المؤلفان بالشكر كريس شارتراند ، HT (ASCP) ليدل على المقطع قطع من كتلة الخلية مع علامة AV.

مقدمة : هذا هو شريط فيديو يصف طريقة لإعداد Shidham كتلة خلية من السائل على عينة (LBC) باستخدام الخلايا HistoGelTM (الحرارية العلمية) (HG). بالمقارنة مع النهج العشوائي الأخرى ، وفيما يلي ملامح اثنين حرجة من هذا البروتوكول لإعداد كتل الخلايا من عينات نسبيا قليل الخلايا مع الخلايا فضفاضة منفردة متناثرة (1-5). <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> هذا البروتوكول يتضمن خطوات لتركيز الخلايا على طول الطائرة موازية لسطح القطع من كتلة الخلية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ويشمل أيضا إدراج مثل منارة المظلم من AV - علامة (1B الشكل) ، والتي تخدم اثنين من الأغراض التالية : <ol style="list-style-type:lower-alpha;;text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لتصور المستوى الذي تتركز الخلايا. المنطقة من كتلة الخلايا مع الخلايا التي تهم يمكن الآن تصور من قبل histotechnologist عندما يتعرض منارة داكنة اللون خلال القطع. هذا من شأنه أن يمنع القدرة على رصد واحد من عدة قطاعات من خلال المستوى مع معظم الخلايا ، أو عدم قطع سطحية جدا في المستوى مع أعلى تركيز من الخلايا العينة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لتكون بمثابة نقطة مرجعية محدد في المسلسل المقطع كتلة الخلية على شرائح مختلفة. هذه النقطة المرجعية بمثابة منارة للمساعدة في تحديد الخلايا أو مجموعات معينة من الخلايا لتقييم نمط تفاعلية مناعية تنسيق مع النهج SCIP (6،7). </li></ol></li></ol> بروتوكول (الشكل 2) إعداد العينة. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نقل بقايا خلايا عنق الرحم LBC العينة إلى أنبوب أسفل الزجاج المسطح (15mm X 45mm قطرها) (الشكل 2.1 من خلال 2.4). وضع أنبوب زجاجي في أنبوب من البلاستيك أكبر الناقل (28 × 85mm و) والطرد المركزي. إزالة أنبوب أسفل الزجاج من الانبوب الناقل وتخلصي من طاف. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ومن ثم توج أنبوب زجاجي (لمنع تسرب المياه من التدفئة في الخطوة التالية) ووضعها مرة أخرى داخل أكبر أنبوب من البلاستيك مسطحة القاع الناقل </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وتوج ثم الأنبوب الناقل البلاستيك يحتوي على أنبوب زجاجي ، وضعت في جهاز للطرد المركزي (مع أكواب الدوران وليس أكواب زاوية ثابتة بحيث تقع الخلايا عموديا إلى أسفل شقة من أنبوب زجاجي) ، ونسج في 1805 G (3000 RPMS ، الدوار قطرها - 17cm) لمدة خمس دقائق (الشكل 2.5). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ثم تتم إزالة الأنابيب عموديا من أجهزة الطرد المركزي ويتم إزالة أنبوب أصغر الزجاج مع ملقط من الأنبوب الناقل أكبر من البلاستيك من دون إزعاج بيليه الرسوبية مع الخلايا. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> هو لم يسبق لهم اللعب في أنبوب زجاجي مع العينة ويتم صب قبالة طاف مع الحرص على عدم تعكير صفو طبقة من الخلايا المسطحة الرواسب في قاع (الشكل 2.6). </li></ol> إدراج مرجع تنسيق AV - علامة وبالإضافة إلى ذلك من هلام <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> يضاف منارة الظلام AV - علامة (حوالي 2 مم X مم 2 ، شقة على السطح ، جزء من الظلام المواد الملونة sectionable) (الشكل 3) ومعلما للأنبوب زجاجي (الشكل 2.7). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تسييل an قسامة من قبل نيافة ذوبان في الميكروويف لمدة 10 ثانية في السلطة المتوسط. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة 0.5 مل من نيافة المنصهر الى هذا المزيج ، وأنبوب مع الرواسب بسرعة ، وخلاصة ذلك الشكل (2.8) (انتقل إلى الخطوة التالية بسرعة دون السماح للبدء في ترسيخ HG). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة حوالي 2.5 مل من الحارة (45 درجة مئوية) إلى الناقل للمياه أنابيب بلاستيكية (الشكل 2.9). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> يوضع أصغر أنبوب زجاجي توج داخل أنبوب من البلاستيك مع المياه الدافئة. (هذه الخطوة ضرورية للحفاظ على HG من خلال ترسيخ الخطوات القادمة) (الشكل 2.9). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> يتم وضع أنبوب بلاستيكي الناقل في جهاز الطرد المركزي (مع أكواب الدوران وليس أكواب زاوية ثابتة بحيث تقع الخلايا عموديا إلى أسفل شقة من أنبوب زجاجي) ، ونسج في 1805 G (3000 RPMS ، نصف قطرها 17cm - الدوار) لمدة خمس دقائق. الغرض من هذه الخطوة هو الطرد المركزي لدفع علامة AV - والتركيز على الخلايا في طبقة أقرب إلى سطح القطع من كتلة الخلية النهائية جزءا لا يتجزأ من البارافين (1D الشكل). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ثم تتم إزالة أنابيب بلطف وعموديا من أجهزة الطرد المركزي مع الحرص على عدم تعكير صفو طبقة رقيقة الرسوبية مع عينة الخلايا في الجزء السفلي. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> هو لم يسبق لهم اللعب لأكبر أنبوب من البلاستيك ويتم إزالة أنبوب زجاجي عموديا أصغر بواسطة الملقط دون إزعاج طبقة الرواسب من خلايا العينة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> أنبوب زجاجي صغير المبردة في وضع رأسي لمدة 15 دقائق حتى يبرد ويصلب HG (الشكل 2.11). </li></ol> إزالة كتلة الخلية كزر من هلام مع عينة للتجهيز النهائي <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وطردت القرص HG طدت ، مع طبقة من تتركز / الرواسب في قاع العينة من أنبوب أسفل الزجاج المسطح من خلال دفق الفورمالين 10 ٪ من خلال إبرة قياس 23 مع المحقنة (الشكل 2.12). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> يتم إدخال الإبرة على طول الجانب من الأنبوب في محيط القرص HG طدت مع العينة (الشكل 2.12). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وneedlيتم استدارة ه على طول الجانب من الأنبوب في حين يتم دفع ببطء الفورمالين من خلال حقنة. هذه النتائج في فصل الزر HG مع منارة قاتم اللون وعلامة AV - العينة تتركز في أنه من القاع المسطح من أنبوب زجاجي الشكل (2.12). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ثم يتم وضع كتلة الخلية (زر هلام مع الخلايا عينة) في كاسيت وصفت وقدمت لمعالجة الأنسجة لإعداد كتل البارافين الخلية المدمجة (الشكل 2.13). </li></ol> دمج وقطع العينة <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تم تضمين القرص في البارافين مع الجانب المظلم منارة علامة على النحو سطح القطع (الشكل 1). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> كتلة غير مقطوع حتى علامة داكنة اللون ، كما يتعرض AV منارة واضحة للعيان. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> يتم قطع المقاطع ميكرون ثلاث إلى أربع من هذا المستوى الذي يجب أن يحتوي على أكثر من خلايا منفردة متناثرة من العينة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> يتم جمع المقاطع على الشريحة الزجاجية لمزيد من تلطيخ ، وتلطيخ المناعى ، أو غيرها من التجارب على النحو المبين. قد بروتوكولات لهذه التجارب بما في ذلك نوع من الشرائح لاستخدامها في تركيب أبواب تختلف. عموما لimmunostaining ، تستخدم الشرائح المغلفة لمنع العائمة وفقدان أجزاء من الشرائح خلال الخطوات immunostaining. </li></ol> المختصرات المستخدمة (بالترتيب الأبجدي) : CISH ، مولد اللون اختبارات التهجين في الموقع ، والأسماك ، نيون اختبارات التهجين في الموضع ؛ FFPE ، الفورمالين الثابتة جزءا لا يتجزأ من البرافين ، فارس ، ودفع غرامة إبرة الطموح ؛ HG ، HistoGel ™ (الحرارية العلمية) ؛ LBC ، تقوم الخلايا السائلة ؛ تفاعل البلمرة المتسلسل PCR ؛ <img src="/files/ftp_upload/1316/1382fig1.jpg" alt="الشكل 1" /> الشكل 1. هيكل كتلة الخلية التي أعدتها لبروتوكول Shidham. <img src="/files/ftp_upload/1316/1382fig2.jpg" alt="الشكل 2" /> الشكل 2. موجز من الخطوات المختلفة لإعداد كتلة الخلية من العينة LBC بواسطة بروتوكول Shidham ل. <img src="/files/ftp_upload/1316/1382fig3.jpg" alt="الشكل 3" /> الشكل 3. إعداد AV - علامة من قشور الموز. <img src="/files/ftp_upload/1316/1382fig4.jpg" alt="الشكل 4" /> الشكل 4. مقارنة بين الزنازين ، والمقاطع مع وبدون AV - علامة. <img src="/files/ftp_upload/1316/1382fig5.jpg" alt="الشكل 5" /> الشكل 5. مقارنة الخلوية من أبواب الزنزانات مع وبدون AV - علامة.

<ol>
	<li>Shidham, V. B., Epple, J., Shidham, V. B., Atkinson, B. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chapter+14,+Appendix+I:+Collection+and+processing+of+effusion+fluids+for+cytopathologic+evaluation.">Chapter 14, Appendix I: Collection and processing of effusion fluids for cytopathologic evaluation.</a> Cytopathologic Diagnosis of Serous Fluids. , .</li><li>Varsegi, G., D'Amore, K., Shidham, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=p16INK4a+Immunocytochemistry+as+an+Adjunct+to+Cervical+Cytology+-+Potential+Reflex+Testing+on+Specially+Prepared+Cellblocks+from+Residual+Liquid+Based+Cytology+(LBC)+Specimens.">p16INK4a Immunocytochemistry as an Adjunct to Cervical Cytology - Potential Reflex Testing on Specially Prepared Cellblocks from Residual Liquid Based Cytology (LBC) Specimens.</a> Modern Pathology 22: 98th Annual Meeting of United States and Canadian Academy of Pathology. , 97a-97a (2009).</li><li>Nigro, K., Tynski, Z., Wasman, J., Abdul-Karim, F., Wang, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+cell+block+preparation+methods+for+nongynecologic+ThinPrep+specimens.">Comparison of cell block preparation methods for nongynecologic ThinPrep specimens.</a> Diagn Cytopathol. 35, 640-643 (2007).</li><li>Saleh, H. A., Hammoud, J., Zakaria, R., Khan, A. Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+Thin-Prep+and+cell+block+preparation+for+the+evaluation+of+Thyroid+epithelial+lesions+on+fine+needle+aspiration+biopsy.">Comparison of Thin-Prep and cell block preparation for the evaluation of Thyroid epithelial lesions on fine needle aspiration biopsy.</a> CytoJournal. 5, 3-3 (2008).</li><li>Kyroudi, A., Paefthimiou, M., Symiakaki, H., Mentzelopoulou, P., Voulgaris, Z., Karakitsos, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Increasing+diagnostic+accuracy+with+a+cell+block+preparation+from+thin-layer+endometrial+cytology:+a+feasibility+study.">Increasing diagnostic accuracy with a cell block preparation from thin-layer endometrial cytology: a feasibility study.</a> Acta Cytol. 50, 63-69 (2006).</li><li>Atkinson, B. F., Shidham, V. B., Atkinson, B. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chapter+5:+Immunocytochemistry+of+effusion+fluids:+introduction+to+SCIP+approach+(Chapter+5.">Chapter 5: Immunocytochemistry of effusion fluids: introduction to SCIP approach (Chapter 5.</a> Cytopathologic Diagnosis of Serous Fluids. , (2007).</li><li>Shidham, V. B., Shidham, V. B., Atkinson, B. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chapter+15,+Appendix+II:+Immunocytochemistry+of+effusions+processing+and+commonly+used+immunomarkers.">Chapter 15, Appendix II: Immunocytochemistry of effusions processing and commonly used immunomarkers.</a> Cytopathologic Diagnosis of Serous Fluids. , (2007).</li></ol>

كتل الخلية هي أداة قيمة لتقييم عينات من الخلايا المختلفة (1). الأهم من ذلك ، بالإضافة إلى التفاصيل المعمارية للعينة ، وكتل الخلية تسمح لتقييم دراسات ثانوية مثل كيمياء سيتولوجية مناعية ، فلوري / مولد اللون اختبارات التهجين في الموضع (FISH / CISH) وPCR في الموقع. ووصف مجموعة متنوعة من الأساليب لإعداد كتلة الخلية. ومع ذلك ، فإن معظم هذه هي مناسبة لعينات الخلايا غير الجهاز التناسلي للمرأة والتي تحتوي على العديد من الخلايا نسبيا وmicrofragments مع الأنسجة مثل aspirates FNA وبعض السوائل المصلية مثل الانصبابات (1،3،4،5). لأن كتل الخلايا في المقام الأول توفير الفرصة لتقييم immunocytochemical ، ينبغي تجهيزها يفضل أن يكون مشابهة لتلك الأنسجة الفورمالين الثابتة (FFPE) جزءا لا يتجزأ من البرافين. في النهاية تتم مقارنة النتائج التي تم الحصول عليها بعد تقييم immunocytochemical من أبواب الزنزانات لذوي الكتابات المنشورة في الغالب على أداء الفروع FFPE الأنسجة. أي تعديلات في البروتوكول تسوية محتملة ، وتبطل صحة النتائج التي تم الحصول عليها على معالجتها من خلال كتل الخلية مثبتات مختلفة وتسلسل كاشف أخرى من تلك المستخدمة لFFPE الروتينية. قد تكون بعض التقنيات التجارية لديها عيب في معالجة عن طريق بروتوكول التعرض لتثبيتي التعرض كاشف الأخرى. أساليب مختلفة لإعداد كتلة الخلية متاحة للعينات مع كمية كبيرة من الرواسب وشظايا الأنسجة. أساسا ، ودعمت من قبل بعض الرواسب يتركز جل أو مبدأ التخثر. مضمن ثم الزر المناورة في مثل البارافين بعد تجهيز العينات الأمراض الجراحية / الخزعات. وتشمل المواد الهلامية المستخدمة الجيلاتين ، أجار ، الفيبرينوجين / ثرومبين البلازما ، والمواد الهلامية التجارية الأخرى مثل الزئبق. أساليب تختلف من تركيز التكوير بسيطة من الرواسب بواسطة الطرد المركزي للتركيز على طول خلايا أنواع مختلفة من الأغشية. ومن الأمثلة على ذلك : Milipore ، collodin (سيلويدين) أكياس أو كشط الخلايا من الخلايا مسحات على شرائح زجاجية (1). قمنا بتقييم أيضا مجموعة متنوعة من المواد الهلامية التي تحاول مجموعات مختلفة من أجار والجيلاتين. تحقيق أي من المجموعات والاتساق الشركة بما فيه الكفاية للحصول على القرص المناورة بسهولة من هلام طدت مع الخلايا المدمجة من العينة في قطعة واحدة. وأظهرت HG المناسبة والتناسق في تجربتنا نتائج immunostaining HG على أبواب الزنزانات كانت ممتازة. تقوم خلايا السائل (LBC) لعينات الخلايا العنقية عادة ما تكون أقل الخلوية من غير الجهاز التناسلي للمرأة العينات على النحو المذكور أعلاه. إضافة إلى ذلك ، LBC العينات تحتوي على الجهاز التناسلي للمرأة في الغالب فردية متناثرة تقشر الخلايا السطحية من الغشاء المخاطي العنقية. نتيجة لهذا ، قد لا الخلوية المناسبة داخل أقسام كتلة الخلية يمكن تحقيقه دون اتباع نهج خاص. وهذه منتشرة منفردة المكونات الخلوية في كتلة لا يمكن أن ينظر إليه من قبل histotechnologist خلال قطع الفرع ، لا يمكن أن المستوى الذي تبدأ الخلايا التي تظهر في المقاطع موضع تقدير ، وربما غاب عن أن يكون ، إما عن طريق خفض الماضية على المستوى مع معظم الخلايا أو لا قطع عميقة بما فيه الكفاية في المستوى مع أعلى تركيز من الخلايا العينة (الشكل 4). بروتوكول Shidham عناوين كل من هذه القضايا به نيافة تضمين أجهزة المختبرات والمتوسطة والتقليدية (2) (الشكل 2). هذا البروتوكول يتضمن الملامح الرئيسية التالية اثنين (الشكل 1) : <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> التركيز والمواءمة بين خلايا منفردة متناثرة في الطائرة الضيقة المجاورة وموازية لسطح القطع من كتلة الخلية (الشكل 5). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إدراج مثل منارة الظلام AV - علامة ومعلما. هذا أمر بالغ الأهمية لتحقيق الميزات التالية : <ol style="list-style-type:lower-alpha;;text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تحديد ورصد المستوى الذي تتركز الخلايا في زنزانة ، والتعرض للصوة وقاتم اللون يسلط الضوء على المستوى الذي يتوقع معظم خلايا منفردة متناثرة في كتلة الخلية لتكون موجودة (الشكل 4). وهذا ما يمنع وovercutting (قطع الماضية على المستوى مع معظم الخلايا) أو تضعف (وليس قطع عميق بما فيه الكفاية في المستوى مع أعلى تركيز عينة من الخلايا) في لكتلة الخلايا وتسمح اختيار المقاطع من مستوى في زنزانة مقابلة مع أعلى تركيز من الخلايا. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وصوة داكنة اللون في الفروع أيضا بمثابة نقطة مرجعية لدراسة وتحديد بالضبط نفس الخلايا في أقسام مختلفة من المسلسل كتلة الخلية على الشرائح المختلفة (الشكل 4). هذا أمر بالغ الأهمية ، بينما تفسير وتقييم خصائص تنسيق immunoprofile هذه الخلايا سيما عن طريق نهج SCIP اتباع نفس الخلايا في أقسام مختلفة (6،7). </li></ol></li></ol> على الرغم من أووص البروتوكول الموحد والإبلاغ عن العينات السائلة على خلايا عنق الرحم ، ويمكن أيضا استخدامه لتعزيز الغلة تشخيص العديد من العينات غير الجهاز التناسلي للمرأة الأخرى مثل انصباب السوائل ، جبعة ، brushings ، الخ محتويات الكيس وبالإضافة إلى ذلك علامة AV تسهل تحسين تطبيق نهج SCIP خلال التقييم المناعى من أبواب الزنزانات من هذه العينات. ويمكن الاستعاضة عن تضمين المتوسطة بواسطة كواشف أخرى مع بعض التعديلات المناسبة على الخطوات ذات الصلة. يمكن استبدال HG بواسطة البلازما (الفبرينوجين) أن تبلور بواسطة ثرومبين في درجة حرارة الغرفة (1).

cell block preparation from cytology specimen with predominance of individually scattered cells

هذا الفيديو يوضح طريقة Shidham لإعداد كتل خلية من خلايا السائل على العينات التي تحتوي على الخلايا العنقية متفرقة فرادى وجماعات زنزانة صغيرة. هذا الأسلوب يستخدم HistoGel (الحرارية العلمية) مع المعدات المختبرية التقليدية. استخدام أبواب الزنزانات هو أداة قيمة المساعدة لتقييم الجهاز التناسلي للمرأة غير علم الخلايا. أنها تمكن اختصاصي الباثولوجيا الخلوية لدراسة تفاصيل إضافية عينة المورفولوجي بما في ذلك بنية الآفة. الأهم من ذلك ، فهي تسمح لتقييم دراسات ثانوية مثل كيمياء سيتولوجية مناعية ، واختبارات التهجين في الموضع (FISH / CISH) في الموقع وتفاعل البلمرة المتسلسل (PCR). وقد تم معظمها التقنيات التقليدية لإعداد كتلة الخلية المطبقة على عينات الخلايا غير الجهاز التناسلي للمرأة ، وعادة لالانصبابات السوائل في الجسم والغرامة الخزعات إبرة الطموح. عينات السائل العنقية القائمة على أقل نسبيا من نظرائهم الخلوية غير الجهاز التناسلي للمرأة مع العديد من الخلايا الفردية المتناثرة. وبسبب هذا ، الخلوية كافية داخل زنزانة المقاطع من الصعب تحقيقه. بالإضافة إلى ذلك ، يمكن للكتلة histotechnologist sectioning لا تصور المستوى الذي كانت الخلايا في أعلى تركيز. وبالتالي ، فمن الصعب رصد المستوى المناسب الذي يمكن اختيار المقاطع التي ستنقل إلى الشرائح الزجاجية للاختبار. ونتيجة لذلك ، قد يكون غاب عن المنطقة من كتلة الخلايا مع الخلايا في المصالح ، سواء في الماضي أو عن طريق قطع لا قطع عميقة بما فيه الكفاية. البروتوكول الحالي لأسلوب Shidham عناوين هذه المسائل. على الرغم من هذا البروتوكول هو موحد وذكرت لعينات السائل الجهاز التناسلي للمرأة على الخلايا ، فإنه يمكن أيضا أن تطبق على غير الجهاز التناسلي للمرأة عينات السوائل مثل الانصباب ، جبعة ، brushings ، الخ محتويات الكيس من أجل تحسين نوعية المواد التشخيصية في أقسام كتلة الخلية.

Watch this Scientific Journal Video about Cell Block Preparation from Cytology Specimen with Predominance of Individually Scattered Cells at JoVE.com

Cell Block Preparation from Cytology Specimen with Predominance of Individually Scattered Cells

Shidham في طريقة لإعداد كتل الخلية مع AV - علامة من عينات الخلايا التي تحتوي على خلايا متفرقة فرادى وجماعات زنزانة صغيرة.

خلية إعداد كتلة من العينة مع غلبة علم الخلايا من خلايا منفردة غيوم

This video demonstrates Shidham's method for preparation of cell blocks from liquid based cervicovaginal cytology specimens containing individually ...

cell-block-preparation-from-cytology-specimen-with-predominance

Research

JoVE Journal

Biology

73.3K Views.  University of Wisconsin - Milwaukee. Shidham في طريقة لإعداد كتل الخلية مع AV - علامة من عينات الخلايا التي تحتوي على خلايا متفرقة فرادى وجماعات زنزانة صغيرة.

Video: Cell Block Preparation from Cytology Specimen with Predominance of Individually Scattered Cells

Isolation and Functional Assessment of Human Breast Cancer Stem Cells from Cell and Tissue Samples

Breast cancer stem cells (BCSCs) are cancer cells with inherited or acquired stem cell-like characteristics. Despite their low frequency, they are major contributors to breast cancer initiation, relapse, metastasis and therapy resistance. It is imperative to understand the biology of breast cancer stem cells in order to identify novel therapeutic targets to treat breast cancer. Breast cancer stem cells are isolated and characterized based on expression of unique cell surface markers such as CD44, CD24 and enzymatic activity of aldehyde dehydrogenase (ALDH). These ALDHhighCD44+CD24- cells constitute the BCSC population and can be isolated by fluorescence-activated cell sorting (FACS) for downstream functional studies. Depending on the scientific question, different in vitro and in vivo methods can be used to assess the functional characteristics of BCSCs. Here, we provide a detailed experimental protocol for isolation of human BCSCs from both heterogenous populations of breast cancer cells as well as primary tumor tissue obtained from breast cancer patients. In addition, we highlight downstream in vitro and in vivo functional assays including colony forming assays, mammosphere assays, 3D culture models and tumor xenograft assays that can be used to assess BCSC function.

This experimental protocol describes the isolation of BCSCs from breast cancer cell and tissue samples as well as the in vitro and in vivo assays that can be used to assess BCSC phenotype and function.

العزل والتقييم الوظيفي للخلايا الجذعية لسرطان الثدي البشري من عينات الخلايا والأنسجة

Breast cancer stem cells (BCSCs) are cancer cells with inherited or acquired stem cell-like characteristics. Despite their low frequency, they are major ...

Cancer Research

Chromosomal Spread Preparation of Human Embryonic Stem Cells for Karyotyping

Although human embryonic stem cells (hESC) have been shown to present a stable diploid karyotype 1, many studies have reported that depending on culture conditions they become prone to acquire chromosomal anomalies such as addition of whole or parts of chromosomes. Indeed, during long-term culture, karyotypic alterations are observed when enzymatic or chemical dissociation are used 2,3,4, while manual dissection of colonies for passaging retains a stable karyotype 5. Besides, changes in the environment such as the removal of feeder cells also seem to compromise the genetic integrity of hESC 3,6. Once chromosomal alterations could affect cellular physiology, the characterization of the genetic integrity of hESC in vitro is crucial considering hESC as an essential tool in embryogenesis studies and drug testing. Furthermore, for future therapeutic purposes chromosomal changes are a real concern as it is frequently associated to carcinogenesis.
Here we show a simple and useful method to obtain high quality chromosome spreads for subsequent analysis of chromosome set by G-banding, FISH, SKY or CGH techniques 7,8. We recommend checking the chromosomal status routinely with intervals of 5 passages in order to monitor the appearance of translocations and aneuploidies
Priscila Britto and Rafaela Sartore contributed equally to the paper.

Karyotyping is a simple and useful technique widely used for detecting genetic alterations. Here we describe a step by step protocol for chromosome spread preparation of human embryonic stem cells for monitoring the chromosomal status of these cells maintained in culture.

الكروموسومات التحضير انتشار الخلايا الجذعية الجنينية البشرية لKaryotyping

Although human embryonic stem cells (hESC) have been shown to present a stable diploid karyotype 1, many studies have reported that depending on culture ...

Collection, Isolation, and Flow Cytometric Analysis of Human Endocervical Samples

Despite the public health importance of mucosal pathogens (including HIV), relatively little is known about mucosal immunity, particularly at the female genital tract (FGT). Because heterosexual transmission now represents the dominant mechanism of HIV transmission, and given the continual spread of sexually transmitted infections (STIs), it is critical to understand the interplay between host and pathogen at the genital mucosa. The substantial gaps in knowledge around FGT immunity are partially due to the difficulty in successfully collecting and processing mucosal samples. In order to facilitate studies with sufficient sample size, collection techniques must be minimally invasive and efficient. To this end, a protocol for the collection of cervical cytobrush samples and subsequent isolation of cervical mononuclear cells (CMC) has been optimized. Using ex vivo flow cytometry-based immunophenotyping, it is possible to accurately and reliably quantify CMC lymphocyte/monocyte population frequencies and phenotypes. This technique can be coupled with the collection of cervical-vaginal lavage (CVL), which contains soluble immune mediators including cytokines, chemokines and anti-proteases, all of which can be used to determine the anti- or pro-inflammatory environment in the vagina.

The use of cytobrush sampling to collect lymphocytes and monocytes from the endocervix is a minimally invasive technique that provides samples for analysis of female genital tract immunity. In this protocol, we describe the collection of cytobrush samples and immune cell isolation for flow cytometry assays.

جمع وعزل، وتحليل تدفق Cytometric العينات باطن عنق الرحم الإنسان

Despite the public health importance of mucosal pathogens (including HIV), relatively little is known about mucosal immunity, particularly at the female ...

Medicine

عزل النوى لتسلسل multiome في عينة الورم الصلب

Optimized Nuclei Isolation from Fresh and Frozen Solid Tumor Specimens for Multiome Sequencing

Multiome sequencing, which provides same-cell/paired single-cell RNA- and the assay for transposase-accessible chromatin with sequencing (ATAC-sequencing) data, represents a breakthrough in our ability to discern tumor cell heterogeneity-a primary focus of translational cancer research at this time. However, the quality of sequencing data acquired using this advanced modality is highly dependent on the quality of the input material. 
Digestion conditions need to be optimized to maximize cell yield without sacrificing quality. This is particularly challenging in the context of solid tumors with dense desmoplastic matrices that must be gently broken down for cell release. Freshly isolated cells from solid tumor tissue are more fragile than those isolated from cell lines. Additionally, as the cell types isolated are heterogeneous, conditions should be selected to support the total cell population. 
Finally, nuclear isolation conditions must be optimized based on these qualities in terms of lysis times and reagent types/ratios. In this article, we describe our experience with nuclear isolation for the 10x Genomics multiome sequencing platform from solid tumor specimens. We provide recommendations for tissue digestion, storage of single-cell suspensions (if desired), and nuclear isolation and assessment.

تسليط الضوء على المؤلف: تعزيز عزل النوى لتسلسل الميكروومات المتعددة في البيئات الدقيقة للورم الصعبة

The protocol provides a reliable and optimized approach to the isolation of nuclei from solid tumor specimens for multiome sequencing using the 10x Genomics platform, including recommendations for tissue dissociation conditions, cryopreservation of single-cell suspensions, and assessment of isolated nuclei.

عزل النوى الأمثل من عينات الورم الصلبة الطازجة والمجمدة لتسلسل متعدد النوى

Multiome sequencing, which provides same-cell/paired single-cell RNA- and the assay for transposase-accessible chromatin with sequencing (ATAC-sequencing) ...

Isolation and Characterization of a Head and Neck Squamous Cell Carcinoma Subpopulation Having Stem Cell Characteristics

Despite advances in the understanding of head and neck squamous cell carcinomas (HNSCC) progression, the five-year survival rate remains low due to local recurrence and distant metastasis. One hypothesis to explain this recurrence is the presence of cancer stem-like cells (CSCs) that present inherent chemo- and radio-resistance. In order to develop new therapeutic strategies, it is necessary to have experimental models that validate the effectiveness of targeted treatments and therefore to have reliable methods for the identification and isolation of CSCs. To this end, we present a protocol for the isolation of CSCs from human HNSCC cell lines that relies on the combination of two successive cell sortings performed by fluorescence activated cell sorting (FACS). The first one is based on the property of CSCs to overexpress ATP-Binding Cassette (ABC) transporter proteins and thus exclude, among others, vital DNA dyes such as Hoechst 33342. The cells sorted with this method are identified as a &#34;side population&#34; (SP). As the SP cells represent a low percentage (&#60;5%) of parental cells, a growing phase is necessary in order to increase their number before the second cell sorting. The next step allows for the selection of cells that possess two other HNSCC stem cell characteristics i.e. high expression level of the cell surface marker CD44 (CD44high) and the over-expression of aldehyde dehydrogenase (ALDHhigh). Since the use of a single marker has numerous limitations and pitfalls for the isolation of CSCs, the combination of SP, CD44 and ALDH markers will provide a useful tool to isolate CSCs for further analytical and functional assays requiring viable cells. The stem-like characteristics of CSCs was finally validated in vitro by the formation of tumorispheres and the expression of &#946;-catenin.

Understanding the role of cancer stem-like cells in tumor recurrence and resistance to therapies has become a topic of great interest in the last decade. This article describes the isolation and characterization of the sub-population of cancer stem-like cells from head and neck squamous carcinoma cell lines (HNSCC).

عزل وتوصيف من الرأس والرقبة قشري سرطان الخلايا حيوانية وجود الجذعية خصائص الخلية

Despite advances in the understanding of head and neck squamous cell carcinomas (HNSCC) progression, the five-year survival rate remains low due to local ...

A Cell Free Assay to Study Chromatin Decondensation at the End of Mitosis

During the vertebrate cell cycle chromatin undergoes extensive structural and functional changes. Upon mitotic entry, it massively condenses into rod shaped chromosomes which are moved individually by the mitotic spindle apparatus. Mitotic chromatin condensation yields chromosomes compacted fifty-fold denser as in interphase. During exit from mitosis, chromosomes have to re-establish their functional interphase state, which is enclosed by a nuclear envelope and is competent for replication and transcription. The decondensation process is morphologically well described, but in molecular terms poorly understood: We lack knowledge about the underlying molecular events and to a large extent the factors involved as well as their regulation. We describe here a cell-free system that faithfully recapitulates chromatin decondensation in vitro, based on mitotic chromatin clusters purified from synchronized HeLa cells and X. laevis egg extract. Our cell-free system provides an important tool for further molecular characterization of chromatin decondensation and its co-ordination with processes simultaneously occurring during mitotic exit such as nuclear envelope and pore complex re-assembly.

The molecular mechanisms of the decondensation of highly compacted mitotic chromatin are ill-defined. We present a cell-free assay based on mitotic chromatin clusters isolated from HeLa cells and Xenopus laevis egg extract that faithfully reconstitutes the decondensation process in vitro.

خلية الفحص مجاني لدراسة لونين Decondensation في نهاية الانقسام

During the vertebrate cell cycle chromatin undergoes extensive structural and functional changes. Upon mitotic entry, it massively condenses into rod ...

An Alternative Approach for Sample Preparation with Low Cell Number for TEM Analysis

Transmission electron microscopy (TEM) provides details of the cellular organization and ultrastructure. However, TEM analysis of rare cell populations, especially cells in suspension such as hematopoietic stem cells (HSCs), remains limited due to the requirement of a high cell number during sample preparation. There are a few cytospin or monolayer approaches for TEM analysis from scarce samples, but these approaches fail to get significant quantitative data from the limited number of cells. Here, an alternative and novel approach for sample preparation in TEM studies is described for rare cell populations that enables quantitative analysis.
A relatively low cell number, i.e., 10,000 HSCs, was successfully used for TEM analysis compared to the millions of cells typically used for TEM studies. In particular, Evans blue staining was performed after paraformaldehyde-glutaraldehyde (PFA-GA) fixation to visualize the tiny cell pellet, which facilitated embedding in agarose. Clusters of numerous cells were observed in ultra-thin sections. The cells had a well preserved morphology, and the ultra-structural details of the Golgi complex and several mitochondria were visible. This efficient, easy and reproducible protocol allows sample preparation from a low cell number and can be used for qualitative and quantitative TEM analysis on rare cell populations from limited biological samples.

Here, we present a protocol to prepare samples with low cell numbers for transmission electron microscopy (TEM) analysis.

طريقة بديلة لإعداد نموذج مع انخفاض عدد الخلايا لتحليل تيم

Transmission electron microscopy (TEM) provides details of the cellular organization and ultrastructure. However, TEM analysis of rare cell populations, ...

Preparation of Formalin-Fixed Paraffin-Embedded Tumor Samples: A Protocol to Preserve Tissue and Cytology Samples from Non-small Cell Lung Cancer (NSCLC)

Source: Ili&#233;, M., et al. <a href="https://www.jove.com/v/58082/using-22c3-anti-pd-l1-antibody-concentrate-on-biopsy-cytology-samples">Using 22C3 Anti-PD-L1 Antibody Concentrate on Biopsy and Cytology Samples from Non-small Cell Lung Cancer Patients.</a>&#160;J. Vis. Exp. (2018).
This protocol describes the preparation of formalin-fixed paraffin-embedded tumor samples which are used to preserve tissue and cytology samples from non-small cell lung cancer (NSCLC)

تحضير عينات الورم المضمنة في البارافين الثابت بالفورمالين: بروتوكول للحفاظ على عينات الأنسجة والخلايا من سرطان الرئة ذو الخلايا غير الصغيرة (NSCLC)

Source: Ili&#233;, M., et al. Using 22C3 Anti-PD-L1 Antibody Concentrate on Biopsy and Cytology Samples from Non-small Cell Lung Cancer Patients.&#160;J. ...

خلية إعداد كتلة من العينة مع غلبة علم الخلايا من خلايا منفردة غيوم

Summary

Explore More Videos

Chapters in this video

العزل والتقييم الوظيفي للخلايا الجذعية لسرطان الثدي البشري من عينات الخلايا والأنسجة

الكروموسومات التحضير انتشار الخلايا الجذعية الجنينية البشرية لKaryotyping

جمع وعزل، وتحليل تدفق Cytometric العينات باطن عنق الرحم الإنسان

عزل النوى الأمثل من عينات الورم الصلبة الطازجة والمجمدة لتسلسل متعدد النوى

عزل النوى الأمثل من عينات الورم الصلبة الطازجة والمجمدة لتسلسل متعدد النوى

عزل النوى الأمثل من عينات الورم الصلبة الطازجة والمجمدة لتسلسل متعدد النوى

عزل وتوصيف من الرأس والرقبة قشري سرطان الخلايا حيوانية وجود الجذعية خصائص الخلية

خلية الفحص مجاني لدراسة لونين Decondensation في نهاية الانقسام

طريقة بديلة لإعداد نموذج مع انخفاض عدد الخلايا لتحليل تيم

تحضير عينات الورم المضمنة في البارافين الثابت بالفورمالين: بروتوكول للحفاظ على عينات الأنسجة والخلايا من سرطان الرئة ذو الخلايا غير الصغيرة (NSCLC)