المؤلفان بالشكر كريس شارتراند ، HT (ASCP) ليدل على المقطع قطع من كتلة الخلية مع علامة AV.

مقدمة : هذا هو شريط فيديو يصف طريقة لإعداد Shidham كتلة خلية من السائل على عينة (LBC) باستخدام الخلايا HistoGelTM (الحرارية العلمية) (HG). بالمقارنة مع النهج العشوائي الأخرى ، وفيما يلي ملامح اثنين حرجة من هذا البروتوكول لإعداد كتل الخلايا من عينات نسبيا قليل الخلايا مع الخلايا فضفاضة منفردة متناثرة (1-5). <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> هذا البروتوكول يتضمن خطوات لتركيز الخلايا على طول الطائرة موازية لسطح القطع من كتلة الخلية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ويشمل أيضا إدراج مثل منارة المظلم من AV - علامة (1B الشكل) ، والتي تخدم اثنين من الأغراض التالية : <ol style="list-style-type:lower-alpha;;text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لتصور المستوى الذي تتركز الخلايا. المنطقة من كتلة الخلايا مع الخلايا التي تهم يمكن الآن تصور من قبل histotechnologist عندما يتعرض منارة داكنة اللون خلال القطع. هذا من شأنه أن يمنع القدرة على رصد واحد من عدة قطاعات من خلال المستوى مع معظم الخلايا ، أو عدم قطع سطحية جدا في المستوى مع أعلى تركيز من الخلايا العينة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لتكون بمثابة نقطة مرجعية محدد في المسلسل المقطع كتلة الخلية على شرائح مختلفة. هذه النقطة المرجعية بمثابة منارة للمساعدة في تحديد الخلايا أو مجموعات معينة من الخلايا لتقييم نمط تفاعلية مناعية تنسيق مع النهج SCIP (6،7). </li></ol></li></ol> بروتوكول (الشكل 2) إعداد العينة. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نقل بقايا خلايا عنق الرحم LBC العينة إلى أنبوب أسفل الزجاج المسطح (15mm X 45mm قطرها) (الشكل 2.1 من خلال 2.4). وضع أنبوب زجاجي في أنبوب من البلاستيك أكبر الناقل (28 × 85mm و) والطرد المركزي. إزالة أنبوب أسفل الزجاج من الانبوب الناقل وتخلصي من طاف. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ومن ثم توج أنبوب زجاجي (لمنع تسرب المياه من التدفئة في الخطوة التالية) ووضعها مرة أخرى داخل أكبر أنبوب من البلاستيك مسطحة القاع الناقل </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وتوج ثم الأنبوب الناقل البلاستيك يحتوي على أنبوب زجاجي ، وضعت في جهاز للطرد المركزي (مع أكواب الدوران وليس أكواب زاوية ثابتة بحيث تقع الخلايا عموديا إلى أسفل شقة من أنبوب زجاجي) ، ونسج في 1805 G (3000 RPMS ، الدوار قطرها - 17cm) لمدة خمس دقائق (الشكل 2.5). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ثم تتم إزالة الأنابيب عموديا من أجهزة الطرد المركزي ويتم إزالة أنبوب أصغر الزجاج مع ملقط من الأنبوب الناقل أكبر من البلاستيك من دون إزعاج بيليه الرسوبية مع الخلايا. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> هو لم يسبق لهم اللعب في أنبوب زجاجي مع العينة ويتم صب قبالة طاف مع الحرص على عدم تعكير صفو طبقة من الخلايا المسطحة الرواسب في قاع (الشكل 2.6). </li></ol> إدراج مرجع تنسيق AV - علامة وبالإضافة إلى ذلك من هلام <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> يضاف منارة الظلام AV - علامة (حوالي 2 مم X مم 2 ، شقة على السطح ، جزء من الظلام المواد الملونة sectionable) (الشكل 3) ومعلما للأنبوب زجاجي (الشكل 2.7). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تسييل an قسامة من قبل نيافة ذوبان في الميكروويف لمدة 10 ثانية في السلطة المتوسط. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة 0.5 مل من نيافة المنصهر الى هذا المزيج ، وأنبوب مع الرواسب بسرعة ، وخلاصة ذلك الشكل (2.8) (انتقل إلى الخطوة التالية بسرعة دون السماح للبدء في ترسيخ HG). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة حوالي 2.5 مل من الحارة (45 درجة مئوية) إلى الناقل للمياه أنابيب بلاستيكية (الشكل 2.9). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> يوضع أصغر أنبوب زجاجي توج داخل أنبوب من البلاستيك مع المياه الدافئة. (هذه الخطوة ضرورية للحفاظ على HG من خلال ترسيخ الخطوات القادمة) (الشكل 2.9). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> يتم وضع أنبوب بلاستيكي الناقل في جهاز الطرد المركزي (مع أكواب الدوران وليس أكواب زاوية ثابتة بحيث تقع الخلايا عموديا إلى أسفل شقة من أنبوب زجاجي) ، ونسج في 1805 G (3000 RPMS ، نصف قطرها 17cm - الدوار) لمدة خمس دقائق. الغرض من هذه الخطوة هو الطرد المركزي لدفع علامة AV - والتركيز على الخلايا في طبقة أقرب إلى سطح القطع من كتلة الخلية النهائية جزءا لا يتجزأ من البارافين (1D الشكل). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ثم تتم إزالة أنابيب بلطف وعموديا من أجهزة الطرد المركزي مع الحرص على عدم تعكير صفو طبقة رقيقة الرسوبية مع عينة الخلايا في الجزء السفلي. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> هو لم يسبق لهم اللعب لأكبر أنبوب من البلاستيك ويتم إزالة أنبوب زجاجي عموديا أصغر بواسطة الملقط دون إزعاج طبقة الرواسب من خلايا العينة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> أنبوب زجاجي صغير المبردة في وضع رأسي لمدة 15 دقائق حتى يبرد ويصلب HG (الشكل 2.11). </li></ol> إزالة كتلة الخلية كزر من هلام مع عينة للتجهيز النهائي <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وطردت القرص HG طدت ، مع طبقة من تتركز / الرواسب في قاع العينة من أنبوب أسفل الزجاج المسطح من خلال دفق الفورمالين 10 ٪ من خلال إبرة قياس 23 مع المحقنة (الشكل 2.12). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> يتم إدخال الإبرة على طول الجانب من الأنبوب في محيط القرص HG طدت مع العينة (الشكل 2.12). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وneedlيتم استدارة ه على طول الجانب من الأنبوب في حين يتم دفع ببطء الفورمالين من خلال حقنة. هذه النتائج في فصل الزر HG مع منارة قاتم اللون وعلامة AV - العينة تتركز في أنه من القاع المسطح من أنبوب زجاجي الشكل (2.12). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ثم يتم وضع كتلة الخلية (زر هلام مع الخلايا عينة) في كاسيت وصفت وقدمت لمعالجة الأنسجة لإعداد كتل البارافين الخلية المدمجة (الشكل 2.13). </li></ol> دمج وقطع العينة <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تم تضمين القرص في البارافين مع الجانب المظلم منارة علامة على النحو سطح القطع (الشكل 1). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> كتلة غير مقطوع حتى علامة داكنة اللون ، كما يتعرض AV منارة واضحة للعيان. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> يتم قطع المقاطع ميكرون ثلاث إلى أربع من هذا المستوى الذي يجب أن يحتوي على أكثر من خلايا منفردة متناثرة من العينة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> يتم جمع المقاطع على الشريحة الزجاجية لمزيد من تلطيخ ، وتلطيخ المناعى ، أو غيرها من التجارب على النحو المبين. قد بروتوكولات لهذه التجارب بما في ذلك نوع من الشرائح لاستخدامها في تركيب أبواب تختلف. عموما لimmunostaining ، تستخدم الشرائح المغلفة لمنع العائمة وفقدان أجزاء من الشرائح خلال الخطوات immunostaining. </li></ol> المختصرات المستخدمة (بالترتيب الأبجدي) : CISH ، مولد اللون اختبارات التهجين في الموقع ، والأسماك ، نيون اختبارات التهجين في الموضع ؛ FFPE ، الفورمالين الثابتة جزءا لا يتجزأ من البرافين ، فارس ، ودفع غرامة إبرة الطموح ؛ HG ، HistoGel ™ (الحرارية العلمية) ؛ LBC ، تقوم الخلايا السائلة ؛ تفاعل البلمرة المتسلسل PCR ؛ <img src="/files/ftp_upload/1316/1382fig1.jpg" alt="الشكل 1" /> الشكل 1. هيكل كتلة الخلية التي أعدتها لبروتوكول Shidham. <img src="/files/ftp_upload/1316/1382fig2.jpg" alt="الشكل 2" /> الشكل 2. موجز من الخطوات المختلفة لإعداد كتلة الخلية من العينة LBC بواسطة بروتوكول Shidham ل. <img src="/files/ftp_upload/1316/1382fig3.jpg" alt="الشكل 3" /> الشكل 3. إعداد AV - علامة من قشور الموز. <img src="/files/ftp_upload/1316/1382fig4.jpg" alt="الشكل 4" /> الشكل 4. مقارنة بين الزنازين ، والمقاطع مع وبدون AV - علامة. <img src="/files/ftp_upload/1316/1382fig5.jpg" alt="الشكل 5" /> الشكل 5. مقارنة الخلوية من أبواب الزنزانات مع وبدون AV - علامة.

<ol>
	<li>Shidham, V. B., Epple, J., Shidham, V. B., Atkinson, B. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chapter+14,+Appendix+I:+Collection+and+processing+of+effusion+fluids+for+cytopathologic+evaluation.">Chapter 14, Appendix I: Collection and processing of effusion fluids for cytopathologic evaluation.</a> Cytopathologic Diagnosis of Serous Fluids. , .</li><li>Varsegi, G., D'Amore, K., Shidham, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=p16INK4a+Immunocytochemistry+as+an+Adjunct+to+Cervical+Cytology+-+Potential+Reflex+Testing+on+Specially+Prepared+Cellblocks+from+Residual+Liquid+Based+Cytology+(LBC)+Specimens.">p16INK4a Immunocytochemistry as an Adjunct to Cervical Cytology - Potential Reflex Testing on Specially Prepared Cellblocks from Residual Liquid Based Cytology (LBC) Specimens.</a> Modern Pathology 22: 98th Annual Meeting of United States and Canadian Academy of Pathology. , 97a-97a (2009).</li><li>Nigro, K., Tynski, Z., Wasman, J., Abdul-Karim, F., Wang, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+cell+block+preparation+methods+for+nongynecologic+ThinPrep+specimens.">Comparison of cell block preparation methods for nongynecologic ThinPrep specimens.</a> Diagn Cytopathol. 35, 640-643 (2007).</li><li>Saleh, H. A., Hammoud, J., Zakaria, R., Khan, A. Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+Thin-Prep+and+cell+block+preparation+for+the+evaluation+of+Thyroid+epithelial+lesions+on+fine+needle+aspiration+biopsy.">Comparison of Thin-Prep and cell block preparation for the evaluation of Thyroid epithelial lesions on fine needle aspiration biopsy.</a> CytoJournal. 5, 3-3 (2008).</li><li>Kyroudi, A., Paefthimiou, M., Symiakaki, H., Mentzelopoulou, P., Voulgaris, Z., Karakitsos, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Increasing+diagnostic+accuracy+with+a+cell+block+preparation+from+thin-layer+endometrial+cytology:+a+feasibility+study.">Increasing diagnostic accuracy with a cell block preparation from thin-layer endometrial cytology: a feasibility study.</a> Acta Cytol. 50, 63-69 (2006).</li><li>Atkinson, B. F., Shidham, V. B., Atkinson, B. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chapter+5:+Immunocytochemistry+of+effusion+fluids:+introduction+to+SCIP+approach+(Chapter+5.">Chapter 5: Immunocytochemistry of effusion fluids: introduction to SCIP approach (Chapter 5.</a> Cytopathologic Diagnosis of Serous Fluids. , (2007).</li><li>Shidham, V. B., Shidham, V. B., Atkinson, B. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chapter+15,+Appendix+II:+Immunocytochemistry+of+effusions+processing+and+commonly+used+immunomarkers.">Chapter 15, Appendix II: Immunocytochemistry of effusions processing and commonly used immunomarkers.</a> Cytopathologic Diagnosis of Serous Fluids. , (2007).</li></ol>

كتل الخلية هي أداة قيمة لتقييم عينات من الخلايا المختلفة (1). الأهم من ذلك ، بالإضافة إلى التفاصيل المعمارية للعينة ، وكتل الخلية تسمح لتقييم دراسات ثانوية مثل كيمياء سيتولوجية مناعية ، فلوري / مولد اللون اختبارات التهجين في الموضع (FISH / CISH) وPCR في الموقع. ووصف مجموعة متنوعة من الأساليب لإعداد كتلة الخلية. ومع ذلك ، فإن معظم هذه هي مناسبة لعينات الخلايا غير الجهاز التناسلي للمرأة والتي تحتوي على العديد من الخلايا نسبيا وmicrofragments مع الأنسجة مثل aspirates FNA وبعض السوائل المصلية مثل الانصبابات (1،3،4،5). لأن كتل الخلايا في المقام الأول توفير الفرصة لتقييم immunocytochemical ، ينبغي تجهيزها يفضل أن يكون مشابهة لتلك الأنسجة الفورمالين الثابتة (FFPE) جزءا لا يتجزأ من البرافين. في النهاية تتم مقارنة النتائج التي تم الحصول عليها بعد تقييم immunocytochemical من أبواب الزنزانات لذوي الكتابات المنشورة في الغالب على أداء الفروع FFPE الأنسجة. أي تعديلات في البروتوكول تسوية محتملة ، وتبطل صحة النتائج التي تم الحصول عليها على معالجتها من خلال كتل الخلية مثبتات مختلفة وتسلسل كاشف أخرى من تلك المستخدمة لFFPE الروتينية. قد تكون بعض التقنيات التجارية لديها عيب في معالجة عن طريق بروتوكول التعرض لتثبيتي التعرض كاشف الأخرى. أساليب مختلفة لإعداد كتلة الخلية متاحة للعينات مع كمية كبيرة من الرواسب وشظايا الأنسجة. أساسا ، ودعمت من قبل بعض الرواسب يتركز جل أو مبدأ التخثر. مضمن ثم الزر المناورة في مثل البارافين بعد تجهيز العينات الأمراض الجراحية / الخزعات. وتشمل المواد الهلامية المستخدمة الجيلاتين ، أجار ، الفيبرينوجين / ثرومبين البلازما ، والمواد الهلامية التجارية الأخرى مثل الزئبق. أساليب تختلف من تركيز التكوير بسيطة من الرواسب بواسطة الطرد المركزي للتركيز على طول خلايا أنواع مختلفة من الأغشية. ومن الأمثلة على ذلك : Milipore ، collodin (سيلويدين) أكياس أو كشط الخلايا من الخلايا مسحات على شرائح زجاجية (1). قمنا بتقييم أيضا مجموعة متنوعة من المواد الهلامية التي تحاول مجموعات مختلفة من أجار والجيلاتين. تحقيق أي من المجموعات والاتساق الشركة بما فيه الكفاية للحصول على القرص المناورة بسهولة من هلام طدت مع الخلايا المدمجة من العينة في قطعة واحدة. وأظهرت HG المناسبة والتناسق في تجربتنا نتائج immunostaining HG على أبواب الزنزانات كانت ممتازة. تقوم خلايا السائل (LBC) لعينات الخلايا العنقية عادة ما تكون أقل الخلوية من غير الجهاز التناسلي للمرأة العينات على النحو المذكور أعلاه. إضافة إلى ذلك ، LBC العينات تحتوي على الجهاز التناسلي للمرأة في الغالب فردية متناثرة تقشر الخلايا السطحية من الغشاء المخاطي العنقية. نتيجة لهذا ، قد لا الخلوية المناسبة داخل أقسام كتلة الخلية يمكن تحقيقه دون اتباع نهج خاص. وهذه منتشرة منفردة المكونات الخلوية في كتلة لا يمكن أن ينظر إليه من قبل histotechnologist خلال قطع الفرع ، لا يمكن أن المستوى الذي تبدأ الخلايا التي تظهر في المقاطع موضع تقدير ، وربما غاب عن أن يكون ، إما عن طريق خفض الماضية على المستوى مع معظم الخلايا أو لا قطع عميقة بما فيه الكفاية في المستوى مع أعلى تركيز من الخلايا العينة (الشكل 4). بروتوكول Shidham عناوين كل من هذه القضايا به نيافة تضمين أجهزة المختبرات والمتوسطة والتقليدية (2) (الشكل 2). هذا البروتوكول يتضمن الملامح الرئيسية التالية اثنين (الشكل 1) : <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> التركيز والمواءمة بين خلايا منفردة متناثرة في الطائرة الضيقة المجاورة وموازية لسطح القطع من كتلة الخلية (الشكل 5). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إدراج مثل منارة الظلام AV - علامة ومعلما. هذا أمر بالغ الأهمية لتحقيق الميزات التالية : <ol style="list-style-type:lower-alpha;;text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تحديد ورصد المستوى الذي تتركز الخلايا في زنزانة ، والتعرض للصوة وقاتم اللون يسلط الضوء على المستوى الذي يتوقع معظم خلايا منفردة متناثرة في كتلة الخلية لتكون موجودة (الشكل 4). وهذا ما يمنع وovercutting (قطع الماضية على المستوى مع معظم الخلايا) أو تضعف (وليس قطع عميق بما فيه الكفاية في المستوى مع أعلى تركيز عينة من الخلايا) في لكتلة الخلايا وتسمح اختيار المقاطع من مستوى في زنزانة مقابلة مع أعلى تركيز من الخلايا. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وصوة داكنة اللون في الفروع أيضا بمثابة نقطة مرجعية لدراسة وتحديد بالضبط نفس الخلايا في أقسام مختلفة من المسلسل كتلة الخلية على الشرائح المختلفة (الشكل 4). هذا أمر بالغ الأهمية ، بينما تفسير وتقييم خصائص تنسيق immunoprofile هذه الخلايا سيما عن طريق نهج SCIP اتباع نفس الخلايا في أقسام مختلفة (6،7). </li></ol></li></ol> على الرغم من أووص البروتوكول الموحد والإبلاغ عن العينات السائلة على خلايا عنق الرحم ، ويمكن أيضا استخدامه لتعزيز الغلة تشخيص العديد من العينات غير الجهاز التناسلي للمرأة الأخرى مثل انصباب السوائل ، جبعة ، brushings ، الخ محتويات الكيس وبالإضافة إلى ذلك علامة AV تسهل تحسين تطبيق نهج SCIP خلال التقييم المناعى من أبواب الزنزانات من هذه العينات. ويمكن الاستعاضة عن تضمين المتوسطة بواسطة كواشف أخرى مع بعض التعديلات المناسبة على الخطوات ذات الصلة. يمكن استبدال HG بواسطة البلازما (الفبرينوجين) أن تبلور بواسطة ثرومبين في درجة حرارة الغرفة (1).

cell block preparation from cytology specimen with predominance of individually scattered cells

هذا الفيديو يوضح طريقة Shidham لإعداد كتل خلية من خلايا السائل على العينات التي تحتوي على الخلايا العنقية متفرقة فرادى وجماعات زنزانة صغيرة. هذا الأسلوب يستخدم HistoGel (الحرارية العلمية) مع المعدات المختبرية التقليدية. استخدام أبواب الزنزانات هو أداة قيمة المساعدة لتقييم الجهاز التناسلي للمرأة غير علم الخلايا. أنها تمكن اختصاصي الباثولوجيا الخلوية لدراسة تفاصيل إضافية عينة المورفولوجي بما في ذلك بنية الآفة. الأهم من ذلك ، فهي تسمح لتقييم دراسات ثانوية مثل كيمياء سيتولوجية مناعية ، واختبارات التهجين في الموضع (FISH / CISH) في الموقع وتفاعل البلمرة المتسلسل (PCR). وقد تم معظمها التقنيات التقليدية لإعداد كتلة الخلية المطبقة على عينات الخلايا غير الجهاز التناسلي للمرأة ، وعادة لالانصبابات السوائل في الجسم والغرامة الخزعات إبرة الطموح. عينات السائل العنقية القائمة على أقل نسبيا من نظرائهم الخلوية غير الجهاز التناسلي للمرأة مع العديد من الخلايا الفردية المتناثرة. وبسبب هذا ، الخلوية كافية داخل زنزانة المقاطع من الصعب تحقيقه. بالإضافة إلى ذلك ، يمكن للكتلة histotechnologist sectioning لا تصور المستوى الذي كانت الخلايا في أعلى تركيز. وبالتالي ، فمن الصعب رصد المستوى المناسب الذي يمكن اختيار المقاطع التي ستنقل إلى الشرائح الزجاجية للاختبار. ونتيجة لذلك ، قد يكون غاب عن المنطقة من كتلة الخلايا مع الخلايا في المصالح ، سواء في الماضي أو عن طريق قطع لا قطع عميقة بما فيه الكفاية. البروتوكول الحالي لأسلوب Shidham عناوين هذه المسائل. على الرغم من هذا البروتوكول هو موحد وذكرت لعينات السائل الجهاز التناسلي للمرأة على الخلايا ، فإنه يمكن أيضا أن تطبق على غير الجهاز التناسلي للمرأة عينات السوائل مثل الانصباب ، جبعة ، brushings ، الخ محتويات الكيس من أجل تحسين نوعية المواد التشخيصية في أقسام كتلة الخلية.

Watch this Scientific Journal Video about Cell Block Preparation from Cytology Specimen with Predominance of Individually Scattered Cells at JoVE.com

Cell Block Preparation from Cytology Specimen with Predominance of Individually Scattered Cells

Shidham في طريقة لإعداد كتل الخلية مع AV - علامة من عينات الخلايا التي تحتوي على خلايا متفرقة فرادى وجماعات زنزانة صغيرة.

خلية إعداد كتلة من العينة مع غلبة علم الخلايا من خلايا منفردة غيوم

This video demonstrates Shidham's method for preparation of cell blocks from liquid based cervicovaginal cytology specimens containing individually ...

cell-block-preparation-from-cytology-specimen-with-predominance

Research

JoVE Journal

Biology

73.0K Views.  University of Wisconsin - Milwaukee. Shidham في طريقة لإعداد كتل الخلية مع AV - علامة من عينات الخلايا التي تحتوي على خلايا متفرقة فرادى وجماعات زنزانة صغيرة.

Video: Cell Block Preparation from Cytology Specimen with Predominance of Individually Scattered Cells

Human ES cells: Starting Culture from Frozen Cells

Here we demonstrate how our lab begins a HuES human embryonic stem cell line culture from a frozen stock.  First, a one to two day old ten cm plate of  approximately one (to two) million irradiated mouse embryonic fibroblast feeder cells is rinsed with HuES media to remove residual serum and cell debris, and then HuES media added and left to equilibrate in the cell culture incubator.  A frozen vial of cells from long term liquid nitrogen storage or a -80C freezer is sourced and quickly submerged in a 37C water bath for quick thawing.  Cells in freezing media are then removed from the vial and placed in a large volume of HuES media.  The large volume of HuES media facilitates removal of excess serum and DMSO, which can cause HuES human embryonic stem cells to differentiate.  Cells are gently spun out of suspension, and then re-suspended in a small volume of fresh HuES media that is then used to seed the MEF plate.  It is considered important to seed the MEF plate by gently adding the HuES cells in a drop wise fashion to evenly disperse them throughout the plate.  The newly established HuES culture plate is returned to the incubator for 48 hrs before media is replaced, then is fed every 24 hours thereafter.

Here we demonstrate how our lab begins a HuES human embryonic stem cell line culture from a frozen stock.

ES خلايا الإنسان : ثقافة ابتداء من خلايا مجمدة

Here we demonstrate how our lab begins a HuES human embryonic stem cell line culture from a frozen stock.  First, a one to two day old ten cm plate of  ...

Derivation of Hematopoietic Stem Cells from Murine Embryonic Stem Cells

A stem cell is defined as a cell with the capacity to both self-renew and generate multiple differentiated progeny.  Embryonic stem cells (ESC) are derived from the blastocyst of the early embryo and are pluripotent in differentiative ability.  Their vast differentiative potential has made them the focus of much research centered on deducing how to coax them to generate clinically useful cell types.  The successful derivation of hematopoietic stem cells (HSC) from mouse ESC has recently been accomplished and can be visualized in this video protocol.  HSC, arguably the most clinically exploited cell population, are used to treat a myriad of hematopoietic malignancies and disorders.  However, many patients that might benefit from HSC therapy lack access to suitable donors.  ESC could provide an alternative source of HSC for these patients.  The following protocol establishes a baseline from which ESC-HSC can be studied and inform efforts to isolate HSC from human ESC.  In this protocol, ESC are differentiated as embryoid bodies (EBs) for 6 days in commercially available serum pre-screened for optimal hematopoietic differentiation.  EBs are then dissociated and infected with retroviral HoxB4.  Infected EB-derived cells are plated on OP9 stroma, a bone marrow stromal cell line derived from the calvaria of  M-CSF-/- mice, and co-cultured in the presence of hematopoiesis promoting cytokines for ten days.  During this co-culture, the infected cells expand greatly, resulting in the generation a heterogeneous pool of 100s of millions of cells.  These cells can then be used to rescue and reconstitute lethally irradiated mice.

This protocol details the derivation of transplantable hematopoietic stem cells from mouse embryonic stem cells (ESC) and their subsequent injection into lethally irradiated recipient mice. Briefly, ESC are differentiated as embryoid bodies, which are then infected with retroviral HoxB4 and co-cultured with OP9 stromal cells and hematopoietic cytokines.

اشتقاق خلايا الجذعية المكونة للدم من الفئران خلايا الجذعية الجنينية

A stem cell is defined as a cell with the capacity to both self-renew and generate multiple differentiated progeny.  Embryonic stem cells (ESC) are ...

Preparation of Neuronal Cultures from Midgastrula Stage Drosophila Embryos

This video illustrates the procedure for making primary neuronal cultures from midgastrula stage Drosophila embryos. The methods for collecting embryos and their dechorionation using bleach are demonstrated. Using a glass pipet attached to a mouth suction tube, we illustrate the removal of all cells from single embryos. The method for dispersing cells from each embyro into a small (5 l) drop of medium on an uncoated glass coverslip is demonstrated. A view through the microscope at 1 hour after plating illustrates the preferred cell density. Most of the cells that survive when grown in defined medium are neuroblasts that divide one or more times in culture before extending neuritic processes by 12-24 hours. A view through the microscope illustrates the level of neurite outgrowth and branching expected in a healthy culture at 2 days in vitro. The cultures are grown in a simple bicarbonate based defined medium, in a 5% CO2 incubator at 22-24&deg;C. Neuritic processes continue to elaborate over the first week in culture and when they make contact with neurites from neighboring cells they often form functional synaptic connections. Neurons in these cultures express voltage-gated sodium, calcium, and potassium channels and are electrically excitable. This culture system is useful for studying molecular genetic and environmental factors that regulate neuronal differentiation, excitability, and synapse formation/function.

This video demonstrates the preparation of primary neuronal cultures from midgastrula stage Drosophila embryos. Views of live cultures show cells 1 hour after plating and differentiated neurons after 2 days of growth in a bicarbonate-based defined medium. The neurons are electrically excitable and form synaptic connections.

التحضير للثقافات متعلق بالخلايا العصبية من أجنة ذبابة الفاكهة المرحلة Midgastrula

This video illustrates the procedure for making primary neuronal cultures from midgastrula stage Drosophila embryos. The methods for collecting embryos ...

Preparation of Single-Cell Suspensions from Mouse Spleen with the gentleMACS Dissociator

Single-cell suspensions are a prerequisite for experiments in cell separation, cell analysis and cell culture.  To avoid tedious and often painful manual dissociations the gentleMACS Dissociator allows one to dissociate tissue very efficiently under controlled and reproducible conditions.  The gentleMACS Dissociator can optimally dissociate mouse spleen, combining timesaving and standardization with user-safety.

This video describes how to dissociate mouse spleens using the gentleMACS Dissociator, an automated bench-top device that can mechanically disrupt tissues using special tubes to produce viable cell suspensions. Following dissociation, spleens are filtered, centrifuged, and resuspended for further applications.

This video describes a simple, time-saving technique for automated tissue dissociation using the gentleMACS Dissociator to prepare single-cell suspensions of mouse splenocytes.

إعداد وحيدة الخلية معلقات من الطحال ماوس مع Dissociator gentleMACS

Single-cell suspensions are a prerequisite for experiments in cell separation, cell analysis and cell culture.  To avoid tedious and often painful manual ...

Preparation of Drosophila S2 cells for Light Microscopy

The ideal experimental system would be cheap and easy to maintain, amenable to a variety of techniques, and would be supported by an extensive literature and genome sequence database. Cultured Drosophila S2 cells, the product of disassociated 20-24 hour old embryos1, possess all these properties. Consequently, S2 cells are extremely well-suited for the analysis of cellular processes, including the discovery of the genes encoding the molecular components of the process or mechanism of interest. The features of S2 cells that are most responsible for their utility are the ease with which they are maintained, their exquisite sensitivity to double-stranded (ds)RNA-mediated interference (RNAi), and their tractability to fluorescence microscopy as either live or fixed cells.
S2 cells can be grown in a variety of media, including a number of inexpensive, commercially-available, fully-defined, serum-free media2. In addition, they grow optimally and quickly at 21-24&deg;C and can be cultured in a variety of containers. Unlike mammalian cells, S2 cells do not require a regulated atmosphere, but instead do well with normal air and can even be maintained in sealed flasks.
Complementing the ease of RNAi in S2 cells is the ability to readily analyze experimentally-induced phenotypes by phase or fluorescence microscopy of fixed or live cells. S2 cells grow in culture as a single monolayer but do not display contact inhibition. Instead, cells tend to grow in colonies in dense cultures. At low density, S2 cultures grown on glass or tissue culture-treated plastic are round and loosely-attached. However, the cytology of S2 cells can be greatly improved by inducing them to flatten extensively by briefly culturing them on a surface coated with the lectin, concanavalin A (ConA)3. S2 cells can also be stably transfected with fluorescently-tagged markers to label structures or organelles of interest in live or fixed cells. Therefore, the usual scenario for the microscopic analysis of cells is this: first, S2 cells (which can possess transgenes to express tagged markers) are treated by RNAi to eliminate a target protein(s). RNAi treatment time can be adjusted to allow for differences in protein turn-over kinetics and to minimize cell trauma/death if the target protein is important for viability. Next, the treated cells are transferred to a dish containing a coverslip pre-coated with conA to induce cells to spread and tightly adhere to the glass. Finally, cells are imaged with the researcher's choice of microscopy modes. S2 cells are particularly good for studies requiring extended visualization of live cells since these cells stay healthy at room temperature and normal atmosphere.

Preparation of Drosophila S2 cells for Light Microscopy

Drosophila Schneider (S2) cells are an increasingly popular system for the discovery and functional analysis of genes. Our goal is to describe some of the microscopic techniques that make S2 cells such an increasingly important experimental system.

إعداد ذبابة الفاكهة خلايا S2 الميكروسكوب لايت

The ideal experimental system would be cheap and easy to maintain, amenable to a variety of techniques, and would be supported by an extensive literature ...

Chromosome Preparation From Cultured Cells

Chromosome (cytogenetic) analysis is widely used for the detection of chromosome instability. When followed by G-banding and molecular techniques such as fluorescence in situ hybridization (FISH), this assay has the powerful ability to analyze individual cells for aberrations that involve gains or losses of portions of the genome&#160;and rearrangements involving one or more chromosomes. In humans, chromosome abnormalities occur in approximately 1 per 160 live births1,2, 60-80% of all miscarriages3,4, 10% of stillbirths2,5, 13% of individuals with congenital heart disease6, 3-6% of infertility cases2, and in many patients with developmental delay&#160;and birth defects7. Cytogenetic analysis of malignancy is routinely used by researchers and clinicians, as observations of clonal chromosomal abnormalities have been shown to have both diagnostic and prognostic significance8,9.&#160; Chromosome isolation is invaluable for gene therapy and stem cell research of organisms including nonhuman primates and rodents10-13.
Chromosomes can be isolated from cells of live tissues, including blood lymphocytes, skin fibroblasts, amniocytes, placenta, bone marrow, and tumor specimens. Chromosomes are analyzed at the metaphase stage of mitosis, when they are most condensed and therefore more clearly visible. The first step of the chromosome isolation technique involves the disruption of the spindle fibers by incubation with Colcemid, to prevent the cells from proceeding to the subsequent anaphase stage. The cells are then treated with a hypotonic solution and preserved in their swollen state with Carnoy&#39;s fixative. The cells are then dropped on to slides and can then be utilized for a variety of procedures. G-banding involves trypsin treatment followed by staining with Giemsa to create characteristic light and dark bands. The same procedure to isolate chromosomes can be used for the preparation of cells for procedures such as fluorescence in situ hybridization (FISH), comparative genomic hybridization (CGH), and spectral karyotyping (SKY)14,15.

Chromosomes can be isolated from live cells such as lymphocytes or skin fibroblasts, and from organisms including humans or mice. These chromosome preparations can be further utilized for routine G-banding and molecular cytogenetic procedures such as fluorescence in situ hybridization (FISH), comparative genomic hybridization (CGH), and spectral karyotyping (SKY).

إعداد كروموسوم من الخلايا المستزرعة

Chromosome (cytogenetic) analysis is widely used for the detection of chromosome instability. When followed by G-banding and molecular techniques such as ...

Efficient Generation Human Induced Pluripotent Stem Cells from Human Somatic Cells with Sendai-virus

A few years ago, the establishment of human induced pluripotent stem cells (iPSCs) ushered in a new era in biomedicine. Potential uses of human iPSCs include modeling pathogenesis of human genetic diseases, autologous cell therapy after gene correction, and personalized drug screening by providing a source of patient-specific and symptom relevant cells. However, there are several hurdles to overcome, such as eliminating the remaining reprogramming factor transgene expression after human iPSCs production. More importantly, residual transgene expression in undifferentiated human iPSCs could hamper proper differentiations and misguide the interpretation of disease-relevant in vitro phenotypes. With this reason, integration-free and/or transgene-free human iPSCs have been developed using several methods, such as adenovirus, the piggyBac system, minicircle vector, episomal vectors, direct protein delivery and synthesized mRNA. However, efficiency of reprogramming using integration-free methods is quite low in most cases.
Here, we present a method to isolate human iPSCs by using Sendai-virus (RNA virus) based reprogramming system. This reprogramming method shows consistent results and high efficiency in cost-effective manner.

Here, we present our established method to reprogram human somatic cells into transgene-free human iPSCs with Sendai virus, which shows consistent outcome and enhanced efficiency.

كفاءة الجيل المستحثة الإنسان افرة القوة الخلايا الجذعية من الخلايا الجسدية البشرية مع سينداي الفيروسات

A few years ago, the establishment of human induced pluripotent stem cells (iPSCs) ushered in a new era in biomedicine. Potential uses of human iPSCs ...

Cryo-electron Microscopy Specimen Preparation By Means Of a Focused Ion Beam

Here we present a protocol used to prepare cryo-TEM samples of Aspergillus niger spores, but which can easily be adapted for any number of microorganisms or solutions. We make use of a custom built cryo-transfer station and a modified cryo-SEM preparation chamber2. The spores are taken from a culture, plunge-frozen in a liquid nitrogen slush and observed in the cryo-SEM to select a region of interest. A thin lamella is then extracted using the FIB, attached to a TEM grid and subsequently thinned to electron transparency. The grid is transferred to a cryo-TEM holder and into a TEM for high resolution studies. Thanks to the introduction of a cooled nanomanipulator tip and a cryo-transfer station, this protocol is a straightforward adaptation to cryogenic temperature of the routinely used FIB preparation of TEM samples. As such it has the advantages of requiring a small amount of modifications to existing instruments, setups and procedures; it is easy to implement; it has a broad range of applications, in principle the same as for cryo-TEM sample preparation. One limitation is that it requires skillful handling of the specimens at critical steps to avoid or minimize contaminations.

Cryo Electron Microscopes, either Scanning (SEM) or Transmission (TEM), are widely used for characterization of biological samples or other materials with a high water content1. A SEM/Focused Ion Beam (FIB) is used to identify features of interest in samples and extract a thin, electron-transparent lamella for transfer to a cryo-TEM.

البرد الإلكترون المجهري عينة التحضير عن طريق المركزة ايون شعاع

Here we present a protocol used to prepare cryo-TEM samples of Aspergillus niger spores, but which can easily be adapted for any number of microorganisms ...

Analysis of Cell Suspensions Isolated from Solid Tissues by Spectral Flow Cytometry

Flow cytometry has been used for the past 40 years to define and analyze the phenotype of lymphoid and other hematopoietic cells. Initially restricted to the analysis of a few fluorochromes, currently there are dozens of different fluorescent dyes, and up to 14-18 different dyes can be combined at a time. However, several limitations still impair the analytical capabilities. Because of the multiplicity of fluorescent probes, data analysis has become increasingly complex due to the need of large, multi-parametric compensation matrices. Moreover, mutant mouse models carrying fluorescent proteins to detect and trace specific cell types in different tissues have become available, so the analysis (by flow cytometry) of auto-fluorescent cell suspensions obtained from solid organs is required. Spectral flow cytometry, which distinguishes the shapes of emission spectra along a wide range of continuous wavelengths, addresses some of these problems. The data is analyzed with an algorithm that replaces compensation matrices and treats auto-fluorescence as an independent parameter. Thus, spectral flow cytometry should be capable of discriminating fluorochromes with similar emission peaks and can provide a multi-parametric analysis without compensation requirements.
This protocol describes the spectral flow cytometry analysis, allowing for a 21-parameter (19 fluorescent probes) characterization and the management of an auto-fluorescent signal, providing high resolution in minor population detection. The results presented here show that spectral flow cytometry presents advantages in the analysis of cell populations from tissues difficult to characterize in conventional flow cytometry, such as the heart and the intestine. Spectral flow cytometry thus demonstrates the multi-parametric analytical capacity of high-performing conventional flow cytometry without the requirement for compensation and enables auto-fluorescence management.

This article describes spectral cytometry, a new approach in flow cytometry that uses the shapes of emission spectra to distinguish fluorochromes. An algorithm replaces compensations and can treat auto-fluorescence as an independent parameter. This new approach allows for the proper analysis of cells isolated from solid organs.

تحليل معلقات خلية معزولة من الأنسجة الصلبة من قبل الطيفي التدفق الخلوي

Flow cytometry has been used for the past 40 years to define and analyze the phenotype of lymphoid and other hematopoietic cells. Initially restricted to ...

Preparation of Adipose Progenitor Cells from Mouse Epididymal Adipose Tissues

Obesity and metabolic disorders such as diabetes, heart disease, and cancer, are all associated with dramatic adipose tissue remodeling. Tissue-resident adipose progenitor cells (APCs) play a key role in adipose tissue homeostasis and can contribute to the tissue pathology. The growing use of single cell analysis technologies &#8211; including single-cell RNA-sequencing and single-cell proteomics &#8211; is transforming the stem/progenitor cell field by permitting unprecedented resolution of individual cell expression changes within the context of population- or tissue-wide changes. In this article, we provide detailed protocols to dissect mouse epididymal adipose tissue, isolate single adipose tissue-derived cells, and perform fluorescence activated cell sorting (FACS) to enrich for viable Sca1+/CD31-/CD45-/Ter119- APCs. These protocols will allow investigators to prepare high quality APCs suitable for downstream analyses such as single cell RNA sequencing.

We present a simple method to isolate highly viable adipose progenitor cells from mouse epididymal fat pads using fluorescence activated cell sorting.

إعداد الخلايا الدهنية بروجينيتور من ماوس Epididymal الأنسجة الدهنية

Obesity and metabolic disorders such as diabetes, heart disease, and cancer, are all associated with dramatic adipose tissue remodeling. Tissue-resident ...