام الأساليب اليدوية، أو ما يصل إلى 1،152 الظروف مع المعدات شبه الآلي وصفها. هي التي شيدت البلازميدات التعبير باستخدام تكنولوجيا الاستنساخ إعادة التركيب بحيث يمكن أن يكون العديد من الأهداف الفرعية المستنسخة في وقت واحد. وقد تم تحديد الظروف التعبير مرة واحدة قابلة للذوبان والانقسام يؤديها، إذا رغبت في ذلك، يمكن للبروتين المضي قدما لمراقبة الجودة للتأكد من الأكسدة والنقاء، microassays و / أو الإنتاج على نطاق واسع. <img alt="الرقم 2" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51464/51464fig2highres.jpg" wiالبيوت = &quot;500&quot; /&gt; الشكل 2. تخطيطي لاستنساخ تهجيني العالمية وبناء التصميم. من الحيوانات المستنسخة دخول الهدف، وناقلات التعبير متعددة يمكن أن تكون مستنسخة فرعية في تجربة واحدة بطريقة إنتاجية عالية (تصل إلى 6 × 96 استنساخ دخول في الأسبوع). البروتين أعرب بترميز علامة HIS لتنقية النيكل تقارب. يتم استخدام DsbC (التي تفتقر إلى التسلسل في إشارة محيط بالجبلة للتعبير حشوية) شريك الانصهار لزيادة القابلية للذوبان و / أو قابلة للطي المساعدات والأكسدة الصحيح من البروتين الهدف. لاحظ أن تسلسل الترميز الهدف يجب أن يحتوي موقع TEV البروتيني-N محطة (ENLYFQ) إذا كان المطلوب علامة الانقسام. أقحم في الجزء العلوي الأيسر يبين إنتاج الحيوانات المستنسخة الدخول باستخدام ناقلات المانحة وتسلسل الهدف، والتي يمكن الحصول عليها عن طريق PCR أو التوليف الجيني. كما يمكن الحصول على الحيوانات المستنسخة من دخول دخول مجموعات استنساخ التجارية. هي أنظمة الاستنساخ تهجيني متعددة متاحة، لكننا الاستفادة من بوابة التنفسيم، كما هو مبين في التخطيطي. <img alt="الرقم 3" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51464/51464fig3highres.jpg" width="500" /> الرقم 3. خط أنابيب الفحص عالية الإنتاجية لأهداف ثاني كبريتيد غنية متعددة. يتم التعبير عن الأهداف في البداية لاندماج HIS-DsbC في السيتوبلازم من BL21 (DE3) pLysS E. القولونية في 37/17 درجة مئوية باستخدام لصناعة السيارات في الحث المتوسطة (ZYP-5052). يتم تنفيذ تنقية على الراتنج النيكل تليها الكشف عن بنيات القابلة للذوبان التي كتبها الكهربائي بالمشاركه (أو مع وصمة عار نقطة / SDS-PAGE). إذا كانت الجولة الأولى من الفرز التعبير غير ناجحة، وحاول ظروف ثقافة بديلة. إذا بنيات إنتاج بروتينات قابلة للذوبان في عوائد عالية بما فيه الكفاية، microassays ومراقبة الجودة لا يمكن أن يؤديها، وإذا لزم الأمر، يمكن متابعتها الإنتاج على نطاق واسع. للأهداف حيث غلة قابلة للذوبان ليست عالية بما فيه الكفاية، يمكن فحص التعبير تواصل مع سترا البديلةخصوصيات ودرجات الحرارة ثم الانصهار الشركاء الآخرين والتعبير محيط بالجبلة. يشار إلى الخطوات الاختيارية من قبل صناديق متقطع. <img alt="الرقم 4" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51464/51464fig4highres.jpg" width="500" /> قدمت الرقم 4. الإعداد روبوت المنضدة لمنصة بالمشاركه. يظهر تخطيط لدينا السائل التعامل مع الروبوت المنضدة، على الرغم من المناضد البديلة يمكن أن تستخدم أيضا هناك مواقع يعادل المتاحة. يتكون الإعداد لمحطة غسيل (WS) ل (8 قنوات الرأس مناولة السائل (يحة))، حاملتي صفيحة ميكروسكوبية مع 4 مواقف لكل (MP4، مواقف 1-4 و 5-8)، ومحطة فراغ مع 2 مناصب (تي-شركات القيمة المضافة، مواقف 9 و 10)، حاملة صفيحة ميكروسكوبية مع 3 وظائف (MP3، المواقف 11-13)، واثنين من الهزازات لوحة مع 2 مواقف كل (تي-الهزازات، والمواقف 14-15 16-17) والناقل للحصول على نصائح القابل للتصرف مع 3 وظائف (DiTi، المواقف 18-20). بالإضافة لإعادة نوعان من شركات الطيران فندق لوحات بئر عميقة واحدة لmicroplates (لا يظهر). الأجهزة المثبتة على الروبوت التعامل مع السائل هو الذراع 96-الأقنية (MCA96) للاستخدام مع نصائح القابل للتصرف، في 8 قنوات التعامل مع السائل الرأس (يحة) مع نصائح الثابتة ومناور الروبوتية (روما) التي تتحرك لوحات / المعدات حولها على على المنضدة. يشار ترقيم مواقف لجميع أنحاء البروتوكول. <img alt="الرقم 5" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51464/51464fig5highres.jpg" width="500" /> الرقم 5. تخطيطي لنقل من واحد لوحة 96 جيدا إلى أربعة 24 لوحات جيدة. <img alt="الرقم 6" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51464/51464fig6highres.jpg" width="500" /> الرقم 6. وتظهر نتائج الممثل للعرض على الشاشة تعبيرا عن 96-ثاني كبريتيد الغنية السم المواليةالبروتينات. وأعرب عن البروتينات كما اندماج HIS-DsbC في السيتوبلازم وتنقيتها باستخدام 50 ميكرولتر من الراتنج النيكل (بروتوكول 8.2-B). A) التعبير فحص النتائج، والتي تبين هلام الظاهرية والعائد التعبير التهديف. تم تعديل التباين في هلام الظاهرية حارة إلى حارة للتعويض عن العصابات خافت جدا أو شديدة. لاحظ أن بعض الأهداف يمكن أن ينظر شريطين، والفرقة العلوية المقابلة للانصهار بروتين سليمة وانخفاض الفرقة المقابلة لعلامة الانصهار وحده. B) نسبة البروتينات التي أعرب عنها في كل مستوى التعبير مقارنة مع عدد السندات ثاني كبريتيد في البروتين. وoverlayed العدد الفعلي من البروتينات في كل مجموعة على الرسم البياني. C) توزيع مستويات التعبير على أساس نقطة تساوي الكهربية (PI) وعدد من المخلفات. D) مثال على نتائج قياس الطيف الكتلي ل-ثاني كبريتيد الغنية السم 5.7 كيلو دالتون البروتين مع السندات ثاني كبريتيد 4. الطيف علىيظهر الجانب الأيسر البروتين قبل التخفيض مع التلفزيون الرقمي الأرضي وطيف على الجانب الأيمن يدل على انخفاض البروتين مع DTT ثم المحلاة. وتتميز الأيونات المقابلة للجماهير التجريبية مع السهام وترد مهامهم باللون الأخضر. الجماهير التجريبية للبروتين قبل التخفيض وبعد التخفيض وترد في الجدول وتظهر فرقا كتلة 8 دا الموافق لوجود البروتين تتأكسد قبل إضافة عامل الاختزال. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51464/51464fig6highres.jpg" target="_blank">الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم .</a> <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" fo:keep-together.within-page="always" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> عنصر </td><td> وصفة </td><td> تعليق </td></tr><tr><td> ZY </td><td> ~ 928 مل 10 ز تريبتون 5 ز خلاصة الخميرة 925 مل ماء </td><td> مزيج ثم لتعقيم الأوتوكلاف. </td></آر&gt; <tr><td> 2 M MgSO 4 </td><td> 100 مل 49.3 غرام MgSO 4 · 7H 2 O ~ 60 مل من الماء </td><td> يحرك حتى يذوب ثم لتعقيم الأوتوكلاف. </td></tr><tr><td> 50X 5052 </td><td> 1 L 250 غ من الجلسرين 730 مل من الماء 25 غرام غلوكوز 100 غرام α اللاكتوز </td><td> إضافة في تسلسل، وإثارة على نار حتى يذوب ثم كل لتعقيم الأوتوكلاف. </td></tr><tr><td> 20x وNPS </td><td> 1 L 900 مل من الماء 66 ز (NH 4) 2 SO 4 136 غ KH 2 PO 4 142 ز نا 2 هبو 4 </td><td> إضافة في تسلسل ويحرك حتى يذوب ثم كل لتعقيم الأوتوكلاف. </td></tr></tbody></table> الجدول 1. وصفة لمكونات ZYP-5052 المتوسط.

Watch this Scientific Journal Video about High Throughput Quantitative Expression Screening and Purification Applied to Recombinant Disulfide-rich Venom Proteins Produced in E. coli at JoVE.com

High Throughput Quantitative Expression Screening and Purification Applied to Recombinant Disulfide-rich Venom Proteins Produced in E. coli

يوصف بروتوكول للكمية، وارتفاع الإنتاجية التعبير فحص وتنقية التحليلية من البروتينات الانصهار من الثقافات على نطاق صغير القولونية وتطبيقه على التعبير عن أهداف البروتين المركب من السم حيوان ثاني كبريتيد الغنية.

عالية الإنتاجية التعبير الكمي فحص وتنقية تطبق على المؤتلف ثاني كبريتيد الغنية البروتينات السم المنتجة في<em&gt; E. القولونية</em

Escherichia coli (E. coli) is the most widely used expression system for the production of recombinant proteins for structural and functional studies. ...

high-throughput-quantitative-expression-screening-purification

Research

JoVE Journal

Biology

High Throughput Quantitative Expression Screening and Purification Applied to Recombinant Disulfide-rich Venom Proteins Produced in E. coli

23.9K Views.  Aix-Marseille Université.  يوصف بروتوكول للكمية، وارتفاع الإنتاجية التعبير فحص وتنقية التحليلية من البروتينات الانصهار من الثقافات على نطاق صغير القولونية وتطبيقه على التعبير عن أهداف البروتين المركب من السم حيوان ثاني كبريتيد الغنية. 

Video: High Throughput Quantitative Expression Screening and Purification Applied to Recombinant Disulfide-rich Venom Proteins Produced in E. coli

Staining of Proteins in Gels with Coomassie G-250 without Organic Solvent and Acetic Acid

In classical protein staining protocols using Coomassie Brilliant Blue (CBB), solutions with high contents of toxic and flammable organic solvents (Methanol, Ethanol or 2-Propanol) and acetic acid are used for fixation, staining and destaining of proteins in a gel after SDS-PAGE. To speed up the procedure, heating the staining solution in the microwave oven for a short time is frequently used. This usually results in evaporation of toxic or hazardous Methanol, Ethanol or 2-Propanol and a strong smell of acetic acid in the lab which should be avoided due to safety considerations. In a protocol originally published in two patent applications by E.M. Wondrak (US2001046709 (A1), US6319720 (B1)), an alternative composition of the staining solution is described in which no organic solvent or acid is used. The CBB is dissolved in bidistilled water (60-80mg of CBB G-250 per liter) and 35 mM HCl is added as the only other compound in the staining solution. The CBB staning of the gel is done after SDS-PAGE and thorough washing of the gel in bidistilled water. By heating the gel during the washing and staining steps, the process can be finished faster and no toxic or hazardous compunds are evaporating. The staining of proteins occurs already within 1 minute after heating the gel in staining solution and is fully developed after 15-30 min with a slightly blue background that is destained completely by prolonged washing of the stained gel in bidistilled water, without affecting the stained protein bands.

A short protocol for protein staining with Coomassie Brilliant Blue (CBB) G-250 in polyacrylamide gels is described without using organic solvents or acetic acid as in the classical staining procedures with CBB.

تلطيخ من البروتينات في الهلام مع Coomassie G - 250 دون عضوي حمض الخليك والمذيبات

In classical protein staining protocols using Coomassie Brilliant Blue (CBB), solutions with high contents of toxic and flammable organic solvents ...

Mutagenesis and Functional Selection Protocols for Directed Evolution of Proteins in E. coli

The efficient generation of genetic diversity represents an invaluable molecular tool that can be used to label DNA synthesis, to create unique molecular signatures, or to evolve proteins in the laboratory. Here, we present a protocol that allows the generation of large (>1011) mutant libraries for a given target sequence. This method is based on replication of a ColE1 plasmid encoding the desired sequence by a low-fidelity variant of DNA polymerase I (LF-Pol I). The target plasmid is transformed into a mutator strain of E. coli and plated on solid media, yielding between 0.2 and 1 mutations/kb, depending on the location of the target gene. Higher mutation frequencies are achieved by iterating this process of mutagenesis. Compared to alternative methods of mutagenesis, our protocol stands out for its simplicity, as no cloning or PCR are involved. Thus, our method is ideal for mutational labeling of plasmids or other Pol I templates or to explore large sections of sequence space for the evolution of activities not present in the original target. The tight spatial control that PCR or randomized oligonucleotide-based methods offer can also be achieved through subsequent cloning of specific sections of the library. Here we provide protocols showing how to create a random mutant library and how to establish drug-based selections in E. coli to identify mutants exhibiting new biochemical activities.

Mutagenesis and Functional Selection Protocols for Directed Evolution of Proteins in E. coli

Here we demonstrate a simple protocol to create a random mutant library for a given target sequence. We show how this method, which is performed in vivo in Escherichia coli, can be coupled with functional selections to evolve new enzymatic activities.

بروتوكولات اختيار الطفرات وظيفية لتطور المخرج من البروتينات في E. القولونية</em

The efficient generation of genetic diversity represents an invaluable molecular tool that can be used to label DNA synthesis, to create unique molecular ...

High Throughput Screening of Fungal Endoglucanase Activity in Escherichia coli

Cellulase enzymes (endoglucanases, cellobiohydrolases, and &beta;-glucosidases) hydrolyze cellulose into component sugars, which in turn can be converted into fuel alcohols1. The potential for enzymatic hydrolysis of cellulosic biomass to provide renewable energy has intensified efforts to engineer cellulases for economical fuel production2. Of particular interest are fungal cellulases3-8, which are already being used industrially for foods and textiles processing.
Identifying active variants among a library of mutant cellulases is critical to the engineering process; active mutants can be further tested for improved properties and/or subjected to additional mutagenesis. Efficient engineering of fungal cellulases has been hampered by a lack of genetic tools for native organisms and by difficulties in expressing the enzymes in heterologous hosts. Recently, Morikawa and coworkers developed a method for expressing in E. coli the catalytic domains of endoglucanases from H. jecorina3,9, an important industrial fungus with the capacity to secrete cellulases in large quantities. Functional E. coli expression has also been reported for cellulases from other fungi, including Macrophomina phaseolina10 and Phanerochaete chrysosporium11-12. 
We present a method for high throughput screening of fungal endoglucanase activity in E. coli. (Fig 1) This method uses the common microbial dye Congo Red (CR) to visualize enzymatic degradation of carboxymethyl cellulose (CMC) by cells growing on solid medium. The activity assay requires inexpensive reagents, minimal manipulation, and gives unambiguous results as zones of degradation (&#x201C;halos&#x201D;) at the colony site. Although a quantitative measure of enzymatic activity cannot be determined by this method, we have found that halo size correlates with total enzymatic activity in the cell. Further characterization of individual positive clones will determine , relative protein fitness. 
Traditional bacterial whole cell CMC/CR activity assays13 involve pouring agar containing CMC onto colonies, which is subject to cross-contamination, or incubating cultures in CMC agar wells, which is less amenable to large-scale experimentation. Here we report an improved protocol that modifies existing wash methods14 for cellulase activity: cells grown on CMC agar plates are removed prior to CR staining. Our protocol significantly reduces cross-contamination and is highly scalable, allowing the rapid screening of thousands of clones. In addition to H. jecorina enzymes, we have expressed and screened endoglucanase variants from the Thermoascus aurantiacus and Penicillium decumbens (shown in Figure 2), suggesting that this protocol is applicable to enzymes from a range of organisms.

High Throughput Screening of Fungal Endoglucanase Activity in Escherichia coli

We describe a low cost, high throughput method to screen for fungal endoglucanase activity in E. coli. The method relies on a simple visual readout of substrate degradation, does not require enzyme purification, and is highly scalable. This allows for the rapid screening of large libraries of enzyme variants.

ارتفاع المناولة فحص النشاط Endoglucanase الفطرية في القولونية</em

Cellulase enzymes (endoglucanases, cellobiohydrolases, and &beta;-glucosidases) hydrolyze cellulose into component sugars, which in turn can be converted ...

High-throughput Purification of Affinity-tagged Recombinant Proteins

X-ray crystallography is the method of choice for obtaining a detailed view of the structure of proteins. Such studies need to be complemented by further biochemical analyses to obtain detailed insights into structure/function relationships. Advances in oligonucleotide- and gene synthesis technology make large-scale mutagenesis strategies increasingly feasible, including the substitution of target residues by all 19 other amino acids. Gain- or loss-of-function phenotypes then allow systematic conclusions to be drawn, such as the contribution of particular residues to catalytic activity, protein stability and/or protein-protein interaction specificity.
In order to attribute the different phenotypes to the nature of the mutation - rather than to fluctuating experimental conditions - it is vital to purify and analyse the proteins in a controlled and reproducible manner. High-throughput strategies and the automation of manual protocols on robotic liquid-handling platforms have created opportunities to perform such complex molecular biological procedures with little human intervention and minimal error rates1-5.
Here, we present a general method for the purification of His-tagged recombinant proteins in a high-throughput manner. In a recent study, we applied this method to a detailed structure-function investigation of TFIIB, a component of the basal transcription machinery. TFIIB is indispensable for promoter-directed transcription in vitro and is essential for the recruitment of RNA polymerase into a preinitiation complex6-8. TFIIB contains a flexible linker domain that penetrates the active site cleft of RNA polymerase9-11. This linker domain confers two biochemically quantifiable activities on TFIIB, namely (i) the stimulation of the catalytic activity during the 'abortive' stage of transcript initiation, and (ii) an additional contribution to the specific recruitment of RNA polymerase into the preinitiation complex4,5,12 . We exploited the high-throughput purification method to generate single, double and triple substitution and deletions mutations within the TFIIB linker and to subsequently analyse them in functional assays for their stimulation effect on the catalytic activity of RNA polymerase4. Altogether, we generated, purified and analysed 381 mutants - a task which would have been time-consuming and laborious to perform manually. We produced and assayed the proteins in multiplicates which allowed us to appreciate any experimental variations and gave us a clear idea of the reproducibility of our results.
This method serves as a generic protocol for the purification of His-tagged proteins and has been successfully used to purify other recombinant proteins. It is currently optimised for the purification of 24 proteins but can be adapted to purify up to 96 proteins.

We describe a method for the affinity-tagged purification of recombinant proteins using liquid-handling robotics. This method is generally applicable to the small-scale purification of soluble His-tagged proteins in a high-throughput format.

عالية الإنتاجية تنقية تقارب الموسومة البروتينات المؤتلف

X-ray crystallography is the method of choice for obtaining a detailed view of the structure of proteins. Such studies need to be complemented by further ...

Efficient Agroinfiltration of Plants for High-level Transient Expression of Recombinant Proteins

Mammalian cell culture is the major platform for commercial production of human vaccines and therapeutic proteins. However, it cannot meet the increasing worldwide demand for pharmaceuticals due to its limited scalability and high cost. Plants have shown to be one of the most promising alternative pharmaceutical production platforms that are robust, scalable, low-cost and safe. The recent development of virus-based vectors has allowed rapid and high-level transient expression of recombinant proteins in plants. To further optimize the utility of the transient expression system, we demonstrate a simple, efficient and scalable methodology to introduce target-gene containing Agrobacterium into plant tissue in this study. Our results indicate that agroinfiltration with both syringe and vacuum methods have resulted in the efficient introduction of Agrobacterium into leaves and robust production of two fluorescent proteins; GFP and DsRed. Furthermore, we demonstrate the unique advantages offered by both methods. Syringe infiltration is simple and does not need expensive equipment. It also allows the flexibility to either infiltrate the entire leave with one target gene, or to introduce genes of multiple targets on one leaf. Thus, it can be used for laboratory scale expression of recombinant proteins as well as for comparing different proteins or vectors for yield or expression kinetics. The simplicity of syringe infiltration also suggests its utility in high school and college education for the subject of biotechnology. In contrast, vacuum infiltration is more robust and can be scaled-up for commercial manufacture of pharmaceutical proteins. It also offers the advantage of being able to agroinfiltrate plant species that are not amenable for syringe infiltration such as lettuce and Arabidopsis. Overall, the combination of syringe and vacuum agroinfiltration provides researchers and educators a simple, efficient, and robust methodology for transient protein expression. It will greatly facilitate the development of pharmaceutical proteins and promote science education.

Plants offer a novel system for the production of pharmaceutical proteins on a commercial scale that is more scalable, cost-efficient and safe than current expression paradigms. In this study, we report a simple and convenient, yet scalable approach to introduce target-gene containing Agrobacterium tumefaciens into plants for protein transient expression.

Agroinfiltration كفاءة من النباتات للتعبير عابر الرفيع المستوى من البروتينات المؤتلف

Mammalian cell culture is the major platform for commercial production of human vaccines and therapeutic proteins. However, it cannot meet the increasing ...

Non-chromatographic Purification of Recombinant Elastin-like Polypeptides and their Fusions with Peptides and Proteins from Escherichia coli

Elastin-like polypeptides are repetitive biopolymers that exhibit a lower critical solution temperature phase transition behavior, existing as soluble unimers below a characteristic transition temperature and aggregating into micron-scale coacervates above their transition temperature. The design of elastin-like polypeptides at the genetic level permits precise control of their sequence and length, which dictates their thermal properties. Elastin-like polypeptides are used in a variety of applications including biosensing, tissue engineering, and drug delivery, where the transition temperature and biopolymer architecture of the ELP can be tuned for the specific application of interest. Furthermore, the lower critical solution temperature phase transition behavior of elastin-like polypeptides allows their purification by their thermal response, such that their selective coacervation and resolubilization allows the removal of both soluble and insoluble contaminants following expression in Escherichia coli. This approach can be used for the purification of elastin-like polypeptides alone or as a purification tool for peptide or protein fusions where recombinant peptides or proteins genetically appended to elastin-like polypeptide tags can be purified without chromatography. This protocol describes the purification of elastin-like polypeptides and their peptide or protein fusions and discusses basic characterization techniques to assess the thermal behavior of pure elastin-like polypeptide products.

Non-chromatographic Purification of Recombinant Elastin-like Polypeptides and their Fusions with Peptides and Proteins from Escherichia coli

Elastin-like polypeptides are stimulus-responsive biopolymers with applications ranging from recombinant protein purification to drug delivery. This protocol describes the purification and characterization of elastin-like polypeptides and their peptide or protein fusions from Escherichia coli using their lower critical solution temperature phase transition behavior as a simple alternative to chromatography.

تنقية الكروماتوغرافي من غير البروتينية المؤتلف الإيلاستين مثل والإنشطار مع الببتيدات والبروتينات من<em&gt; كولاي</em

Elastin-like polypeptides are repetitive biopolymers that exhibit a lower critical solution temperature phase transition behavior, existing as soluble ...

High-throughput Titration of Luciferase-expressing Recombinant Viruses

Standard plaque assays to determine infectious viral titers can be time consuming, are not amenable to a high volume of samples, and cannot be done with viruses that do not form plaques. As an alternative to plaque assays, we have developed a high-throughput titration method that allows for the simultaneous titration of a high volume of samples in a single day. This approach involves infection of the samples with a Firefly luciferase tagged virus, transfer of the infected samples onto an appropriate permissive cell line, subsequent addition of luciferin, reading of plates in order to obtain luminescence readings, and finally the conversion from luminescence to viral titers. The assessment of cytotoxicity using a metabolic viability dye can be easily incorporated in the workflow in parallel and provide valuable information in the context of a drug screen. This technique provides a reliable, high-throughput method to determine viral titers as an alternative to a standard plaque assay.

This article presents a high-throughput luciferase expression-based method of titrating various RNA and DNA viruses using automated and manual liquid handlers.

عالية الإنتاجية المعايرة من luciferase المراسل، معربا عن الفيروسات المؤتلف

Standard plaque assays to determine infectious viral titers can be time consuming, are not amenable to a high volume of samples, and cannot be done with ...

Green Fluorescent Protein-based Expression Screening of Membrane Proteins in Escherichia coli

The production of recombinant membrane proteins for structural and functional studies remains technically challenging due to low levels of expression and the inherent instability of many membrane proteins once solubilized in detergents. A protocol is described that combines ligation independent cloning of membrane proteins as GFP fusions with expression in Escherichia coli detected by GFP fluorescence. This enables the construction and expression screening of multiple membrane protein/variants to identify candidates suitable for further investment of time and effort. The GFP reporter is used in a primary screen of expression by visualizing GFP fluorescence following SDS polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE). Membrane proteins that show both a high expression level with minimum degradation as indicated by the absence of free GFP, are selected for a secondary screen. These constructs are scaled and a total membrane fraction prepared and solubilized in four different detergents. Following ultracentrifugation to remove detergent-insoluble material, lysates are analyzed by fluorescence detection size exclusion chromatography (FSEC). Monitoring the size exclusion profile by GFP fluorescence provides information about the mono-dispersity and integrity of the membrane proteins in different detergents. Protein: detergent combinations that elute with a symmetrical peak with little or no free GFP and minimum aggregation are candidates for subsequent purification. Using the above methodology, the heterologous expression in E. coli of SED (shape, elongation, division, and sporulation) proteins from 47 different species of bacteria was analyzed. These proteins typically have ten transmembrane domains and are essential for cell division. The results show that the production of the SEDs orthologues in E. coli was highly variable with respect to the expression levels and integrity of the GFP fusion proteins. The experiment identified a subset for further investigation.

Green Fluorescent Protein-based Expression Screening of Membrane Proteins in Escherichia coli

A streamlined approach to screening for the expression of recombinant membrane proteins in Escherichia coli based on fusion to green fluorescent protein is presented.

الأخضر الفلورسنت القائم على البروتين التعبير فحص غشاء البروتينات في<em&gt; الإشريكية القولونية</em

The production of recombinant membrane proteins for structural and functional studies remains technically challenging due to low levels of expression and ...

High-throughput Screening for Chemical Modulators of Post-transcriptionally Regulated Genes

Both transcriptional and post-transcriptional regulation have a profound impact on genes expression. However, commonly adopted cell-based screening assays focus on transcriptional regulation, being essentially aimed at the identification of promoter-targeting molecules. As a result, post-transcriptional mechanisms are largely uncovered by gene expression targeted drug development. Here we describe a cell-based assay aimed at investigating the role of the 3&#39; untranslated region (3&#8217; UTR) in the modulation of the fate of its mRNA, and at identifying compounds able to modify it. The assay is based on the use of a luciferase reporter construct containing the 3&#8217; UTR of a gene of interest stably integrated into a disease-relevant cell line. The protocol is divided into two parts, with the initial focus on the primary screening aimed at the identification of molecules affecting luciferase activity after 24 hr of treatment. The second part of the protocol describes the counter-screening necessary to discriminate compounds modulating luciferase activity specifically through the 3&#8217; UTR. In addition to the detailed protocol and representative results, we provide important considerations about the assay development and the validation of the hit(s) on the endogenous target. The described cell-based reporter gene assay will allow scientists to identify molecules modulating protein levels via post-transcriptional mechanisms dependent on a 3&#8217; UTR.

Here we describe a cell-based reporter gene assay as a valuable tool to screen chemical libraries for compounds modulating post-transcriptional control mechanisms exerted through 3&#8217; UTR.

الإنتاجية العالية للكشف عن المغيرون الكيميائية من الجينات المشاركة ما بعد transcriptionally الخاضعة للرقابة

Both transcriptional and post-transcriptional regulation have a profound impact on genes expression. However, commonly adopted cell-based screening assays ...

Purification and Refolding to Amyloid Fibrils of (His)6-tagged Recombinant Shadoo Protein Expressed as Inclusion Bodies in E. coli

The Escherichia coli expression system is a powerful tool for the production of recombinant eukaryotic proteins. We use it to produce Shadoo, a protein belonging to the prion family. A chromatographic method for the purification of (His)6-tagged recombinant Shadoo expressed as inclusion bodies is described. The inclusion bodies are solubilized in 8 M urea and bound to a Ni2+-charged column to perform ion affinity chromatography. Bound proteins are eluted by a gradient of imidazole. Fractions containing Shadoo protein are subjected to size exclusion chromatography to obtain a highly purified protein. In the final step purified Shadoo is desalted to remove salts, urea and imidazole. Recombinant Shadoo protein is an important reagent for biophysical and biochemical studies of protein conformation disorders occurring in prion diseases. Many reports demonstrated that prion neurodegenerative diseases originate from the deposition of stable, ordered amyloid fibrils. Sample protocols describing how to fibrillate Shadoo into amyloid fibrils at acidic and neutral/basic pHs are presented. The methods on how to produce and fibrillate Shadoo can facilitate research in laboratories working on prion diseases, since it allows for production of large amounts of protein in a rapid and low cost manner.

Purification and Refolding to Amyloid Fibrils of His6-tagged Recombinant Shadoo Protein Expressed as Inclusion Bodies in E. coli

A two-step chromatographic method is described for the purification of recombinant Shadoo protein expressed as inclusion bodies in Escherichia coli, as well as a protocol to fibrillate purified Shadoo into amyloid structures.

تنقية وRefolding إلى اميلويد الألياف من (صاحب)<sub&gt; 6</sub&gt; -tagged المؤتلف Shadoo البروتين التعبير عن الهيئات إدراج في<em&gt; E. القولونية</em

The Escherichia coli expression system is a powerful tool for the production of recombinant eukaryotic proteins. We use it to produce Shadoo, a protein ...