Los autores agradecen a Chris Chartrand, HT (ASCP) para la demostración de la sección de corte del bloque de celdas con marcador de AV.

Introducción: Este es un video que describe el método para la preparación Shidham bloque de celdas de la citología de base líquida (LBC) muestra usando HistoGelTM (Thermo Scientific) (HG). En comparación con otros métodos de azar, las siguientes son las dos características fundamentales de este protocolo para la preparación de los bloques de celdas a partir de muestras relativamente hipocelular con células dispersas por separado perder (1-5). <ol><li> Este protocolo incluye medidas para concentrar las células a lo largo del plano paralelo a la superficie de corte del bloque de celdas. </li><li> También incluye una inclusión faro como oscuro de AV-marcador (Figura 1b), que sirve a dos de los siguientes propósitos: <ol style="list-style-type:lower-alpha;"><li> Para visualizar el nivel en el que las células se concentran. El área del bloque de celdas con las células de su interés, puede ser visualizado por el histotecnólogo cuando la baliza de color oscuro se expone durante el corte. Esta capacidad de controlar contraseña para evitar el corte a través del nivel de la mayoría de las células, o de no cortar demasiado superficial en el nivel con mayor concentración de células de la muestra. </li><li> Para servir como punto de referencia de localización en la sección de serie bloque de celdas en diferentes diapositivas. Este punto de referencia actúa como un faro para ayudar a localizar las células o grupos de células para la evaluación de un patrón de inmunorreactividad de coordinar con el enfoque de SCIP (6,7). </li></ol></li></ol> PROTOCOLO (Figura 2) Preparación de la muestra. <ol><li> Transferir el residuo LBC muestra de citología cervical a un tubo de vidrio plano inferior (15 mm de diámetro x 45 mm) (Figura 2.1 a 2.4). Coloque el tubo de vidrio en un tubo de plástico compañía más grande (28 x 85 mm) y se centrifuga. Retire el tubo de fondo de cristal del tubo portador y se vierte el sobrenadante. </li><li> El tubo de vidrio es el máximo (para evitar el derrame de agua de calefacción en el paso siguiente) y se coloca de nuevo dentro de un tubo grande de plástico de fondo plano portador </li><li> El tubo de plástico vehículo que contiene el tubo de vidrio es el máximo, coloca en una centrifugadora (con tazas giratorias y no tazas de ángulo fijo para que las células caen perpendicularmente a la parte inferior plana del tubo de vidrio), y se centrifugaron a 1.805 G (3000 rpm, rotor de radio-17cm) durante cinco minutos (Figura 2.5). </li><li> Los tubos se retiran de la centrífuga vertical y el tubo de cristal más pequeñas se retira con una pinza del tubo de plástico más grandes sin perturbar el precipitado sedimentado con las células. </li><li> El tubo de vidrio con la muestra es sin límite y el sobrenadante se vierte con cuidado de no perturbar la capa plana de células de sedimentos en la parte inferior (Figura 2.6). </li></ol> La inclusión de la referencia de coordenadas AV-marcador y la adición de gel <ol><li> Un faro oscuro AV-marcador (alrededor de 2 mm x 2 mm de tamaño, superficie plana, fragmento de material de color oscuro, sectionable) (Figura 3) se agrega como una señal para el tubo de vidrio (Figura 2.7). </li><li> Licuar una parte alícuota de HG por fusión en horno de microondas por 10 segundos a media potencia. </li><li> Añadir 0,5 ml de HG fundido en el tubo, se mezcla con los sedimentos con rapidez, y resumen (Figura 2.8) (Vaya al siguiente paso rápido sin permitir que el HG para comenzar a solidificar). </li><li> Añadir aproximadamente 2,5 ml de agua tibia (45 ° C) de agua al tubo de plástico portadora (Figura 2.9). </li><li> El tubo más pequeño de vidrio cubiertas se coloca dentro del tubo de plástico con agua tibia. (Este paso es necesario para mantener el HG se solidifique durante los próximos pasos) (Figura 2.9). </li><li> El tubo de plástico portadora se coloca en la centrífuga (con tazas giratorias y no tazas de ángulo fijo para que las células caen perpendicularmente a la parte inferior plana del tubo de vidrio), y se centrifugaron a 1.805 G (3000 rpm, radio-17cm rotor) durante cinco minutos. El propósito de esta etapa de centrifugación es empujar el marcador AV-y para concentrar las células en una capa más cercana a la superficie de corte del bloque de celdas de parafina último incorporado (Figura 1d). </li><li> Los tubos se retira con suavidad y vertical de la centrífuga cuidando de no alterar la capa de sedimento fino con las células de la muestra en la parte inferior. </li><li> El tubo de plástico más grande es no nivelado y el tubo de cristal más pequeñas se quita verticalmente con una pinza sin alterar la capa de sedimento de las células de la muestra. </li><li> El pequeño tubo de vidrio se refrigera en posición vertical durante 15 minutos para enfriar y solidificar el HG (Figura 2.11). </li></ol> La eliminación del bloque de celdas como un botón de gel con muestras para su procesamiento final <ol><li> El disco HG solidificado, con la capa de concentrado / sedimento muestra en el fondo se desprende de la parte inferior del tubo de vidrio plano por chorros de formol al 10% a través de una aguja de calibre 23 con la jeringa (Figura 2.12). </li><li> La aguja se introduce a lo largo del lado del tubo en la periferia del disco se solidificó con HG muestra (Figura 2.12). </li><li> El Needle se gira a lo largo del lado del tubo, mientras que la formalina es empujado lentamente a través de la jeringa. Esto resulta en la separación del botón junto con HG faro de color oscuro AV-marcador y la muestra se concentró en él desde el fondo plano del tubo de vidrio (Figura 2.12). </li><li> El bloque de celdas (botón de muestra de gel con las células) se coloca en una cinta de etiquetado y presentado para el procesamiento de tejidos embebidos en parafina para preparar los bloques de celdas (Figura 2.13). </li></ol> Inclusión y corte de la muestra <ol><li> El disco está incluido en parafina con el lado oscuro de radiobaliza hasta que la superficie de corte (Figura 1). </li><li> El bloque se secciona hasta que el color oscuro AV-marcador como un faro está expuesto y claramente visible. </li><li> De tres a cuatro secciones micras se cortan de este nivel que debe contener la mayor parte de las células individualmente dispersada por la muestra. </li><li> Las secciones se recogen en el portaobjetos para la tinción más, la tinción inmunohistoquímica, u otras pruebas, como se indica. Los protocolos para estos tests, incluyendo el tipo de diapositivas a utilizar para el montaje de las secciones puede variar. En general, para la inmunotinción, portaobjetos recubiertos se utilizan para evitar la pérdida de flotación y las secciones de las diapositivas durante las etapas de la inmunotinción. </li></ol> Abreviaturas utilizadas (en orden alfabético): CISH, cromogénicos in-situ las pruebas de hibridación, el pescado, fluorescente in situ las pruebas de hibridación; FFPE, fijado en formol e incluido en parafina, FNA, aspiración con aguja fina; HG, HistoGel ™ (Thermo Scientific); LBC, la citología de base líquida, PCR reacción en cadena de la polimerasa; <img src="/files/ftp_upload/1316/1382fig1.jpg" alt="la figura 1" /> Figura 1. La estructura del bloque de celdas preparadas por el protocolo de Shidham. <img src="/files/ftp_upload/1316/1382fig2.jpg" alt="la figura 2" /> Figura 2. El resumen de los diferentes pasos para la preparación de bloque de celdas de muestra de LBC por el protocolo de Shidham. <img src="/files/ftp_upload/1316/1382fig3.jpg" alt="la figura 3" /> Figura 3. Preparación de la AV-marcador de cáscaras de plátano. <img src="/files/ftp_upload/1316/1382fig4.jpg" alt="la figura 4" /> Figura 4. Comparación de los bloques de celdas y secciones con y sin AV-marcador. <img src="/files/ftp_upload/1316/1382fig5.jpg" alt="la figura 5" /> Figura 5. Comparación de la celularidad de las secciones del bloque de celdas con y sin AV-marcador.

<ol>
	<li>Shidham, V. B., Epple, J., Shidham, V. B., Atkinson, B. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chapter+14,+Appendix+I:+Collection+and+processing+of+effusion+fluids+for+cytopathologic+evaluation.">Chapter 14, Appendix I: Collection and processing of effusion fluids for cytopathologic evaluation.</a> Cytopathologic Diagnosis of Serous Fluids. , .</li><li>Varsegi, G., D'Amore, K., Shidham, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=p16INK4a+Immunocytochemistry+as+an+Adjunct+to+Cervical+Cytology+-+Potential+Reflex+Testing+on+Specially+Prepared+Cellblocks+from+Residual+Liquid+Based+Cytology+(LBC)+Specimens.">p16INK4a Immunocytochemistry as an Adjunct to Cervical Cytology - Potential Reflex Testing on Specially Prepared Cellblocks from Residual Liquid Based Cytology (LBC) Specimens.</a> Modern Pathology 22: 98th Annual Meeting of United States and Canadian Academy of Pathology. , 97a-97a (2009).</li><li>Nigro, K., Tynski, Z., Wasman, J., Abdul-Karim, F., Wang, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+cell+block+preparation+methods+for+nongynecologic+ThinPrep+specimens.">Comparison of cell block preparation methods for nongynecologic ThinPrep specimens.</a> Diagn Cytopathol. 35, 640-643 (2007).</li><li>Saleh, H. A., Hammoud, J., Zakaria, R., Khan, A. Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+Thin-Prep+and+cell+block+preparation+for+the+evaluation+of+Thyroid+epithelial+lesions+on+fine+needle+aspiration+biopsy.">Comparison of Thin-Prep and cell block preparation for the evaluation of Thyroid epithelial lesions on fine needle aspiration biopsy.</a> CytoJournal. 5, 3-3 (2008).</li><li>Kyroudi, A., Paefthimiou, M., Symiakaki, H., Mentzelopoulou, P., Voulgaris, Z., Karakitsos, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Increasing+diagnostic+accuracy+with+a+cell+block+preparation+from+thin-layer+endometrial+cytology:+a+feasibility+study.">Increasing diagnostic accuracy with a cell block preparation from thin-layer endometrial cytology: a feasibility study.</a> Acta Cytol. 50, 63-69 (2006).</li><li>Atkinson, B. F., Shidham, V. B., Atkinson, B. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chapter+5:+Immunocytochemistry+of+effusion+fluids:+introduction+to+SCIP+approach+(Chapter+5.">Chapter 5: Immunocytochemistry of effusion fluids: introduction to SCIP approach (Chapter 5.</a> Cytopathologic Diagnosis of Serous Fluids. , (2007).</li><li>Shidham, V. B., Shidham, V. B., Atkinson, B. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chapter+15,+Appendix+II:+Immunocytochemistry+of+effusions+processing+and+commonly+used+immunomarkers.">Chapter 15, Appendix II: Immunocytochemistry of effusions processing and commonly used immunomarkers.</a> Cytopathologic Diagnosis of Serous Fluids. , (2007).</li></ol>

Bloques de celdas son una herramienta valiosa para la evaluación de muestras de citología varios (1). Lo más importante, además de los detalles arquitectónicos de la muestra, los bloques de celdas permiten la evaluación de los estudios complementarios como la inmunocitoquímica, fluorescente / cromogénico ensayos in situ hibridación (FISH / CISH) y PCR in situ. Una variedad de métodos para la preparación de bloque de celdas se describen. Sin embargo, la mayoría de estos son adecuados para no muestras de citología ginecológica, que contienen las células de un número relativamente elevado y con microfragmentos tejidos como en los aspirados FNA y algunos fluidos serosos, tales como derrames (1,3,4,5). Debido a que los bloques de celdas principalmente proporcionar la oportunidad para la evaluación inmunocitoquímica, su tratamiento de preferencia debe ser similar a la de los fijado en formol e incluidos en parafina (FFPE) los tejidos. En última instancia, los resultados obtenidos después de la evaluación inmunocitoquímica de las secciones de bloque de celdas se comparan con los de la literatura publicada realiza principalmente en las secciones de tejido FFPE. Cualquier modificación en el protocolo potencialmente comprometer y anular la validez de los resultados obtenidos en los bloques de células procesan a través de distintos fijadores y las secuencias de otro reactivo que el utilizado para FFPE de rutina. Algunas de las técnicas comerciales pueden tener el inconveniente de procesamiento a través de un protocolo de exposición a otros fijador-reactivo de la exposición. Varios métodos de preparación de células bloque están disponibles para los especímenes con una importante cantidad de sedimentos y fragmentos de tejido. Principalmente, los sedimentos concentrados son apoyados por un poco de gel o principio de la coagulación. El botón es fácil de manejar luego incluidos en parafina después del procesamiento, como las muestras de patología quirúrgica / biopsias. Los geles utilizados son de gelatina, agar, el fibrinógeno / plasma trombina, y otros geles comerciales, tales como HG. Los métodos de concentración varían de granulación simple de los sedimentos por centrifugación a la concentración de células a lo largo de varios tipos de membranas. Los ejemplos incluyen: miliporo, collodin (celoidina) bolsas o raspar las células de los frotis de citología en portaobjetos de cristal (1). También se evaluó una variedad de geles, tratando diferentes combinaciones de agar y gelatina. Ninguna de las combinaciones de lograr la consistencia firme una suficiente para obtener un disco de fácil maniobrabilidad de gel solidificado con células incluidas en la muestra en una sola pieza. HG mostraron consistencia adecuada y en nuestra experiencia los resultados de inmunotinción en las secciones de HG bloque de celdas han sido excelentes. Citología de base líquida (LBC) muestras para citología cervicovaginal y generalmente son menos móviles que los no-ginecológica especímenes como se mencionó anteriormente. Además, las muestras ginecológicas LBC contienen predominantemente individuales dispersas células exfoliadas superficial de la mucosa cervicovaginal. Debido a esto, la celularidad adecuada dentro de las secciones bloque de celdas no pueden lograrse sin un enfoque especial. A medida que estos individualmente dispersos componentes celulares en el bloque del no puede ser visto por el histotecnólogo durante el corte de la sección, el nivel en el que las células comienzan a aparecer en las secciones no se aprecia y puede perderse, ya sea mediante la reducción de más allá del nivel con la mayoría de las células o no corte bastante profundo en el nivel con mayor concentración de células de la muestra (Figura 4). Shidham protocolo de direcciones de estas dos cuestiones con HG como incrustación equipos de laboratorio y medio convencional (2) (Figura 2). Este protocolo consiste en las dos siguientes características principales (Figura 1): <ol><li> La concentración y la alineación de células dispersas por separado en un plano estrecho adyacente y paralela a la superficie de corte del bloque de celdas (Figura 5). </li><li> La inclusión de una baliza similar a oscuras AV-marcador como una señal. Esto es fundamental para el logro de las siguientes características: <ol style="list-style-type:lower-alpha;"><li> Identificación y seguimiento del nivel en el cual las células se concentran en el bloque de celdas. La exposición de la señal de color oscuro destaca el nivel en el que la mayoría de las células individualmente dispersos en el bloque de celdas se espera que se encuentra (Figura 4). Esto evita que la tala excesiva (más allá del nivel de corte con la mayoría de las células) o defecto (no corte bastante profundo en el nivel con mayor concentración de células de la muestra) en el bloque de celdas y permitir la selección de las secciones del nivel en el bloque de celdas correspondientes con mayor concentración de las células. </li><li> La señal de color oscuro en las secciones también sirve como punto de referencia para estudiar y determinar exactamente las mismas células en diferentes secciones de serie del bloque de celdas en diferentes diapositivas (Figura 4). Esto es crítico, mientras que la interpretación y evaluación de las propiedades de coordinar immunoprofile como de las células en particular por el enfoque de SCIP a seguir las mismas células en las diferentes secciones (6,7). </li></ol></li></ol> Aunque our protocolo estandarizado e informó de las muestras de líquido basado en la citología cervical, también puede ser utilizado para mejorar el rendimiento diagnóstico de muchos otros no-ginecológica especímenes como los fluidos derrame, FNA, el cepillado, el contenido del quiste, etc Además, el marcador AV facilitaría la mejora aplicación del enfoque SCIP durante la evaluación inmunohistoquímica de secciones de bloque de celdas de estos ejemplares. El medio de inclusión podrán ser sustituidos por otros reactivos con las modificaciones apropiadas en los pasos pertinentes. HG podrá ser sustituido por plasma (fibrinógeno) para ser gelificada por la trombina a temperatura ambiente (1).

cell block preparation from cytology specimen with predominance of individually scattered cells

Este vídeo demuestra Shidham método para la preparación de los bloques de celdas de líquidos muestras cervicovaginales citología de base que contiene las células de forma individual y en pequeños grupos dispersos de células. Esta técnica utiliza HistoGel (Thermo Scientific) con material de laboratorio convencionales. El uso de secciones de bloque celular es una valiosa herramienta auxiliar para la evaluación de la no-citología ginecológica. Permiten que el citopatólogo para estudiar detalles adicionales muestra morfológicos incluyendo la arquitectura de la lesión. Lo más importante es que permiten la evaluación de los estudios complementarios como la inmunocitoquímica, ensayos in situ hibridación (FISH / CISH) e in situ la reacción en cadena de la polimerasa (PCR). Celulares tradicionales técnicas de preparación de bloques en su mayoría han sido aplicados a los no-muestras de citología ginecológica, por lo general por los derrames de líquido del cuerpo y las biopsias por aspiración con aguja fina. Líquido muestras cervicovaginales base son relativamente menos móvil que los no-ginecológicos contrapartes con muchas células dispersas individuales. Debido a esto, la celularidad adecuada dentro de las secciones de bloque de celdas es difícil de lograr. Además, el histotecnólogo seccionar el bloque no puede visualizar el nivel en el que las células se encuentran en mayor concentración. Por lo tanto, es difícil controlar el nivel adecuado en las secciones que pueden ser seleccionados para ser transferidos a los portaobjetos de vidrio para la prueba. Como resultado, el área del bloque de celdas con las células de interés se pueden perder, ya sea mediante la reducción de pasado o no el corte lo suficientemente profundo. Protocolo actual para el método de Shidham aborda estos temas. Aunque este protocolo es estándar e informaron de muestras ginecológicas citología de base líquida, también se puede aplicar a las muestras no ginecológicas tales como fluidos derrame, FNA, cepillado, etc quiste contenidos para mejorar la calidad del material de diagnóstico en las secciones de bloque celular.

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Cell Block Preparation from Cytology Specimen with Predominance of Individually Scattered Cells

Shidham método para la preparación de los bloques de celdas con AV-marcador de muestras de citología con células dispersas de forma individual y en pequeños grupos de células.

La preparación de bloques de células a partir de muestras de citología con predominio de células aisladas individualmente

This video demonstrates Shidham's method for preparation of cell blocks from liquid based cervicovaginal cytology specimens containing individually ...

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Research

JoVE Journal

Biology

73.2K vistas.  University of Wisconsin - Milwaukee. Shidham método para la preparación de los bloques de celdas con AV-marcador de muestras de citología con células dispersas de forma individual y en pequeños grupos de células.

Video: Cell Block Preparation from Cytology Specimen with Predominance of Individually Scattered Cells

Human ES cells: Starting Culture from Frozen Cells

Here we demonstrate how our lab begins a HuES human embryonic stem cell line culture from a frozen stock.  First, a one to two day old ten cm plate of  approximately one (to two) million irradiated mouse embryonic fibroblast feeder cells is rinsed with HuES media to remove residual serum and cell debris, and then HuES media added and left to equilibrate in the cell culture incubator.  A frozen vial of cells from long term liquid nitrogen storage or a -80C freezer is sourced and quickly submerged in a 37C water bath for quick thawing.  Cells in freezing media are then removed from the vial and placed in a large volume of HuES media.  The large volume of HuES media facilitates removal of excess serum and DMSO, which can cause HuES human embryonic stem cells to differentiate.  Cells are gently spun out of suspension, and then re-suspended in a small volume of fresh HuES media that is then used to seed the MEF plate.  It is considered important to seed the MEF plate by gently adding the HuES cells in a drop wise fashion to evenly disperse them throughout the plate.  The newly established HuES culture plate is returned to the incubator for 48 hrs before media is replaced, then is fed every 24 hours thereafter.

Here we demonstrate how our lab begins a HuES human embryonic stem cell line culture from a frozen stock.

Células madre embrionarias humanas: Cultura a partir de células congeladas

Here we demonstrate how our lab begins a HuES human embryonic stem cell line culture from a frozen stock.  First, a one to two day old ten cm plate of  ...

Investigación

Biología

Derivation of Hematopoietic Stem Cells from Murine Embryonic Stem Cells

A stem cell is defined as a cell with the capacity to both self-renew and generate multiple differentiated progeny.  Embryonic stem cells (ESC) are derived from the blastocyst of the early embryo and are pluripotent in differentiative ability.  Their vast differentiative potential has made them the focus of much research centered on deducing how to coax them to generate clinically useful cell types.  The successful derivation of hematopoietic stem cells (HSC) from mouse ESC has recently been accomplished and can be visualized in this video protocol.  HSC, arguably the most clinically exploited cell population, are used to treat a myriad of hematopoietic malignancies and disorders.  However, many patients that might benefit from HSC therapy lack access to suitable donors.  ESC could provide an alternative source of HSC for these patients.  The following protocol establishes a baseline from which ESC-HSC can be studied and inform efforts to isolate HSC from human ESC.  In this protocol, ESC are differentiated as embryoid bodies (EBs) for 6 days in commercially available serum pre-screened for optimal hematopoietic differentiation.  EBs are then dissociated and infected with retroviral HoxB4.  Infected EB-derived cells are plated on OP9 stroma, a bone marrow stromal cell line derived from the calvaria of  M-CSF-/- mice, and co-cultured in the presence of hematopoiesis promoting cytokines for ten days.  During this co-culture, the infected cells expand greatly, resulting in the generation a heterogeneous pool of 100s of millions of cells.  These cells can then be used to rescue and reconstitute lethally irradiated mice.

This protocol details the derivation of transplantable hematopoietic stem cells from mouse embryonic stem cells (ESC) and their subsequent injection into lethally irradiated recipient mice. Briefly, ESC are differentiated as embryoid bodies, which are then infected with retroviral HoxB4 and co-cultured with OP9 stromal cells and hematopoietic cytokines.

Derivación de células madre hematopoyéticas de células madre embrionarias murinas

A stem cell is defined as a cell with the capacity to both self-renew and generate multiple differentiated progeny.  Embryonic stem cells (ESC) are ...

Preparation of Neuronal Cultures from Midgastrula Stage Drosophila Embryos

This video illustrates the procedure for making primary neuronal cultures from midgastrula stage Drosophila embryos. The methods for collecting embryos and their dechorionation using bleach are demonstrated. Using a glass pipet attached to a mouth suction tube, we illustrate the removal of all cells from single embryos. The method for dispersing cells from each embyro into a small (5 l) drop of medium on an uncoated glass coverslip is demonstrated. A view through the microscope at 1 hour after plating illustrates the preferred cell density. Most of the cells that survive when grown in defined medium are neuroblasts that divide one or more times in culture before extending neuritic processes by 12-24 hours. A view through the microscope illustrates the level of neurite outgrowth and branching expected in a healthy culture at 2 days in vitro. The cultures are grown in a simple bicarbonate based defined medium, in a 5% CO2 incubator at 22-24&deg;C. Neuritic processes continue to elaborate over the first week in culture and when they make contact with neurites from neighboring cells they often form functional synaptic connections. Neurons in these cultures express voltage-gated sodium, calcium, and potassium channels and are electrically excitable. This culture system is useful for studying molecular genetic and environmental factors that regulate neuronal differentiation, excitability, and synapse formation/function.

This video demonstrates the preparation of primary neuronal cultures from midgastrula stage Drosophila embryos. Views of live cultures show cells 1 hour after plating and differentiated neurons after 2 days of growth in a bicarbonate-based defined medium. The neurons are electrically excitable and form synaptic connections.

Preparación de cultivos neuronales a partir de embriones de Drosophila Midgastrula Etapa

This video illustrates the procedure for making primary neuronal cultures from midgastrula stage Drosophila embryos. The methods for collecting embryos ...

Preparation of Single-Cell Suspensions from Mouse Spleen with the gentleMACS Dissociator

Single-cell suspensions are a prerequisite for experiments in cell separation, cell analysis and cell culture.  To avoid tedious and often painful manual dissociations the gentleMACS Dissociator allows one to dissociate tissue very efficiently under controlled and reproducible conditions.  The gentleMACS Dissociator can optimally dissociate mouse spleen, combining timesaving and standardization with user-safety.

This video describes how to dissociate mouse spleens using the gentleMACS Dissociator, an automated bench-top device that can mechanically disrupt tissues using special tubes to produce viable cell suspensions. Following dissociation, spleens are filtered, centrifuged, and resuspended for further applications.

This video describes a simple, time-saving technique for automated tissue dissociation using the gentleMACS Dissociator to prepare single-cell suspensions of mouse splenocytes.

Preparación de una sola célula suspensiones de bazo de ratón con el disociador gentleMACS

Single-cell suspensions are a prerequisite for experiments in cell separation, cell analysis and cell culture.  To avoid tedious and often painful manual ...

Preparation of Drosophila S2 cells for Light Microscopy

The ideal experimental system would be cheap and easy to maintain, amenable to a variety of techniques, and would be supported by an extensive literature and genome sequence database. Cultured Drosophila S2 cells, the product of disassociated 20-24 hour old embryos1, possess all these properties. Consequently, S2 cells are extremely well-suited for the analysis of cellular processes, including the discovery of the genes encoding the molecular components of the process or mechanism of interest. The features of S2 cells that are most responsible for their utility are the ease with which they are maintained, their exquisite sensitivity to double-stranded (ds)RNA-mediated interference (RNAi), and their tractability to fluorescence microscopy as either live or fixed cells.
S2 cells can be grown in a variety of media, including a number of inexpensive, commercially-available, fully-defined, serum-free media2. In addition, they grow optimally and quickly at 21-24&deg;C and can be cultured in a variety of containers. Unlike mammalian cells, S2 cells do not require a regulated atmosphere, but instead do well with normal air and can even be maintained in sealed flasks.
Complementing the ease of RNAi in S2 cells is the ability to readily analyze experimentally-induced phenotypes by phase or fluorescence microscopy of fixed or live cells. S2 cells grow in culture as a single monolayer but do not display contact inhibition. Instead, cells tend to grow in colonies in dense cultures. At low density, S2 cultures grown on glass or tissue culture-treated plastic are round and loosely-attached. However, the cytology of S2 cells can be greatly improved by inducing them to flatten extensively by briefly culturing them on a surface coated with the lectin, concanavalin A (ConA)3. S2 cells can also be stably transfected with fluorescently-tagged markers to label structures or organelles of interest in live or fixed cells. Therefore, the usual scenario for the microscopic analysis of cells is this: first, S2 cells (which can possess transgenes to express tagged markers) are treated by RNAi to eliminate a target protein(s). RNAi treatment time can be adjusted to allow for differences in protein turn-over kinetics and to minimize cell trauma/death if the target protein is important for viability. Next, the treated cells are transferred to a dish containing a coverslip pre-coated with conA to induce cells to spread and tightly adhere to the glass. Finally, cells are imaged with the researcher's choice of microscopy modes. S2 cells are particularly good for studies requiring extended visualization of live cells since these cells stay healthy at room temperature and normal atmosphere.

Preparation of Drosophila S2 cells for Light Microscopy

Drosophila Schneider (S2) cells are an increasingly popular system for the discovery and functional analysis of genes. Our goal is to describe some of the microscopic techniques that make S2 cells such an increasingly important experimental system.

Preparación de Drosophila Células S2 para microscopía de luz

The ideal experimental system would be cheap and easy to maintain, amenable to a variety of techniques, and would be supported by an extensive literature ...

Preparation of Quality Inositol Pyrophosphates

Myo-inositol is present in nature either unmodified or in more complex phosphorylated derivates. Of the latest, the two most abundant in eukaryotic cells are inositol pentakisphosphate (IP5) and inositol hexakisphosphate (phytic acid or IP6). IP5 and IP6 are the precursors of inositol pyrophosphate molecules that contain one or more pyrophosphate bonds1. Phosphorylation of IP6 generates diphoshoinositolpentakisphosphate (IP7 or PP-IP5) and bisdiphoshoinositoltetrakisphosphate (IP8 or (PP)2-IP4). Inositol pyrophosphates have been isolated from all eukaryotic organisms so far studied. In addition, the two distinct classes of enzymes responsible for inositol pyrophosphate synthesis are highly conserved throughout evolution2-4.
The IP6 kinases (IP6Ks) posses an enormous catalytic flexibility, converting IP5 and IP6 to PP-IP4 and IP7 respectively and subsequently, by using these products as substrates, promote the generation of more complex molecules5,6. Recently, a second class of pyrophosphate generating enzymes was identified in the form of the yeast protein VIP1 (also referred as PP-IP5K), which is able to convert IP6 to IP7 and IP87,8.
Inositol pyrophosphates regulate many disparate cellular processes such as insulin secretion9, telomere length10,11, chemotaxis12, vesicular trafficking13, phosphate homeostasis14 and HIV-1 gag release15. Two mechanisms of actions have been proposed for this class of molecules. They can affect cellular function by allosterically interacting with specific proteins like AKT16. Alternatively, the pyrophosphate group can donate a phosphate to pre-phosphorylated proteins17. The enormous potential of this research field is hampered by the absence of a commercial source of inositol pyrophosphates, which is preventing many scientists from studying these molecules and this new post-translational modification. The methods currently available to isolate inositol pyrophosphates require sophisticated chromatographic apparatus18,19. These procedures use acidic conditions that might lead to inositol pyrophosphate degradation20 and thus to poor recovery. Furthermore, the cumbersome post-column desalting procedures restrict their use to specialized laboratories.
In this study we describe an undemanding method for the generation, isolation and purification of the products of the IP6-kinase and PP-IP5-kinases reactions. This method was possible by the ability of polyacrylamide gel electrophoresis (PAGE) to resolve highly phosphorylated inositol polyphosphates20. Following IP6K1 and PP-IP5K enzymatic reactions using IP6 as the substrate, PAGE was used to separate the generated inositol pyrophosphates that were subsequently eluted in water.

Inositol pyrophosphates play an important role in human pathologies such cancer, diabetes and obesity; however, the exact mechanism of action is a matter of dispute. The lack of commercially available inositol pyrophosphates renders detailed studies problematic. Here we describe a simple protocol to produce and isolate milligrams of inositol pyrophosphates.

Preparación de la Calidad pirofosfatos Inositol

Myo-inositol is present in nature either unmodified or in more complex phosphorylated derivates. Of the latest, the two most abundant in eukaryotic cells ...

Chromosome Preparation From Cultured Cells

Chromosome (cytogenetic) analysis is widely used for the detection of chromosome instability. When followed by G-banding and molecular techniques such as fluorescence in situ hybridization (FISH), this assay has the powerful ability to analyze individual cells for aberrations that involve gains or losses of portions of the genome&#160;and rearrangements involving one or more chromosomes. In humans, chromosome abnormalities occur in approximately 1 per 160 live births1,2, 60-80% of all miscarriages3,4, 10% of stillbirths2,5, 13% of individuals with congenital heart disease6, 3-6% of infertility cases2, and in many patients with developmental delay&#160;and birth defects7. Cytogenetic analysis of malignancy is routinely used by researchers and clinicians, as observations of clonal chromosomal abnormalities have been shown to have both diagnostic and prognostic significance8,9.&#160; Chromosome isolation is invaluable for gene therapy and stem cell research of organisms including nonhuman primates and rodents10-13.
Chromosomes can be isolated from cells of live tissues, including blood lymphocytes, skin fibroblasts, amniocytes, placenta, bone marrow, and tumor specimens. Chromosomes are analyzed at the metaphase stage of mitosis, when they are most condensed and therefore more clearly visible. The first step of the chromosome isolation technique involves the disruption of the spindle fibers by incubation with Colcemid, to prevent the cells from proceeding to the subsequent anaphase stage. The cells are then treated with a hypotonic solution and preserved in their swollen state with Carnoy&#39;s fixative. The cells are then dropped on to slides and can then be utilized for a variety of procedures. G-banding involves trypsin treatment followed by staining with Giemsa to create characteristic light and dark bands. The same procedure to isolate chromosomes can be used for the preparation of cells for procedures such as fluorescence in situ hybridization (FISH), comparative genomic hybridization (CGH), and spectral karyotyping (SKY)14,15.

Chromosomes can be isolated from live cells such as lymphocytes or skin fibroblasts, and from organisms including humans or mice. These chromosome preparations can be further utilized for routine G-banding and molecular cytogenetic procedures such as fluorescence in situ hybridization (FISH), comparative genomic hybridization (CGH), and spectral karyotyping (SKY).

Cromosoma Preparación de las células cultivadas

Chromosome (cytogenetic) analysis is widely used for the detection of chromosome instability. When followed by G-banding and molecular techniques such as ...

Preparation of Primary Myogenic Precursor Cell/Myoblast Cultures from Basal Vertebrate Lineages

Due to the inherent difficulty and time involved with studying the myogenic program in vivo, primary culture systems derived from the resident adult stem cells of skeletal muscle, the myogenic precursor cells (MPCs), have proven indispensible to our understanding of mammalian skeletal muscle development and growth. Particularly among the basal taxa of Vertebrata, however, data are limited describing the molecular mechanisms controlling the self-renewal, proliferation, and differentiation of MPCs. Of particular interest are potential mechanisms that underlie the ability of basal vertebrates to undergo considerable postlarval skeletal myofiber hyperplasia (i.e.&#160;teleost fish) and full regeneration following appendage loss (i.e.&#160;urodele amphibians). Additionally, the use of cultured myoblasts could aid in the understanding of regeneration and the recapitulation of the myogenic program and the differences between them. To this end, we describe in detail a robust and efficient protocol (and variations therein) for isolating and maintaining MPCs and their progeny, myoblasts and immature myotubes, in cell culture as a platform for understanding the evolution of the myogenic program, beginning with the more basal vertebrates. Capitalizing on the model organism status of the zebrafish (Danio rerio), we report on the application of this protocol to small fishes of the cyprinid clade Danioninae. In tandem, this protocol can be utilized to realize a broader comparative approach by isolating MPCs from the Mexican axolotl (Ambystomamexicanum) and even laboratory rodents. This protocol is now widely used in studying myogenesis in several fish species, including rainbow trout, salmon, and sea bream1-4.

In vitro culture systems have proven indispensible to our understanding of vertebrate myogenesis. However, much remains to be learned about nonmammalian skeletal muscle development and growth, particularly in basal taxa. An efficient and robust protocol for isolating the adult stem cells of this tissue, the myogenic precursor cells (MPCs), and maintaining their self-renewal, proliferation, and differentiation in a primary culture setting allows for the identification of conserved and divergent regulatory mechanisms throughout the vertebrate lineages.

Preparación de Primaria Myogenic precursor de célula / cultivos de mioblastos de basales Vertebrados Linajes

Due to the inherent difficulty and time involved with studying the myogenic program in vivo, primary culture systems derived from the resident adult stem ...

Efficient Generation Human Induced Pluripotent Stem Cells from Human Somatic Cells with Sendai-virus

A few years ago, the establishment of human induced pluripotent stem cells (iPSCs) ushered in a new era in biomedicine. Potential uses of human iPSCs include modeling pathogenesis of human genetic diseases, autologous cell therapy after gene correction, and personalized drug screening by providing a source of patient-specific and symptom relevant cells. However, there are several hurdles to overcome, such as eliminating the remaining reprogramming factor transgene expression after human iPSCs production. More importantly, residual transgene expression in undifferentiated human iPSCs could hamper proper differentiations and misguide the interpretation of disease-relevant in vitro phenotypes. With this reason, integration-free and/or transgene-free human iPSCs have been developed using several methods, such as adenovirus, the piggyBac system, minicircle vector, episomal vectors, direct protein delivery and synthesized mRNA. However, efficiency of reprogramming using integration-free methods is quite low in most cases.
Here, we present a method to isolate human iPSCs by using Sendai-virus (RNA virus) based reprogramming system. This reprogramming method shows consistent results and high efficiency in cost-effective manner.

Here, we present our established method to reprogram human somatic cells into transgene-free human iPSCs with Sendai virus, which shows consistent outcome and enhanced efficiency.

Eficiente generación, por actividad humana células madre pluripotentes de células somáticas humanas con virus Sendai-

A few years ago, the establishment of human induced pluripotent stem cells (iPSCs) ushered in a new era in biomedicine. Potential uses of human iPSCs ...

Cryo-electron Microscopy Specimen Preparation By Means Of a Focused Ion Beam

Here we present a protocol used to prepare cryo-TEM samples of Aspergillus niger spores, but which can easily be adapted for any number of microorganisms or solutions. We make use of a custom built cryo-transfer station and a modified cryo-SEM preparation chamber2. The spores are taken from a culture, plunge-frozen in a liquid nitrogen slush and observed in the cryo-SEM to select a region of interest. A thin lamella is then extracted using the FIB, attached to a TEM grid and subsequently thinned to electron transparency. The grid is transferred to a cryo-TEM holder and into a TEM for high resolution studies. Thanks to the introduction of a cooled nanomanipulator tip and a cryo-transfer station, this protocol is a straightforward adaptation to cryogenic temperature of the routinely used FIB preparation of TEM samples. As such it has the advantages of requiring a small amount of modifications to existing instruments, setups and procedures; it is easy to implement; it has a broad range of applications, in principle the same as for cryo-TEM sample preparation. One limitation is that it requires skillful handling of the specimens at critical steps to avoid or minimize contaminations.

Cryo Electron Microscopes, either Scanning (SEM) or Transmission (TEM), are widely used for characterization of biological samples or other materials with a high water content1. A SEM/Focused Ion Beam (FIB) is used to identify features of interest in samples and extract a thin, electron-transparent lamella for transfer to a cryo-TEM.

Cryo-Microscopía Electrónica de Preparación de Muestras por medio de un haz de iones focalizados

Here we present a protocol used to prepare cryo-TEM samples of Aspergillus niger spores, but which can easily be adapted for any number of microorganisms ...