The authors would like to thank Drs. Amanda Del Rosario and Guillaume Carmona for critical reading of the manuscript. This work was supported by grants from the Department of Defense&#160;DOD Innovator Award (W81XWH-14-1-0240&#160;to ROH); the National Cancer Institute (U54 CA126515/CA163109); the Broad Institute of MIT and Harvard; the Howard Hughes Medical Institute, of which ROH is an Investigator; and in part by the Support Grant from the National Cancer Institute to the Koch Institute for Integrative Cancer Research at MIT (P30-CA14051). AN received postdoctoral fellowships from the Howard Hughes Medical Institute and the Ludwig Center for Cancer Research at MIT.

ملاحظة: يمكن إجراء الإجراء على الأنسجة الطازجة أو المجمدة فلاش. ونحن نوصي perfusing الأنسجة أوعية دموية للغاية مع برنامج تلفزيوني في وقت تشريح للقضاء على خلايا الدم الحمراء وبروتينات البلازما. نحن لا ننصح إجراء الإجراء على الأنسجة الثابتة كما تثبيت (أي، يشابك الكيميائية) يتداخل مع decellularization ويمكن أيضا بخرق كبير لاحق تحليل الطيف الكتلي. لهذا الإجراء بأكمله، ونحن نوصي باستخدام أنابيب المنخفض الاحتفاظ ونصائح ماصة لتحقيق أقصى قدر من البروتين والببتيد الانتعاش. 1. Decellularization من الأنسجة أو الأورام ملاحظة: قبل البدء، وإعداد الكواشف وإضافة مثبطات الأنزيم البروتيني (المقدمة مع المقصورة عدة استخراج البروتين) إلى حجم المطلوب من كل العازلة. يجب أن تبقى جميع مخازن والعينات على الجليد لمدة التجربة باستثناء CS العازلة التي تحتاج إلى أن تبقى في RT لمنع SDS precipitation. ملاحظة: بروتوكول يستخدم سلسلة من الحضانة في مخازن درجة الحموضة المختلفة والتي تحتوي على كمية مختلفة من الأملاح والمنظفات لبالتسلسل استخراج البروتينات داخل الخلايا وإثراء للبروتينات ECM غير قابلة للذوبان (الشكل 1، الجدول 1؛ انظر أيضا مناقشة عن بدائل لاستخدام مجموعة تجارية مفصلة هنا). كميات الكواشف الواردة أدناه هي ل100 ملغ من الأنسجة أو الأورام (انظر الجدول 1) وتحتاج إلى تعديلها بشكل مناسب. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> التجانس 100 ملغ من الأنسجة في 500 ميكرولتر من العازلة C التي تحتوي على مثبطات الأنزيم البروتيني باستخدام الخالط الأنسجة حتى يتم تعطيل الأنسجة تماما، ويتم الحصول على تعليق متجانسة. ملاحظة: إضافة ديوكسي ريبونيوكلياز I (تركيز النهائي: 200 ميكروغرام / مل، وأعيد تشكيلها وفقا لتعليمات الشركة الصانعة) وريبونوكلياز A (تركيز النهائي: 20 ميكروغرام / مل، وأعيد تشكيلها وفقا لتعليمات الشركة الصانعة) لعازلة N. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> استخراج متتابعة من بروتينات قابلة للذوبان داخل الخلايا <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> استخراج البروتينات عصاري خلوي. احتضان جناسة على محور دوار أنبوب لمدة 20 دقيقة على 4 درجات مئوية. حفظ قسامة صغيرة (10 ميكرولتر من 20 ميكرولتر) من جناسة لاحقا تحليل لطخة غربية (انظر القسم النتائج المتوقعة والشكل 2). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> أجهزة الطرد المركزي لجناسة في 16000 x ج لمدة 20 دقيقة على 4 درجات مئوية. جمع طاف في أنبوب نظيفة، وهذا سوف يشكل جزء عصاري خلوي (C) للتحليل لطخة غربية. فلاش تجميد هذا الكسر وتخزينها في -80 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> أن يغسل، resuspend وبيليه في 400 ميكرولتر من العازلة W تحتوي على مثبطات الأنزيم البروتيني، واحتضان العينة على محور دوار أنبوب لمدة 20 دقيقة على 4 درجات مئوية. أجهزة الطرد المركزي لجناسة في 16000 x ج لمدة 20 دقيقة على 4 درجات مئوية. تجاهل طاف. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لاستخراج، والبروتينات النووية، Resuspend وبيليه في 150 ميكرولتر من العازلة N تحتوي على مثبطات الأنزيم البروتيني، deoxyribonucleaI حد ذاته وريبونوكلياز ألف واحتضان العينة على محور دوار أنبوب لمدة 30 دقيقة على 4 درجات مئوية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> أجهزة الطرد المركزي في العينة 16000 x ج لمدة 30 دقيقة في 4 درجات مئوية وجمع طاف في أنبوب نظيفة. كرر هذه الخطوة مرة واحدة: بعد الطرد المركزي العينة للمرة الثانية، إضافة إلى طاف طاف السابق: فإن ذلك سيشكل النووي (N) جزء من تحليل لطخة غربية. فلاش تجميد هذا الكسر وتخزينها في -80 ° C. ثم، نفذ الغسيل وفقا خطوة 1.2.3. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لاستخراج البروتينات الغشاء، resuspend وبيليه في 100 ميكرولتر من العازلة M التي تحتوي على مثبطات الأنزيم البروتيني، واحتضان العينة على محور دوار أنبوب لمدة 30 دقيقة على 4 درجات مئوية. أجهزة الطرد المركزي في العينة 16000 x ج لمدة 30 دقيقة في 4 درجات مئوية </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> جمع طاف في أنبوب نظيف: هذا سوف تشكل جزء الغشاء (M) للتحليل لطخة غربية. فلاش تجميد هذا الكسر وتخزينها في -80 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لاستخراج البروتينات هيكل الخلية، resuspend الكرية في 200 ميكرولتر من العازلة CS التي تحتوي على مثبطات الأنزيم البروتيني، واحتضان العينة على محور دوار أنبوب لمدة 30 دقيقة في RT. لاحظ أن بيليه لن تذوب تماما. نقترح تعطيل بيليه بواسطة pipetting صعودا ونزولا حتى مراقبة تعطيل بيليه. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> أجهزة الطرد المركزي في العينة 16000 x ج لمدة 30 دقيقة في RT. جمع طاف في أنبوب نظيفة. نلاحظ في هذه المرحلة إلى مزيد من الانخفاض الملحوظ في حجم الكرية (انظر الفيديو). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Resuspend وبيليه في 150 ميكرولتر من العازلة C مثبطات الأنزيم البروتيني تحتوي على واحتضان العينة على محور دوار أنبوب لمدة 20 دقيقة على 4 درجات مئوية. أجهزة الطرد المركزي في العينة 16000 x ج لمدة 20 دقيقة على 4 درجات مئوية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> جمع طاف وإضافته إلى طاف السابق: فإن ذلك سيشكل جزء هيكل الخلية (CS) من تحليل لطخة غربية. فلاش تجميد هذا الكسر وتخزينها في -80 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> أداء يغسل إضافية. Resuspend وبيليه في 500 ميكرولتر من PBS تحتوي على مثبطات الأنزيم البروتيني لالثانية احتضان العينة على محور دوار أنبوب لمدة 5 دقائق على 4 درجات مئوية. أجهزة الطرد المركزي في العينة 16000 x ج لمدة 5 دقائق عند 4 درجات مئوية. تجاهل طاف. كرر هذه الخطوة ثلاث مرات. ملاحظة: جميع آثار المنظفات تحتاج إلى إزالتها عن طريق يغسل واسعة قبل هضم البروتينات إلى ببتيدات (انظر القسم 3). في هذه المرحلة، يمكن للبيليه التخصيب ECM يكون فلاش المجمدة والاحتفاظ بها في -80 ° C. لاحظ أن حجم الكرية سوف تعتمد على كمية غير قابلة للذوبان (ECM) البروتينات في المواد البداية وكفاءة decellularization. </li></ol></li></ol> 2. مراقبة الجودة من Decellularization / ECM التخصيب بحلول SDS-PAGE والغربية وصمة عار <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> مزيج 10-20 ميكرولتر قسامة من إجمالي استخراج الأنسجة و50 مكل من كسور متوسطة مع Laemmli العازلة التي تحتوي على 100 ملي DTT. Resuspend والتخصيب ECM، جزء غير قابل للذوبان في 3X Laemmli العازلة التي تحتوي على 100 ملي DTT. ملاحظة: إنه رفع تركيزاتمن DTT وSDS المساعدة في إذابة البروتينات ECM التي هي غير قابلة للذوبان نسبيا. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> فصل البروتينات بواسطة SDS-PAGE ونقل على الأغشية النيتروسليلوز. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> أداء البقع المناعية باستخدام أجسام مضادة لمراقبة ممثل البروتينات لكل من عصاري خلوي والطاقة النووية، غشاء، هيكل الخلية وECM الكسور (انظر القسم ممثل النتائج، جدول 2 والشكل 2). </li></ol> 3. في حل هضم البروتينات إلى ببتيدات لتحليل الطيف الكتلي ملاحظة: بيليه الحصول عليها بعد إجراء decellularization وإزالة SDS هي غنية جدا في البروتينات ECM غير قابلة للذوبان لمزيد من التحليل بواسطة مطياف الكتلة تحتاج هذه البروتينات ليتم هضمها في الببتيدات. لاحظ أنه نتيجة لECM البروتين الذوبان، فإنه من غير الممكن في هذه الخطوة لقياس تركيز البروتين من العينة. وبالتالي نحن نقدم أحجام الكواشف لهضم ECM-ENRIعينات جنة التعليم العالي في الببتيدات على أساس حجم (مم) أو الوزن الجاف للبيليه التخصيب ECM (الجدول 3). تحتاج إلى أن تكون مستعدة طازجة الحلول من بيكربونات الأمونيوم واليوريا، DTT، iodoacetamide وحمض trifluoroacetic جميع. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Resuspend وعينة التخصيب ECM عن طريق إضافة حجم مناسب من 8 M اليوريا إلى بيليه التخصيب ECM وإضافة DTT بتركيز نهائي من 10MM (انظر الجدول 3). احتضان مع الإثارة مستمرة في 1400 دورة في الدقيقة لمدة 2 ساعة على 37 درجة مئوية. ملاحظة: في هذه المرحلة البروتينات ECM لن يتم حلها بشكل كامل ويجب عدم تجاهل جزيئات البروتين الكبيرة بشكل واضح عن طريق الطرد المركزي أو الترشيح. وتعليق واضحة على deglycosylation والهضم (انظر الفيديو). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الألكلة <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد الحل iodoacetamide في الماء HPLC الصف. تبرد العينة إلى RT وإضافة iodoacetamide إلى التركيز النهائي من 25 مم. لالألكلة كاملة، وDTT: يجب أن تكون نسبة iodoacetamide بين 1: 2.5 و 1: 3. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> احتضان في الظلام لمدة 30 دقيقة في RT. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Deglycosylation: وهناك حاجة deglycosylation لإزالة السلاسل الجانب الكربوهيدرات التي تتداخل مع تحديد الببتيدات المعدلة N -linked بالغليكوزيل: مذكرة. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تمييع إلى 2 M اليوريا مع 100 ملي بيكربونات الأمونيوم الرقم الهيدروجيني 8.0 وإضافة كمية مناسبة من PNGaseF (انظر الجدول 3). احتضان مع الإثارة مستمرة في 1400 دورة في الدقيقة لمدة 2 ساعة على 37 درجة مئوية. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الهضم <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة ليز-C واحتضان مع الإثارة مستمرة في 1400 دورة في الدقيقة لمدة 2 ساعة على 37 درجة مئوية. إضافة التربسين واحتضان مع الإثارة مستمرة في 1400 دورة في الدقيقة O / N عند 37 درجة مئوية. ملاحظة: تعليق-ECM الغنية التي بدأت غائمة على إعادة الأولية في 8M اليوريا تظهر واضحة بعد O / N الهضم (انظر الفيديو). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة قسامة الثانية من التربسين إلى العينة واحتضان مع الإثارة مستمرة في 1400 دورة في الدقيقة لمدة 2 ساعة إضافية عند 37 درجة مئوية. &lt;/ لى&gt; </ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تحمض <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> عند الانتهاء من عملية الهضم، إبطال نشاط التربسين التي كتبها المحمضة العينة مع الطازجة 50٪، trifluoro حمض الخل (TFA). يجب أن يصل إلى عينة الرقم الهيدروجيني &lt;2. نقترح إضافة 1-1،5 ميكرولتر من 50٪ TFA في وقت وباستخدام 1 ميكرولتر من الحل الببتيد لقياس الرقم الهيدروجيني للمحلول باستخدام ورقة الأس الهيدروجيني (انظر الفيديو). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الطرد المركزي العينة المحمضة في 16000 x ج لمدة 5 دقائق على RT. جمع طاف في أنبوب نظيفة المنخفض الاحتفاظ بهم. في هذه المرحلة، يمكن تخزين حل الببتيد في -20 ° C. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تحلية ملاحظة: التي عادة ما تتم هذه الخطوة الأخيرة في منشأة قياس الطيف الكتلي وفقا للأساليب المفضلة الخاصة بهم. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> قبل تحليل البروتينات، تحلية العينات والببتيدات مزال مع الطازجة الأسيتونتريل 60٪، حمض trifluoroacetic 0.1٪، تليها تركيز في فراغ المكثف. resuspend والببتيدات في الطازجة 3٪ acetonitrإيل، حمض trifluoroacetic 0.1٪ 8. ملاحظة: أنه بعد إزالة الملوحة وتركيز المحلول الببتيد يمكن قياس الطيفي (انظر القسم النتائج المتوقعة). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الآن تحليل عينة عن طريق قياس الطيف الكتلي، ومرة ​​أخرى وفقا للإجراءات المثلى للمنشأة قياس الطيف الكتلي. ملاحظة: نحن نشجع الباحثين المهتمين في وصف تكوين موبينيل باستخدام مطياف الكتلة إلى الرجوع إلى غيرها من المطبوعات 8-10 الموقع والتي تقدم شرحا مفصلا آخر، بما في ذلك معايير LC-MS / MS، الشامل البحث عن البيانات الطيف لتحديد وتحليل البيانات البروتين استخدام في سيليكون matrisome الشرح أداة نحن يعدون 8. </li></ol></li></ol>

<ol>
	<li>Hynes, R. O., Naba, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Overview+of+the+matrisome--an+inventory+of+extracellular+matrix+constituents+and+functions.">Overview of the matrisome--an inventory of extracellular matrix constituents and functions.</a> Cold Spring Harb Perspect Biol. 4 (1), a004903 (2012).</li><li>Mouw, J. K., Ou, G., Weaver, V. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extracellular+matrix+assembly:+a+multiscale+deconstruction.">Extracellular matrix assembly: a multiscale deconstruction.</a> Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 15 (12), (2014).</li><li>Hynes, R. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+extracellular+matrix:+not+just+pretty+fibrils.">The extracellular matrix: not just pretty fibrils.</a> Science. 326 (5957), 1216-1219 (2009).</li><li>Bonnans, C., Chou, J., Werb, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Remodelling+the+extracellular+matrix+in+development+and+disease.">Remodelling the extracellular matrix in development and disease.</a> Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 15 (12), 786-801 (2014).</li><li>Dvir, T., Timko, B. P., Kohane, D. S., Langer, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nanotechnological+strategies+for+engineering+complex+tissues.">Nanotechnological strategies for engineering complex tissues.</a> Nat Nanotechnol. 6 (1), 13-22 (2011).</li><li>Wilson, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+extracellular+matrix:+an+underexplored+but+important+proteome.">The extracellular matrix: an underexplored but important proteome.</a> Expert Rev Proteomics. 7 (6), 803-806 (2010).</li><li>Naba, A., Hoersch, S., Hynes, R. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Towards+definition+of+an+ECM+parts+list:+an+advance+on+GO+categories.">Towards definition of an ECM parts list: an advance on GO categories.</a> Matrix Biol. 31 (7-8), 371-372 (2012).</li><li>Naba, A., Clauser, K. R., Hoersch, S., Liu, H., Carr, S. A., Hynes, R. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+matrisome:+in+silico+definition+and+in+vivo.+characterization+by+proteomics+of+normal+and+tumor+extracellular+matrices.">The matrisome: in silico definition and in vivo. characterization by proteomics of normal and tumor extracellular matrices.</a> Mol. Cell Proteomics. 11 (4), M111.014647 (2012).</li><li>Naba, A., Clauser, K. R., Whittaker, C. A., Carr, S. A., Tanabe, K. K., Hynes, R. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extracellular+matrix+signatures+of+human+primary+metastatic+colon+cancers+and+their+metastases+to+liver.">Extracellular matrix signatures of human primary metastatic colon cancers and their metastases to liver.</a> BMC Cancer. 14 (1), 518 (2014).</li><li>Naba, A., Clauser, K. R., Lamar, J. M., Carr, S. A., Hynes, R. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extracellular+matrix+signatures+of+human+mammary+carcinoma+identify+novel+metastasis+promoters.">Extracellular matrix signatures of human mammary carcinoma identify novel metastasis promoters.</a> eLife. 3, e01308 (2014).</li><li>Naba, A., Ding, H., Whittaker, C. A., Hynes, R. O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proteomic+analysis+of+altered+extracellular+matrix+turnover+in+bleomycin-induced+pulmonary+fibrosis.">Proteomic analysis of altered extracellular matrix turnover in bleomycin-induced pulmonary fibrosis.</a> Mol. Cell Proteomics. 13 (7), 1741-1752 (2014).</li><li>Tsuchiya, T., Balestrini, J. L., Mendez, J. J., Calle, E. A., Zhao, L., Niklason, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Influence+of+pH+on+extracellular+matrix+preservation+during+lung+decellularization.">Influence of pH on extracellular matrix preservation during lung decellularization.</a> Tissue Eng Part C Methods. 20 (12), 1028-1036 (2014).</li><li>Byron, A., Humphries, J. D., Humphries, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Defining+the+extracellular+matrix+using+proteomics.">Defining the extracellular matrix using proteomics.</a> Int J Exp Pathol. 94 (2), 75-92 (2013).</li><li>Wilson, R., Diseberg, A. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comprehensive+profiling+of+cartilage+extracellular+matrix+formation+and+maturation+using+sequential+extraction+and+label-free+quantitative+proteomics.">Comprehensive profiling of cartilage extracellular matrix formation and maturation using sequential extraction and label-free quantitative proteomics.</a> Mol. Cell Proteomics. 9 (6), 1296-1313 (2010).</li><li>Belluoccio, D., Wilson, R., Thornton, D. J., Wallis, T. P., Gorman, J. J., Bateman, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proteomic+analysis+of+mouse+growth+plate+cartilage.">Proteomic analysis of mouse growth plate cartilage.</a> Proteomics. 6 (24), 6549-6553 (2006).</li><li>Barallobre-Barreiro, J., Didangelos, A., Yin, X., Dom&#233;nech, N., Mayr, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+sequential+extraction+methodology+for+cardiac+extracellular+matrix+prior+to+proteomics+analysis.+In.">A sequential extraction methodology for cardiac extracellular matrix prior to proteomics analysis. In.</a> Heart Proteomics: Methods and Protocols. 1005, 215-223 (2013).</li><li>Hansen, K. C., Kiemele, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+in-solution+ultrasonication-assisted+digestion+method+for+improved+extracellular+matrix+proteome+coverage.">An in-solution ultrasonication-assisted digestion method for improved extracellular matrix proteome coverage.</a> Mol. Cell Proteomics. 8 (7), 1648-1657 (2009).</li><li>Didangelos, A., Yin, X., Mandal, K., Baumert, M., Jahangiri, M., Mayr, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proteomics+characterization+of+extracellular+space+components+in+the+human+aorta.">Proteomics characterization of extracellular space components in the human aorta.</a> Mol. Cell Proteomics. 9 (9), 2048-2062 (2010).</li><li>Lennon, R., Byron, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Global+analysis+reveals+the+complexity+of+the+human+glomerular+extracellular+matrix.">Global analysis reveals the complexity of the human glomerular extracellular matrix.</a> J. Am. Soc. Nephrol. 25 (5), 939-951 (2014).</li></ol>

The authors declare that they have no competing financial interests.

التعديلات على الرغم من أننا يعمل هذا الإجراء المحدد لإثراء ECM من عشرة الأنسجة وأنواع الأورام 8-10، ينبغي النظر في إدخال تعديلات على بروتوكول في الحالات التالية: 1) الكشف عن البروتينات ECM في الكسور وسيطة. قد تختلف مصفوفات خارج الخلية من الأنسجة المختلفة أو أنواع الأورام في هم الاستخلاصية / الذوبان، كما نوقش أعلاه لفبرونيكتين وlaminins. على سبيل المثال، يعتقد أن ECM من أنسجة متليفة أو الأنسجة إعادة عرض يقلب حيوي للغاية، وبالتالي يمكن للمرء أن يلاحظ ارتفاع نسبة البروتينات ECM في تلك الأنسجة إلى أن تكون أكثر للاستخراج 12 بسهولة. اعتمادا على جزء التي يتم فيها الكشف عن البروتينات ECM، نقترح تخفيض فترة حضانة الخطوة مما تسبب في استخراج البروتينات ECM أو حذف تلك الخطوة. 2) Detection من نسبة كبيرة من مكونات الخلايا في بيليه التخصيب ECM. في بعض الأنسجة أو أنواع الأورام الخلايا نسبة: ECM هي مرتفعة بشكل خاص (الأورام على سبيل المثال، الكبد، الطحال، غير صلدة). في هذه الحالة، تلوث كبير من الكسر التخصيب ECM من البروتينات داخل الخلايا (خاصة البروتينات هيكل الخلية و / أو الهستونات) ويمكن ملاحظة. في استنزاف البروتينات داخل الخلايا بشكل فعال، فإننا نقترح تكرار مرتين حضانة في مخزن M و / أو عازلة CS (سواء المنظفات التي تحتوي على هذا يستنزف عادة البروتينات داخل الخلايا وفيرة). وثمة بديل آخر يتمثل في استخدام المخازن بديلة مع تركيز المنظفات العليا، مع التحذير من أن ذلك قد يؤدي إلى استنزاف البروتينات ECM أكثر قابلية للذوبان نسبيا وكذلك (انظر الفقرة التالية). 3) البديل لاستخدام عدة التجارية. كنا قادرين، لأسباب الملكية، للحصول على التركيب الدقيق للمخازن جيئة وذهابام المورد من المجزئ عدة استخراج البروتين. ومع ذلك، أدرجنا في الجدول الملاحظات 1 بناء على تجربتنا الخاصة باستخدام مخازن محلية الصنع مع المنظفات محددة (NP-40، deoxycholate الصوديوم وSDS) تركيزات لإجراء عمليات الاستخراج مماثلة. أبرزت دراسة حديثة أيضا على أهمية الرقم الهيدروجيني للمخازن decellularization للاحتفاظ البروتينات ECM 13. القيود المفروضة على تقنية الطريقة المعروضة هنا تعتمد على حقيقة أن البروتينات ECM هي في جوهرها غير قابلة للذوبان أكثر من معظم البروتينات داخل الخلايا. ومع ذلك، وصفت طريقة decellularization هنا مقتطفات بالتأكيد المكونات القابلة للذوبان الموجودة داخل ECM مثل بعض عوامل النمو أو إنزيمات إعادة عرض ECM. وعلى الرغم من الكشف عن البروتينات المرتبطة ECM بإحكام للبروتينات ECM التي كتبها البروتينات في عينات أعد كما هو موضح، قد تكون هذه الطريقة الصارمة جدا لمحة تماما تكوين المرتبطة matrisomeالبروتينات. أهمية هذه التقنية فيما يتعلق بأساليب أخرى الاستفادة من الطريقة المعروضة هنا خلال وسائل أخرى هي أنه يمكن أن يكون متلائما مع طبيعة ECM من الفائدة: الخطوات الوسيطة يمكن حذف أو تكرار للحيلولة دون فقدان البروتينات ECM أو زيادة استنزاف وتلويث البروتينات داخل الخلايا على التوالي. هذا الأسلوب أيضا يستخدم سوى كميات ضئيلة من المنظفات التي تشطف لمنع التداخل مع إعداد الببتيد لاحق ومطياف الكتلة. وأخيرا، فإن الطريقة الموصوفة هنا لهضم الاستعدادات البروتين ECM الغنية إلى ببتيدات أيضا لديه ميزة لا تتطلب البروتينات لتكون قابلة للذوبان، ويمكن أن تجرى على &quot;الخام&quot; كسور التخصيب ECM. طرق decellularization بديلة باستخدام chaotropes (مثل غوانيدين هيدروكلوريد) لدراسة تكوين موبينيل التي كتبها الطيف الكتلي وبذكرت التابعين في الأدب (إعادة النظر في 14) واستخدمت في تركيبة مع مطياف الكتلة لتحديد تكوين ECM الغضروف 15،16، 17 القلب، الغدة الثديية 18 و 19 و الأوعية الدموية الكبيبي 20 الأغشية الطابق السفلي. توصيات طرق Decellularization توظيف التربسين الهضم خارج الخلايا لا ينبغي ان تستخدم اذا كان يتم إثراء موبينيل لالبروتينات اللاحقة التحليلات، كما trypsinization سيؤدي في الهضم الجزئي ECM وفقدان البروتينات ECM والببتيدات. وبالمثل، إذا كانت كولاجيناز الهضم لاستخدامها لمساعدة اختلال الأنسجة، وأنها تحتاج إلى الرصد الدقيق لأنه يسبب ECM الهضم وفقدان البروتينات ECM والببتيدات. في مقابل حل الهضم في جل؟ البروتينات ECM هي عبر ربط وغير قابلة للذوبان للغاية، وحتى عندما معلق في المخزن 3X Laemmli (التي تحتوي على 6٪ SDS) و100MM DTT، ص منفصلأورلي على المواد الهلامية SDS. وهكذا في جل الهضم ليس الأسلوب المفضل. التطبيقات المستقبلية تجدر الإشارة إلى أنه في حين لم تناقش هنا، ويمكن أيضا أن يتم تحليلها وتكوين كل من الكسور المتوسطة التي تم جمعها خلال decellularization بواسطة مطياف الكتلة. قد يكون هذا قيمة خاصة عند دراسة عينات صغيرة جدا (أي الخزعات الإنسان) أو عند الرغبة المعلومات حول الكسور الخلوية الأخرى.

المصفوفة خارج الخلية (ECM) هي شبكه معقدة من البروتينات عبر ربط والغليكوزيلاتي الذي يوفر الدعم المعماري ومرسى للخلايا ويعرف، في جزء منه، خصائص الأنسجة &quot;النشاط الحيوي 1،2. إشارة البروتينات ECM أيضا على الخلايا إما مباشرة من خلال مستقبلاتها (على سبيل المثال، integrins، syndecans، الخ) أو عن طريق تحوير عامل النمو يشير 3. وبالتالي يوفر ECM العظة الفيزيائية الحيوية والكيميائية الحيوية التي هي المنظمين الرئيسية للعمليات الخلوية مثل انتشار والبقاء، والاستقطاب، والتمايز، والهجرة، الخ وECM يلعب دورا رئيسيا في علم وظائف الأعضاء والتنمية والشيخوخة 4. وعلاوة على ذلك، وتسبب العديد من الأمراض، مثل أمراض القلب والأوعية الدموية، والتليف، وأمراض العضلي والهيكل العظمي، وأمراض السرطان، من قبل، أو يؤدي إلى والتعديلات ECM. وعلاوة على ذلك، يساهم ECM في الحفاظ على محاريب الخلايا الجذعية وتحديد جزيئات ECM الرئيسية عشرفي دعم stemness سيكون التطبيق المباشر في هندسة الأنسجة والطب التجديدي 5. ومع ذلك، على الرغم من أهميتها، ظلت ECM، حتى وقت قريب، اكتشافها بعد 6. في سيليكون وقد كشف التحليل أن matrisome، الذي يعرف بأنه مجموعة متكاملة من ECM والبروتينات المرتبطة ECM، ويضم منتجات من عدة مئات من الجينات في كل من الإنسان والفأر الجينوم 1،7،8. ومع ذلك، فإن الذوبان من البروتينات ECM أعاق توصيف منهجي للتكوين في الجسم الحي مصفوفات خارج الخلية من العينات الطبيعية والمرضية. نحن في الآونة الأخيرة أظهرت أن هذا الذوبان يمكن أن تتحول إلى ميزة ويمكن استخدامها لتخصيب البروتينات ECM 8-10. نحن وغيرنا أثبتت أيضا أن قياس الطيف الكتلي هو الأسلوب المفضل لتوصيف تكوين موبينيل 8-10، 13. نحنهنا وصف الإجراء decellularization التي تتكون من حضانات متتابعة في مخازن درجة الحموضة المختلفة وتركيز الملح والمنظفات. ويؤدي هذا الإجراء في استخراج (أو استنزاف) من عصاري خلوي والطاقة النووية، وغشاء هيكل الخلية البروتينات وإثراء البروتينات ECM. نحن ثم تصف كيفية هضم البروتين الاستعدادات التخصيب ECM في الببتيدات لتحليلها لاحقا من قبل مطياف الكتلة. باستخدام الإجراءات التفصيلية ويتضح هنا، لقد أثرى بنجاح وتتميز قياس الطيف الكتلي مصفوفات خارج الخلية من عشرة الأنسجة المختلفة وأنواع الأورام: سرطان الرئة طبيعية الفئران 8 والبشرية والقولون الفئران 8،9، الكبد البشري 9، وأورام القولون والمستقيم الإنسان والمشتقة الانبثاث الكبد 9، xenografts سرطان الجلد 8، xenografts ورم الثدي 10، الجزر البنكرياسية الفئران وinsulinomas الفئران (النبأ آخرون، غير منشورة). مقارنة بين matrisom مختلفةكشفت وفاق التوقيعات ECM نسيجيا وورم محددة من شأنه أن يزيد أن تستخدم المؤشرات الحيوية التشخيص أو النذير المحتملة. ونحن نعتقد أن هذا الإجراء يمكن تطبيقها على عينات أخرى أو مع أي تعديلات طفيفة نسبيا.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td colspan="4">Section 1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue homogenizer: Bullet blender + beads</td>
			<td>Next Advance</td>
			<td>BB24-AU</td>
			<td>http://www.nextadvance.com/api/index.cfm/products.info/c/421/Bullet-Blender</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Compartmental Extraction kit</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>2145</td>
			<td>http://www.emdmillipore.com/US/en/product/Compartment-Protein-Extraction-Kit,MM_NF-2145</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Deoxyribonuclease I</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>DN25</td>
			<td>http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/dn25?lang=en&#38;region=US</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ribonuclease A</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>19101</td>
			<td>http://www.qiagen.com/products/catalog/sample-technologies/dna-sample-technologies/plasmid-dna/rnase-a/</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td colspan="4">Section 3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HPLC-grade water</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>34877</td>
			<td>http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sial/34877?lang=en&#38;region=US</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Urea</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>U4883</td>
			<td>http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/u4883?lang=en&#38;region=US</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dithiotreitol (DTT)</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>20291</td>
			<td>http://www.piercenet.com/product/dithiothreitol-dtt</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium bicarbonate (NH4HCO3)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>9830</td>
			<td>http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/fluka/09830?lang=en&#38;region=US</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Iodoacetamide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A3221</td>
			<td>http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/a3221?lang=en&#38;region=US</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Peptide -N-Glycosidase F (PNGaseF)</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>P0704S</td>
			<td>https://www.neb.com/products/p0704-pngase-f</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Endoproteinase LysC, mass spectrometry-grade&#160;</td>
			<td>Wako</td>
			<td>125-05061</td>
			<td>http://www.wako-chem.co.jp/english/labchem/product/life/Lys-C/index.htm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin, mass spectrometry-grade&#160;</td>
			<td>Promega</td>
			<td>V5111</td>
			<td>https://www.promega.com/products/mass-spectrometry/proteases-and-surfactants/sequencing-grade-modified-trypsin/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trifluoro-acetic Acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T6508</td>
			<td>http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sial/t6508?lang=en&#38;region=US</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetonitrile, mass spectrometry-grade&#160;</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>51101</td>
			<td>http://www.piercenet.com/product/acetonitrile-acn-lc-ms-grade</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Desalting columns: Oasis HLB 1 cc, 10 mg Sorbent per Cartridge</td>
			<td>Waters</td>
			<td>186000383</td>
			<td>http://www.waters.com/waters/partDetail.htm?partNumber=186000383</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

enrichment of extracellular matrix proteins from tissues and digestion into peptides for mass spectrometry analysis

المصفوفة خارج الخلية (ECM) هي شبكه معقدة من البروتينات عبر ربط تقدم العظة الفيزيائية الحيوية والكيميائية الحيوية التي هي المنظمين الرئيسية لتكاثر الخلايا، البقاء على قيد الحياة، والهجرة، وما إلى ذلك ECM يلعب دورا هاما في التنمية والأمراض المتنوعة بما في ذلك أمراض القلب والأوعية الدموية والأمراض العضلي والهيكل العظمي، والتليف والسرطان. وهكذا، واصفا تكوين موبينيل من الأنسجة الطبيعية والمريضة يمكن أن تؤدي إلى التعرف على المؤشرات الحيوية النذير والتشخيص جديدة وأهداف علاجية جديدة محتملة. ومع ذلك، جعلت طبيعة البروتينات ECM (كبيرة الحجم، عبر ربط والمربوطة تساهمي، الغليكوزيلاتي بشكل كبير) التحاليل البيوكيميائية من موبينيل تحديا. للتغلب على هذا التحدي، قمنا بتطوير طريقة لإثراء موبينيل من الأنسجة والأورام الطازجة أو المجمدة التي تستفيد من الذوبان من البروتينات ECM. وصفنا هنا في التفاصيل الإجراء decellularization التي تتكون من أنا متسلسلncubations في مخازن درجة الحموضة المختلفة وتركيز الملح والمنظفات وتكون نتيجتها 1) استخراج داخل الخلايا (عصاري خلوي والطاقة النووية، وغشاء هيكل الخلية) البروتينات و2) إثراء البروتينات ECM. نحن ثم تصف كيفية deglycosylate وهضم البروتين الاستعدادات التخصيب ECM في الببتيدات لتحليلها لاحقا من قبل مطياف الكتلة.

مراقبة جودة الإجراء decellularization كفاءة decellularization يمكن رصدها من خلال تحليل محتوى البروتين في كل جزء لطخة الغربية. الجدول 2 قوائم البروتينات ذات قيمة تشخيصية لتقييم نوعية الإجراء decellularization. ويبين الشكل 2A استخراج كفاءة في الكسور وسيطة من عصاري خلوي (GAPDH )، النووية (الهستونات)، الغشاء (β1 إنتغرين) وهيكل الخلية (الأكتين) البروتينات، في حين لم البروتينات ECM (الكولاجين I) تم الكشف في هذه الكسور (الشكل 2). في المقابل، أثرت بيليه النهائي للبروتينات ECM واستنفدت إلى حد كبير من البروتينات داخل الخلايا (الشكل 2A). الشكل 2B يعرض مرضية استنزاف البروتين داخل الخلايا (لم يتم الكشف عن هيستون في جزء-ECM الغنية)، على الرغم من الأكتين لا يزال من الممكن الكشف عنها في جزء-ECM الغنية واستنزاف أحادى الكولاجين I- واضح الوزن الجزيئي ~ 110 كيلو دالتون، المفترض الموافق الكولاجين المفكك I - يمكن ملاحظتها في جزء CS. نحن أيضا مراقبة روتينية البروتينات ECM إضافية مثل فبرونيكتين و laminin، على الرغم من أنه في بعض الأنسجة هذه المكونات يمكن أن تذوب جزئيا في أجزاء سابقة 10/08. على سبيل المثال، يحدث فبرونيكتين أيضا قابلة للذوبان كما فبرونيكتين البلازما التي لم يتم إدراجها في ECM. نضح من أنسجة قبل استخراج يقلل تركيز البلازما فبرونيكتين ولكن لا يلغي دائما. في بعض الأنسجة، وجدت المرتبطة laminins فضفاضة مع سطح الخلية أو ECM واستخراج ما في بطونها وسيطة. إذا حدث هذا فإنه يمكن معالجتها عن طريق تغيير الظروف استخراج (انظر مناقشة). لاحظ أنه في إثراء البروتينات ECM واستنزاف ما يصاحب ذلك من مكونات الخلايا تقوم على الذوبان النسبي من البروتينات في مخازن مختلفة. عشرهو يختلف بين الأنسجة المختلفة - في بعض الحالات الهستونات والأكتين يتم استخراج بسهولة أكبر مما كانت عليه في الآخرين. نلاحظ أيضا أنه على الرغم من المتوقع أن يتم استخراجها في N جزء (الشكل 2B) الهستونات، فإننا كثيرا ما نلاحظ استنزاف أكثر اكتمالا من الهستونات في M أو CS جزء (الشكل 2A وباء). تركيز الببتيد يدل المتوقع تركيز من الحل الببتيد التي تم الحصول عليها بعد الهضم، والحموضة وتحلية يمكن قياس الطيفي إما عن طريق قياس الامتصاصية من الحل الببتيد باستخدام الطول الموجي 280 نانومتر الموافق التربتوفان، التيروزين، أو باستخدام الطول الموجي 205 نانومتر الموافق الامتصاصية من الببتيد السندات. قمنا بقياس تركيز حلول الببتيد تم الحصول عليها من decellularization ثلاثة الرئتين عينات الفئران (82 ملغ و 100 ملغ و 100 ملغ على التوالي) استعداداتالأحمر بالتوازي والحصول عليها من كل من: 424 نانوغرام / ميكرولتر، 450 نانوغرام / ميكرولتر، و 580 نانوغرام / ميكرولتر من الببتيدات على التوالي. تحديد الببتيدات ECM التي كتبها الطيف الكتلي التحليل الطيفي الشامل لتكوين عينات البروتين التخصيب ECM، أعد كما هو موضح هنا، أن&gt; 70٪ من كثافة إشارة يناظر ECM والبروتينات المرتبطة ECM 10/08. الجدول 1. حجم الكواشف من المجزئ استخراج عدة لdecellularize 100 ملغ (الوزن الرطب) من الأنسجة أو الورم. يسرد هذا الجدول تكوين وحجم كل العازلة المستخدمة لإجراء decellularization من 100 ملغ من الأنسجة أو الورم. ويرد مزيج من مثبطات الأنزيم البروتيني كحل 50X ويحتاج إلى أن تضاف إلى كل العازلة 2. <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> الكواشف من حجرة البروتين استخراج كيت </td><td> حجم 100 ملغ من الأنسجة </td><td> تكوين (على أساس ميليبور رقة القط # 2145 1) </td></tr><tr><td> عازلة C </td><td> 500 ميكرولتر </td><td> HEPES (الرقم الهيدروجيني 7.9 3)، MgCl 2، بوكل، بتوقيت شرق الولايات المتحدة 4، السكروز، الجلسرين، الصوديوم Orthovanadate 5 </td></tr><tr><td> عازلة W </td><td> 400 ميكرولتر </td><td> HEPES (درجة الحموضة 7.9)، MgCl 2، بوكل، EDTA، السكروز، الجلسرين، Orthovanadate الصوديوم </td></tr><tr><td> عازلة N </td><td> 150 ميكرولتر × 2 </td><td> HEPES (درجة الحموضة 7.9)، MgCl 2، كلوريد الصوديوم، EDTA، الجلسرين، Orthovanadate الصوديوم </td></tr><tr><td> عازلة W </td><td> 400 ميكرولتر </td><td> HEPES (درجة الحموضة 7.9)، MgCl 2، بوكل، EDTA، السكروز، الجلسرين، Orthovanadate الصوديوم </td></tr><tr><td> عازلة M </td><td> 100 ميكرولتر </td><td> HEPES (درجة الحموضة 7.9)، MgCl 2، بوكل، EDTA، السكروز، الجلسرين، deoxycholate الصوديوم (DOC) 6، NP-40 6 </sup&gt;، Orthovanadate الصوديوم </td></tr><tr><td> عازلة CS </td><td> 200 ميكرولتر </td><td> مواسير (درجة الحموضة 6.8)، MgCl 2، كلوريد الصوديوم، EDTA، السكروز، الصوديوم دوديسيل كبريتات (SDS) 7، Orthovanadate الصوديوم </td></tr><tr><td> عازلة C </td><td> 150 ميكرولتر </td><td> HEPES (درجة الحموضة 7.9)، MgCl 2، بوكل، EDTA، السكروز، الجلسرين، Orthovanadate الصوديوم </td></tr><tr><td> برنامج تلفزيوني 1X </td><td> 500 ميكرولتر / غسيل </td><td> - </td></tr></tbody></table> ملاحظات: 1 لأسباب الملكية، وكنا قادرين على الحصول على التركيب الدقيق للمخازن من المورد من هذه المجموعة، ولكننا هنا تشمل بعض الملاحظات بناء على تجربتنا الخاصة باستخدام مخازن محلية الصنع لإجراء عمليات الاستخراج مماثلة. 2 مثبط البروتياز: فإنه من المستحسن لتشمل مجموعة متنوعة من مثبطات ضد السيستين، سيرين وpeptidases ثريونين، esterases سيرين، metalloproteinases تعتمد على الموجبة ثنائي التكافؤ الخوجود العديد من المتاحة تجاريا الكوكتيلات مثبط البروتياز. 3 درجة الحموضة فوق 7.0 هو مثبط البروتياز الفعال للالليزوزومية. 4 EDTA (تستخدم عادة في 2 ملم) هو المانع الفعال للالبروتياز التي تعتمد على الموجبة ثنائي التكافؤ. 5 orthovanadate الصوديوم هو المانع الفوسفاتيز. ومن شأن التركيز الفعال نموذجي يكون 0،5-5 ملم. 6 NP40 عند 0.1٪ -0.5٪ غير كافية لإذابة الدهون أكثر الغشاء. الجمع بين NP40 وDOC - غالبا ما تستخدم في تركيزات متساوية (على سبيل المثال، 0.5٪ لكل منهما) - كثيرا ما يستخدم باعتباره استخراج أكثر صرامة التي لا تزال تترك العديد من تفاعلات البروتين البروتين سليمة. 7 SDS هو المنظفات الأيونية أكثر صرامة (CMC 0.1٪). ويمكن أيضا أن تستخدم في تركيبة مع الأخريين المنظفات SDS / NP40 / DOC 0.1 / 0.5 / 0.5٪ حيث وجود مخزن مؤقت صرامة وسيطة. الجدول 2. البروتينات التشخيص لمراقبة جودة الإجراء decellularization. يسرد هذا الجدول أمثلة من البروتينات التي هي خصائص كل مقصورة التحت خلوية (العصارة الخلوية، نواة، غشاء البلازما، والهيكل الخلوي وECM) التي يمكن استخدامها لمراقبة نوعية الإجراء decellularization وكفاءة ECM-التخصيب. <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> بين الخلايا مقصورة </td><td> البروتينات التشخيصية </td></tr><tr><td> البروتينات عصاري خلوي </td><td> نازعة غليسيرألدهيد 3-فوسفات (GAPDH) </td></tr><tr><td> البروتينات النووية </td><td> الهستونات، Lamins، Nucleoporin </td></tr><tr><td> بروتينات الغشاء </td><td> Integrins، ترانسفيرين مستقبلات </td></tr><tr><td> البروتينات هيكل الخلية </td><td> الأكتين، تويولين، Vimentin </td></tr><tr><td> الغشاء القاعدي البروتينات ECM </td><td> الكولاجين IV، Nidogens، Laminins </td></tr><tr><td> البروتينات ECM الخلالي (فراغي) </td><td> أنا الكولاجين، الكولاجين الثالث، الكولاجين VI، فيبرونكتين] </td></tr></tbody></table> للتوصية على الأجسام المضادة، راجع منشوراتنا 10/08. الجدول 3. حجم الكواشف لهضم عينات التخصيب ECM في الببتيدات. يسرد هذا الجدول الكواشف المستخدمة ل resuspend عينات البروتين التخصيب ECM والحد، يؤلكل، deglycosylate وهضم البروتينات العينات في الببتيدات قبل تحليل الطيف الكتلي. <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> الكواشف </td><td> إعداد </td><td> نهائي تركيز / المبلغ المتعلق بيليه 1 مم سميكة (~ 5-10 الوزن الجاف ملغ) </td><td> حجم لبيليه 1 مم سميكة (~ 5-10 الوزن الجاف ملغ) </td></tr><tr><td> بيكربونات الأمونيوم (NH 4 HCO 3) </td><td> 100 ملي حل في الماء HPLC الصف </td><td> - </td><td> - </td></tr><tr><td> اليوريا </td><td> 8 M حل في 100 ملي بيكربونات الأمونيوم </td><td> 8 M </td><td> 50 ميكرولتر </td></tr><tr><td> Dithiothreitol </td><td> إعادة في الماء HPLC الصف في 500 ملي </td><td> 10 ملي </td><td> 1 ميكرولتر </td></tr><tr><td> Iodoacetamide </td><td> إعادة في الماء HPLC الصف في 500 ملي </td><td> 25 ملي </td><td> 2.5 ميكرولتر </td></tr><tr><td> Peptide- N -Glycosidase F (PNGaseF) </td><td> حل تجاري في 500 U / ميكرولتر </td><td> 1000 U </td><td> 2 ميكرولتر </td></tr><tr><td> Endoproteinase LysC، الكتلة الطيفي الصف </td><td> إعادة في الماء HPLC الصف عند 0.5 ميكروغرام / ميكرولتر </td><td> 1 ميكروغرام </td><td> 2 ميكرولتر </td></tr><tr><td> التربسين، الكتلة الطيفي الصف (الجولة 1) </td><td> الحل التجاري عند 0.5 ميكروغرام / ميكرولتر </td><td> 3 ميكروغرام </td><td> 6 ميكرولتر </td></tr><tr><td> التربسين، الكتلة الطيفي الصف (الجولة 2) </td><td> الحل التجاري عند 0.5 ميكروغرام / ميكرولتر </td><td> 1.5 ميكروغرام </td><td> 3 ميكرولتر </td></tr><tr><td> حمض الخليك Trifluoro-(TFA) </td><td> حل 50٪ في الماء HPLC الصف </td><td> - </td><td> 2-5 ميكرولتر </td></tr><tr><td> الأسيتونتريل (شطف) </td><td> حل 60٪ بنسبة 0.1٪ TFA في الماء HPLC الصف </td><td> - </td><td> 500 ميكرولتر </td></tr><tr><td> الأسيتونتريل (إعادة) </td><td> حل 3٪ مع 0.1٪ TFA في الماء HPLC الصف </td><td> - </td><td> 100 ميكرولتر </td></tr></tbody></table><img alt="الشكل 1" src="/files/ftp_upload/53057/53057fig1highres.jpg" width="600" /> الشكل 1. مخطط إجراء التجارب. سير العمل التخطيطي لprotocoلتر إلى decellularize الأنسجة (القسم 1)، والسيطرة على نوعية decellularization وتقييم تخصيب ECM (القسم 2)، وهضم البروتين عينات التخصيب ECM إلى ببتيدات قبل تحليل الطيف الكتلي (القسم 3). <img alt="الرقم 2" src="/files/ftp_upload/53057/53057fig2highres.jpg" width="500" /> الرقم السيطرة 2. جودة الإجراء decellularization من قبل لطخة غربية أجريت البقع الغربية في الرئة الفئران (A) والثدي البشري سرطان طعم أجنبي (B) العينات باستخدام الأجسام المضادة التالية: أرنب المضادة للالأكتين (استنساخ 14-1) وأرنب المضادة -β1 إنتغرين الأجسام المضادة المنتجة في المختبر لدينا. كنا أرنب مكافحة أنا الكولاجين، والماوس مكافحة GAPDH والأجسام المضادة أرنب المضادة للعموم الهستونات من ميليبور. بعد حضانة الأجسام المضادة الأولية، وكانت تغسل الأغشية والمحتضنة في وجود HRP-مترافق الماعز المضادة للأرنب أو الماعز المضادة للمذكرة التفاهمحد ذاته الأجسام المضادة الثانوية من مختبر جاكسون ImmunoResearch. وأخيرا، تم غسلها أغشية وحضنت في غرب البرق ™ التوهج الكاشف (PERKINELMER LAS). * تشير إلى الحد الأدنى من التلوث هيستون المتبقية من الكسر-ECM الغنية. ** يدل على نضوب الجزئي للأحادى (المفكك المفترض) الكولاجين أنا في جزء CS. *** يدل على تلوث الأكتين المتبقية من الكسر-ECM الغنية. مسحة الكشف مع الأجسام المضادة لمكافحة الكولاجين تمثل مستويات مختلفة من التعديلات بعد متعدية (على سبيل المثال، عبر ربط، بالغليكوزيل).

Watch this Scientific Journal Video about Enrichment of Extracellular Matrix Proteins from Tissues and Digestion into Peptides for Mass Spectrometry Analysis at JoVE.com

Enrichment of Extracellular Matrix Proteins from Tissues and Digestion into Peptides for Mass Spectrometry Analysis

This protocol describes a procedure for enriching ECM proteins from tissues or tumors and deglycosylating and digesting the ECM-enriched preparations into peptides to analyze their protein composition by mass spectrometry.

إثراء خارج الخلية مصفوفة البروتينات من الأنسجة والهضم في الببتيدات لتحليل الطيف الكتلي

The extracellular matrix (ECM) is a complex meshwork of cross-linked proteins that provides biophysical and biochemical cues that are major regulators of ...

enrichment-extracellular-matrix-proteins-from-tissues-digestion-into

Research

JoVE Journal

Biology

26.6K Views.  Massachusetts Institute of Technology. This protocol describes a procedure for enriching ECM proteins from tissues or tumors and deglycosylating and digesting the ECM-enriched preparations into peptides to analyze their protein composition by mass spectrometry. 

Video: Enrichment of Extracellular Matrix Proteins from Tissues and Digestion into Peptides for Mass Spectrometry Analysis

MALDI Sample Preparation: the Ultra Thin Layer Method

This video demonstrates the preparation of an ultra-thin matrix/analyte layer for analyzing peptides and proteins by Matrix-Assisted Laser Desorption Ionization Mass Spectrometry (MALDI-MS) 1,2. The ultra-thin layer method involves the production of a substrate layer of matrix crystals (alpha-cyano-4-hydroxycinnamic acid) on the sample plate, which serves as a seeding ground for subsequent crystallization of a matrix/analyte mixture. Advantages of the ultra-thin layer method over other sample deposition approaches (e.g. dried droplet) are that it provides (i) greater tolerance to impurities such as salts and detergents, (ii) better resolution, and (iii) higher spatial uniformity. This method is especially useful for the accurate mass determination of proteins. The protocol was initially developed and optimized for the analysis of membrane proteins and used to successfully analyze ion channels, metabolite transporters, and receptors, containing between 2 and 12 transmembrane domains 2. Since the original publication, it has also shown to be equally useful for the analysis of soluble proteins. Indeed, we have used it for a large number of proteins having a wide range of properties, including those with molecular masses as high as 380 kDa 3. It is currently our method of choice for the molecular mass analysis of all proteins. The described procedure consistently produces high-quality spectra, and it is sensitive, robust, and easy to implement.

This video demonstrates the preparation of an ultra-thin matrix/analyte layer for analyzing peptides and proteins by Matrix-Assisted Laser Desorption Ionization Mass Spectrometry (MALDI-MS).

MALDI تحضير العينة : الترا أسلوب طبقة رقيقة

This video demonstrates the preparation of an ultra-thin matrix/analyte layer for analyzing peptides and proteins by Matrix-Assisted Laser Desorption ...

T-wave Ion Mobility-mass Spectrometry: Basic Experimental Procedures for Protein Complex Analysis

Ion mobility (IM) is a method that measures the time taken for an ion to travel through a pressurized cell under the influence of a weak electric field. The speed by which the ions traverse the drift region depends on their size: large ions will experience a greater number of collisions with the background inert gas (usually N2) and thus travel more slowly through the IM device than those ions that comprise a smaller cross-section. In general, the time it takes for the ions to migrate though the dense gas phase separates them, according to their collision cross-section (&Omega;). 
Recently, IM spectrometry was coupled with mass spectrometry and a traveling-wave (T-wave) Synapt ion mobility mass spectrometer (IM-MS) was released. Integrating mass spectrometry with ion mobility enables an extra dimension of sample separation and definition, yielding a three-dimensional spectrum (mass to charge, intensity, and drift time). This separation technique allows the spectral overlap to decrease, and enables resolution of heterogeneous complexes with very similar mass, or mass-to-charge ratios, but different drift times. Moreover, the drift time measurements provide an important layer of structural information, as &Omega; is related to the overall shape and topology of the ion. The correlation between the measured drift time values and &Omega; is calculated using a calibration curve generated from calibrant proteins with defined cross-sections1.
The power of the IM-MS approach lies in its ability to define the subunit packing and overall shape of protein assemblies at micromolar concentrations, and near-physiological conditions1. Several recent IM studies of both individual proteins2,3 and non-covalent protein complexes4-9, successfully demonstrated that protein quaternary structure is maintained in the gas phase, and highlighted the potential of this approach in the study of protein assemblies of unknown geometry. Here, we provide a detailed description of IMS-MS analysis of protein complexes using the Synapt (Quadrupole-Ion Mobility-Time-of-Flight) HDMS instrument (Waters Ltd; the only commercial IM-MS instrument currently available)10. We describe the basic optimization steps, the calibration of collision cross-sections, and methods for data processing and interpretation. The final step of the protocol discusses methods for calculating theoretical &Omega; values. Overall, the protocol does not attempt to cover every aspect of IM-MS characterization of protein assemblies; rather, its goal is to introduce the practical aspects of the method to new researchers in the field.

Ion mobility-mass spectrometry is an emerging gas-phase technology that separates ions, based on their collision cross-section and mass. The method provides three-dimensional information on the overall topology and shape of protein complexes. Here, we outline a basic procedure for instrument setting and optimization, calibration of drift times, and data interpretation.

تي موجة ايون التنقل الكتلة الطيفي : الإجراءات التجريبية الأساسية لتحليل البروتين مجمع

Ion mobility (IM) is a method that measures the time taken for an ion to travel through a pressurized cell under the influence of a weak electric field. ...

Atmospheric-pressure Molecular Imaging of Biological Tissues and Biofilms by LAESI Mass Spectrometry

Ambient ionization methods in mass spectrometry allow analytical investigations to be performed directly on a tissue or biofilm under native-like experimental conditions. Laser ablation electrospray ionization (LAESI) is one such development and is particularly well-suited for the investigation of water-containing specimens. LAESI utilizes a mid-infrared laser beam (2.94 &mu;m wavelength) to excite the water molecules of the sample. When the ablation fluence threshold is exceeded, the sample material is expelled in the form of particulate matter and these projectiles travel to tens of millimeters above the sample surface. In LAESI, this ablation plume is intercepted by highly charged droplets to capture a fraction of the ejected sample material and convert its chemical constituents into gas-phase ions. A mass spectrometer equipped with an atmospheric-pressure ion source interface is employed to analyze and record the composition of the released ions originating from the probed area (pixel) of the sample. A systematic interrogation over an array of pixels opens a way for molecular imaging in the microprobe analysis mode. A unique aspect of LAESI mass spectrometric imaging is depth profiling that, in combination with lateral imaging, enables three-dimensional (3D) molecular imaging. With current lateral and depth resolutions of ~100 &mu;m and ~40 &mu;m, respectively, LAESI mass spectrometric imaging helps to explore the molecular structure of biological tissues. Herein, we review the major elements of a LAESI system and provide guidelines for a successful imaging experiment.

Laser ablation electrospray ionization (LAESI) is an atmospheric-pressure ion source for mass spectrometry. In the imaging mode, a mid-infrared laser probes the distributions of molecules across a tissue section or a biofilm. This technique presents a new approach for diverse bioanalytical studies carried out under native experimental conditions.

الضغط الجوي التصوير الجزيئي من الأنسجة البيولوجية والأغشية الحيوية التي LAESI طيف الكتلة

Ambient ionization methods in mass spectrometry allow analytical investigations to be performed directly on a tissue or biofilm under native-like ...

Direct Analysis of Single Cells by Mass Spectrometry at Atmospheric Pressure

Analysis of biochemicals in single cells is important for understanding cell metabolism, cell cycle, adaptation, disease states, etc. Even the same cell types exhibit heterogeneous biochemical makeup depending on their physiological conditions and interactions with the environment. Conventional methods of mass spectrometry (MS) used for the analysis of biomolecules in single cells rely on extensive sample preparation. Removing the cells from their natural environment and extensive sample processing could lead to changes in the cellular composition. Ambient ionization methods enable the analysis of samples in their native environment and without extensive sample preparation.1 The techniques based on the mid infrared (mid-IR) laser ablation of biological materials at 2.94 &mu;m wavelength utilize the sudden excitation of water that results in phase explosion.2 Ambient ionization techniques based on mid-IR laser radiation, such as laser ablation electrospray ionization (LAESI) and atmospheric pressure infrared matrix-assisted laser desorption ionization (AP IR-MALDI), have successfully demonstrated the ability to directly analyze water-rich tissues and biofluids at atmospheric pressure.3-11 In LAESI the mid-IR laser ablation plume that mostly consists of neutral particulate matter from the sample coalesces with highly charged electrospray droplets to produce ions. Recently, mid-IR ablation of single cells was performed by delivering the mid-IR radiation through an etched fiber. The plume generated from this ablation was postionized by an electrospray enabling the analysis of diverse metabolites in single cells by LAESI-MS.12 This article describes the detailed protocol for single cell analysis using LAESI-MS. The presented video demonstrates the analysis of a single epidermal cell from the skin of an Allium cepa bulb. The schematic of the system is shown in Figure 1. A representative example of single cell ablation and a LAESI mass spectrum from the cell are provided in Figure 2.

Single cell analysis is performed by mass spectrometry on plant and animal cells at atmospheric pressure by using a sharpened optical fiber to sample the cells for laser ablation electrospray ionization (LAESI) mass spectrometry.

التحليل المباشر للخلايا واحدة بواسطة الطيف الكتلي في الضغط الجوي

Analysis of biochemicals in single cells is important for understanding cell metabolism, cell cycle, adaptation, disease states, etc. Even the same cell ...

Quantification of Proteins Using Peptide Immunoaffinity Enrichment Coupled with Mass Spectrometry

There is a great need for quantitative assays in measuring proteins. Traditional sandwich immunoassays, largely considered the gold standard in quantitation, are associated with a high cost, long lead time, and are fraught with drawbacks (e.g. heterophilic antibodies, autoantibody interference, 'hook-effect').1 An alternative technique is affinity enrichment of peptides coupled with quantitative mass spectrometry, commonly referred to as SISCAPA (Stable Isotope Standards and Capture by Anti-Peptide Antibodies).2 In this technique, affinity enrichment of peptides with stable isotope dilution and detection by selected/multiple reaction monitoring mass spectrometry (SRM/MRM-MS) provides quantitative measurement of peptides as surrogates for their respective proteins. SRM/MRM-MS is well established for accurate quantitation of small molecules 3, 4 and more recently has been adapted to measure the concentrations of proteins in plasma and cell lysates.5-7 To achieve quantitation of proteins, these larger molecules are digested to component peptides using an enzyme such as trypsin. One or more selected peptides whose sequence is unique to the target protein in that species (i.e. "proteotypic" peptides) are then enriched from the sample using anti-peptide antibodies and measured as quantitative stoichiometric surrogates for protein concentration in the sample. Hence, coupled to stable isotope dilution (SID) methods (i.e. a spiked-in stable isotope labeled peptide standard), SRM/MRM can be used to measure concentrations of proteotypic peptides as surrogates for quantification of proteins in complex biological matrices. The assays have several advantages compared to traditional immunoassays. The reagents are relatively less expensive to generate, the specificity for the analyte is excellent, the assays can be highly multiplexed, enrichment can be performed from neat plasma (no depletion required), and the technique is amenable to a wide array of proteins or modifications of interest.8-13 In this video we demonstrate the basic protocol as adapted to a magnetic bead platform.

Stable Isotope Standards and Capture by Anti-Peptide Antibodies (SISCAPA) couples affinity enrichment of peptides with stable isotope dilution mass spectrometry (MRM-MS) to provide quantitative measurement of peptides as surrogates for their respective proteins. Here we describe the protocol using magnetic particles in a partially automated format.

الكمي من البروتينات عن طريق التخصيب الببتيد Immunoaffinity اقترن الطيف الكتلي

There is a great need for quantitative assays in measuring proteins. Traditional sandwich immunoassays, largely considered the gold standard in ...

Profiling Thiol Redox Proteome Using Isotope Tagging Mass Spectrometry

Pseudomonas syringae pv. tomato strain DC3000 not only causes bacterial speck disease in Solanum lycopersicum but also on Brassica species, as well as on Arabidopsis thaliana, a genetically tractable host plant1,2. The accumulation of reactive oxygen species (ROS) in cotyledons inoculated with DC3000 indicates a role of ROS in modulating necrotic cell death during bacterial speck disease of tomato3. Hydrogen peroxide, a component of ROS, is produced after inoculation of tomato plants with Pseudomonas3. Hydrogen peroxide can be detected using a histochemical stain 3'-3' diaminobenzidine (DAB)4. DAB staining reacts with hydrogen peroxide to produce a brown stain on the leaf tissue4. ROS has a regulatory role of the cellular redox environment, which can change the redox status of certain proteins5. Cysteine is an important amino acid sensitive to redox changes. Under mild oxidation, reversible oxidation of cysteine sulfhydryl groups serves as redox sensors and signal transducers that regulate a variety of physiological processes6,7. Tandem mass tag (TMT) reagents enable concurrent identification and multiplexed quantitation of proteins in different samples using tandem mass spectrometry8,9. The cysteine-reactive TMT (cysTMT) reagents enable selective labeling and relative quantitation of cysteine-containing peptides from up to six biological samples. Each isobaric cysTMT tag has the same nominal parent mass and is composed of a sulfhydryl-reactive group, a MS-neutral spacer arm and an MS/MS reporter10. After labeling, the samples were subject to protease digestion. The cysteine-labeled peptides were enriched using a resin containing anti-TMT antibody. During MS/MS analysis, a series of reporter ions (i.e., 126-131 Da) emerge in the low mass region, providing information on relative quantitation. The workflow is effective for reducing sample complexity, improving dynamic range and studying cysteine modifications. Here we present redox proteomic analysis of the Pst DC3000 treated tomato (Rio Grande) leaves using cysTMT technology. This high-throughput method has the potential to be applied to studying other redox-regulated physiological processes.

Reactive oxygen species level is elevated when cells encounter stress conditions. Here we show the example of 3'-3' diaminobenzidine staining as well as cysTMT labeling and mass spectrometry to profile the redox proteome in Pseudomonas syringae treated tomato leaves.

التنميط بروتيوم الأكسدة والاختزال ثيول استخدام الطيف النظائر كتلة توصيف

Pseudomonas syringae pv. tomato strain DC3000 not only causes bacterial speck disease in Solanum lycopersicum but also on Brassica species, as well as on ...

Complete Workflow for Analysis of Histone Post-translational Modifications Using Bottom-up Mass Spectrometry: From Histone Extraction to Data Analysis

Nucleosomes are the smallest structural unit of chromatin, composed of 147 base pairs of DNA wrapped around an octamer of histone proteins. Histone function is mediated by extensive post-translational modification by a myriad of nuclear proteins. These modifications are critical for nuclear integrity as they regulate chromatin structure and recruit enzymes involved in gene regulation, DNA repair and chromosome condensation. Even though a large part of the scientific community adopts antibody-based techniques to characterize histone PTM abundance, these approaches are low throughput and biased against hypermodified proteins, as the epitope might be obstructed by nearby modifications. This protocol describes the use of nano liquid chromatography (nLC) and mass spectrometry (MS) for accurate quantification of histone modifications. This method is designed to characterize a large variety of histone PTMs and the relative abundance of several histone variants within single analyses. In this protocol, histones are derivatized with propionic anhydride followed by digestion with trypsin to generate peptides of 5 - 20 aa in length. After digestion, the newly exposed N-termini of the histone peptides are derivatized to improve chromatographic retention during nLC-MS. This method allows for the relative quantification of histone PTMs spanning four orders of magnitude.

This protocol outlines a fully integrated workflow for characterizing histone post-translational modifications using mass spectrometry (MS). The workflow includes histone purification from cell cultures or tissues, histone derivatization and digestion, MS analysis using nano-flow liquid chromatography and instructions for data analysis. The protocol is designed for completion within 2 - 3 days.

سير العمل كاملا لتحليل هيستون التعديلات بعد متعدية عن طريق أسفل إلى أعلى الطيف الكتلي: من هيستون استخراج لتحليل البيانات

Nucleosomes are the smallest structural unit of chromatin, composed of 147 base pairs of DNA wrapped around an octamer of histone proteins. Histone ...

A Rapid, Scalable Method for the Isolation, Functional Study, and Analysis of Cell-derived Extracellular Matrix

The extracellular matrix (ECM) is recognized as a diverse, dynamic, and complex environment that is involved in multiple cell-physiological and pathological processes. However, the isolation of ECM, from tissues or cell culture, is complicated by the insoluble and cross-linked nature of the assembled ECM and by the potential contamination of ECM extracts with cell surface and intracellular proteins. Here, we describe a method for use with cultured cells that is rapid and reliably removes cells to isolate a cell-derived ECM for downstream experimentation.
Through use of this method, the isolated ECM and its components can be visualized by in situ immunofluorescence microscopy. The dynamics of specific ECM proteins can be tracked by tracing the deposition of a tagged protein using fluorescence microscopy, both before and after the removal of cells. Alternatively, the isolated ECM can be extracted for biochemical analysis, such as sodium dodecyl sulphate-polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE) and immunoblotting. At larger scales, a full proteomics analysis of the isolated ECM by mass spectrometry can be conducted. By conducting ECM isolation under sterile conditions, sterile ECM layers can be obtained for functional or phenotypic studies with any cell of interest. The method can be applied to any adherent cell type, is relatively easy to perform, and can be linked to a wide repertoire of experimental designs.

The extracellular matrix plays a major role in defining the microenvironment of cells and in modulating cell behavior and phenotype. We describe a rapid method for the isolation of cell-derived extracellular matrix, which can be adapted to different scales for microscopic, biochemical, proteomic, or functional studies.

والسريعة، طريقة قابلة للعزل، دراسة وظيفية، وتحليل المصفوفة خارج الخلية المشتقة من خلية

The extracellular matrix (ECM) is recognized as a diverse, dynamic, and complex environment that is involved in multiple cell-physiological and ...

Isolation of Intact, Whole Mouse Mammary Glands for Analysis of Extracellular Matrix Expression and Gland Morphology

The goal of this procedure was to harvest the #4 abdominal mammary glands from female nulliparous mice in order to assess ECM expression and ductal architecture. Here, a small pocket below the skin was created using Mayo scissors, allowing separation of the glands within the subcutaneous tissue from the underlying peritoneum. Visualization of the glands was aided by the use of 3.5x-R surgical micro loupes. The pelt was inverted and pinned back allowing identification of the intact mammary fat pads. Each of the #4 abdominal glands was bluntly dissected by sliding the scalpel blade laterally between the subcutaneous layer and the glands. Immediately post-harvest, glands were placed in 10% neutral buffered formalin for subsequent tissue processing. Excision of the entire gland is advantageous because it primarily eliminates the risk of excluding important tissue-wide interactions between ductal epithelial cells and other microenvironmental cellular populations that could be missed in a partial biopsy. One drawback of the methodology is the use of serial sections from fixed tissues which limits analyses of ductal morphogenesis and protein expression to discrete locations within the gland. As such, changes in ductal architecture and protein expression in 3 dimensions (3D) is not readily obtainable. Overall, the technique is applicable to studies requiring whole intact murine mammary glands for downstream investigations such as developmental ductal morphogenesis or breast cancer.

Here, we present a protocol for the isolation of whole, intact mouse mammary glands to investigate extracellular matrix (ECM) expression and ductal morphology. Mouse #4 abdominal glands were extracted from 8-10 week old female nulliparous mice, fixed in neutral buffered formalin, sectioned and stained using immunohistochemistry for ECM proteins.

عزل الغدد الثديية الماوس سليمة، وكلها لتحليل التعبير المصفوفة خارج الخلية ومورفولوجية الغدة

The goal of this procedure was to harvest the #4 abdominal mammary glands from female nulliparous mice in order to assess ECM expression and ductal ...

Sample Preparation for Mass-spectrometry-based Proteomics Analysis of Ocular Microvessels

The use of isolated ocular blood vessels in vitro to decipher the pathophysiological state of the eye using advanced technological approaches has greatly expanded our understanding of certain diseases. Mass spectrometry (MS)-based proteomics has emerged as a powerful tool to unravel alterations in the molecular mechanisms and protein signaling pathways in the vascular beds in health and disease. However, sample preparation steps prior to MS analyses are crucial to obtain reproducible results and in-depth elucidation of the complex proteome. This is particularly important for preparation of ocular microvessels, where the amount of sample available for analyses is often limited and thus, poses a challenge for optimum protein extraction. This article endeavors to provide an efficient, rapid and robust protocol for sample preparation from an exemplary retrobulbar ocular vascular bed employing the porcine short posterior ciliary arteries. The present method focuses on protein extraction procedures from both the supernatant and pellet of the sample following homogenization, sample cleaning with centrifugal filter devices prior to one-dimensional gel electrophoresis and peptide purification steps for label-free quantification in a liquid chromatography-electrospray ionization-linear ion trap-Orbitrap MS system. Although this method has been developed specifically for proteomics analyses of ocular microvessels, we have also provided convincing evidence that it can also be readily employed for other tissue-based samples.

Proteome characterization of ocular microvascular beds is pivotal for in-depth understanding of many ocular pathologies in humans. This study demonstrates an effective, rapid, and robust method for protein extraction and sample preparation from small blood vessels employing the porcine short posterior ciliary arteries as model vessels for mass-spectrometry-based proteomics analyses.

إعداد نموذج للإعلام-قياس الطيف الكتلي المستندة البروتيوميات تحليل ميكروفيسيلس العين

The use of isolated ocular blood vessels in vitro to decipher the pathophysiological state of the eye using advanced technological approaches has greatly ...