저자는 유명 마커와 셀 블록의 절단 부분을 보여주는위한 크리스 차트, HT (ASCP)를 주셔서 감사합니다.

소개 : 이것은 HistoGelTM (써모 과학) (HG)를 사용하여 액체 기반 세포학 (LBC) 표본에서 셀 블록 준비 Shidham의 방법을 설명하는 동영상입니다. 다른 임의의 접근법에 비해 다음은이 프로토콜의 두 가지 중요한 기능은 단독으로 흩어져 느슨한 세포 (1-5)과 상대적으로 hypocellular 표본에서 셀 블록을 준비하고 있습니다. <ol><li> 이 프로토콜은 셀 블록의 절단 표면에 평행하게 비행기 따라 세포를 집중하는 단계를 포함한다. </li><li> 또한 다음과 같은 목적으로 두 가지를 제공 AV - 마커 (그림 1B)의 등대 같은 어두운 포함을 포함 : <ol style="list-style-type:lower-alpha;"><li> 세포가 집중되는의 수준을 시각화합니다. 어두운 색 신호를 절단하는 동안 노출되었을 때 관심의 세포와 세포 블록의 면적은 현재 histotechnologist에 의해 시각 수 있습니다. 모니터 이러한 능력은 세포의 대부분 수준으로 절단하거나, 샘플 세포의 높은 농도와 수준에 너무 피상적인 절단하지에서 하나를 방지합니다. </li><li> 다른 슬라이드에 직렬 셀 블록 섹션에 위치 참조 지점 역할을합니다. 이 기준점은 스키피오 접근 (6,7)와 좌표 immunoreactivity 패턴의 평가를위한 세포의 특정 세포 또는 그룹을 찾을 수 있도록 신호기 역할을합니다. </li></ol></li></ol> 프로토콜 (그림 2) 샘플 준비. <ol><li> 평평한 바닥 유리관 (15mm 직경 X 45mm) (2.4를 통해 그림 2.1)에 잔여 LBC 자궁 경부의 세포학 표본을 전송합니다. 큰 플라스틱 캐리어 튜브 (28 X 85mm)과 원심 분리기에 유리 튜브를 놓습니다. 캐리어 튜브에서 유리 바닥 튜브를 제거하고 표면에 뜨는를 부어. </li><li> 유리관은 다음 뒤덮힌 (다음 단계에서 가열 물을 spillage을 방지하기 위해)와 큰 평면 바닥 캐리어 플라스틱 튜브 안으로 배치됩니다 </li><li> 유리 튜브를 포함하는 캐리어 플라스틱 튜브 그러면, 덮인 원심 분리기에 배치 (세포가 유리관의 평평한 바닥에 수직으로 떨어질 수 있도록 선회 컵 아닌 고정 각도 컵을 함께), 그리고 1805에서 G (3000 RPM으로 늘인입니다 로터 반경 - 17cm) 오분 (그림 2.5)에 대한. </li><li> 튜브는 다음 원심에서 수직으로 제거하고 작은 유리관은 세포와 sedimented 펠렛을 방해하지 않고 더 큰 캐리어 플라스틱 튜브에서 집게로 제거됩니다. </li><li> 표본있는 유리관이 uncapped되고 뜨는은 하단에있는 침전물 세포의 평면 계층 (그림 2.6) 방해하지 않도록 돌봐 해제 붓고있다. </li></ol> 참조 좌표 AV - 마커의 포함과 더불어 젤 <ol><li> 어두운 신호를 AV - 마커 (약 2mm X 2mm 크기, 평면은 어두운 색, sectionable 소재 조각, 표면) (그림 3)은 유리관에 푯말 (그림 2.7)로 추가됩니다. </li><li> 중간 전력 10 초 동안 전자 레인지에 용해하여 HG의 나누어지는을 녹일. </li><li> 빨리 퇴적물과 튜브, 믹스로 용융 HG 0.5 ML를 추가하고 (HG는 응고 시작 수 있도록하지 않고 신속하게 다음 단계로 진행) (그림 2.8)을 해드리겠습니다. </li><li> 의 약 2.5 ML를 추가 따뜻한 (45 ° C) 캐리어 플라스틱 튜브에 물 (그림 2.9). </li><li> 작은 덮인 유리 튜브는 따뜻한 물로 플라스틱 튜브 안에 저장됩니다. (이 단계는 다음 단계 동안 응고의 HG를 유지하는 데 필요한 것입니다) (그림 2.9). </li><li> 캐리어 플라스틱 튜브 (세포가 유리관의 평평한 바닥에 수직으로 떨어질 수 있도록 선회 컵 아닌 고정 각도 컵 포함) 원심 분리기에 배치하고, 다섯을위한 1805에서 G를 (3000 RPM으로, 로터 반경 - 17cm) 늘인입니다 분. 이 원심 분리 단계의 목적은 AV - 마커를 밀고하고 가까이 최종 파라핀 임베디드 셀 블록 (그림 1D)의 절단 표면에 레이어로 세포를 집중하는 것입니다. </li><li> 튜브 그런 다음 하단에있는 샘플 세포와 sedimented 얇은 레이어를 방해하지 않도록 돌봐 원심에서 부드럽게 수직으로 제거됩니다. </li><li> 큰 플라스틱 튜브 uncapped되고 작은 유리관은 표본 세포의 퇴적물 층을 교란하지 않고 포셉에 의해 수직으로 제거됩니다. </li><li> 작은 유리관은 근사하고 HG (그림 2.11)을 응고 15 분 동안 수직 위치에 냉장 있습니다. </li></ol> 최종 처리를위한 시료로 젤의 버튼으로 셀 블록 제거 <ol><li> 바닥에 침전물 / 집중 시편의 레이어로 확정 H​​G 디스크는 주사기 (그림 2.12)와 23 게이지 바늘을 통해 포르말린 10 % squirting하여 평면 바닥 유리관에서 dislodged 수 있습니다. </li><li> 바늘은 표본 (그림 2.12)와 확정 H​​G 디스크의 주변에있는 튜브의 측면을 따라 삽입됩니다. </li><li> needl포르말린은 천천히 주사기를 통해 밀려있는 동안 전자는 튜브의 측면을 따라 회전합니다. 어두운 색 신호를 AV - 마커와 유리관의 평평한 바닥 (그림 2.12)에서에 집중 표본과 함께 HG 버튼의 분리에서 발생합니다. </li><li> 셀 블록 (표본 세포로 겔 버튼) 다음 표시 카세트에 위치하고 파라핀 임베디드 셀 블록 (그림 2.13)를 준비하는 조직 처리를위한 제출합니다. </li></ol> 포함하고 시편의 절단 <ol><li> 디스크 표면 가공으로 다운 어두운 비콘 마커 사이드 (그림 1)과 파라핀에 모두 담겨있다. </li><li> 신호를 노출하고 명확하게 볼 수 있습니다와 같은 블록은 어두운 색깔 마커까지 AV - sectioned입니다. </li><li> 서너 마이크론 섹션은 표본에서 단독으로 흩어져있는 세포의 대부분을 포함한다이 수준에서 절단됩니다. </li><li> 섹션이 추가로 얼룩, immunohistochemical 얼룩, 또는 표시 다른 시험은 유리 슬라이드에 저장됩니다. 섹션을 장착에 사용할 슬라이드의 유형을 포함하여이 테스트를위한 프로토콜이 다를 수 있습니다. 일반적으로 immunostaining위한 코팅 슬라이드는 immunostaining 단계 중에 부유하고 슬라이드에서 섹션의 손실을 방지하는 데 사용됩니다. </li></ol> (알파벳 순서) 사용 약어 : CISH, 원위치 하이브리드화 시험 chromogenic, 생선, 형광등 원위치 하이브리드화 시험, FFPE, 포르말린 - 고정 파라핀 - 임베디드, FNA, 괜찮 바늘 흡인, HG, HistoGel ™ (써모 과학); LBC, 액체 기반 세포학, PCR 효소의 연쇄 반응; <img src="/files/ftp_upload/1316/1382fig1.jpg" alt="그림 1" /> 그림 1. 셀 블록의 구조는 Shidham의 프로토콜에 의해 준비. <img src="/files/ftp_upload/1316/1382fig2.jpg" alt="그림 2" /> 그림 2. Shidham의 프로토콜에 의해 LBC 표본에서 셀 블록을 준비 서로 다른 단계의 요약. <img src="/files/ftp_upload/1316/1382fig3.jpg" alt="그림 3" /> 그림 3. 바나나 껍질에서 AV - 마커의 작성. <img src="/files/ftp_upload/1316/1382fig4.jpg" alt="그림 4" /> 그림 4.와 AV - 마커없이 셀 블록 및 섹션의 비교. <img src="/files/ftp_upload/1316/1382fig5.jpg" alt="그림 5" /> 그림 5. AV - 마커과 않고 셀 블록 섹션의 cellularity 비교.

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	<li>Shidham, V. B., Epple, J., Shidham, V. B., Atkinson, B. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chapter+14,+Appendix+I:+Collection+and+processing+of+effusion+fluids+for+cytopathologic+evaluation.">Chapter 14, Appendix I: Collection and processing of effusion fluids for cytopathologic evaluation.</a> Cytopathologic Diagnosis of Serous Fluids. , .</li><li>Varsegi, G., D'Amore, K., Shidham, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=p16INK4a+Immunocytochemistry+as+an+Adjunct+to+Cervical+Cytology+-+Potential+Reflex+Testing+on+Specially+Prepared+Cellblocks+from+Residual+Liquid+Based+Cytology+(LBC)+Specimens.">p16INK4a Immunocytochemistry as an Adjunct to Cervical Cytology - Potential Reflex Testing on Specially Prepared Cellblocks from Residual Liquid Based Cytology (LBC) Specimens.</a> Modern Pathology 22: 98th Annual Meeting of United States and Canadian Academy of Pathology. , 97a-97a (2009).</li><li>Nigro, K., Tynski, Z., Wasman, J., Abdul-Karim, F., Wang, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+cell+block+preparation+methods+for+nongynecologic+ThinPrep+specimens.">Comparison of cell block preparation methods for nongynecologic ThinPrep specimens.</a> Diagn Cytopathol. 35, 640-643 (2007).</li><li>Saleh, H. A., Hammoud, J., Zakaria, R., Khan, A. Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+Thin-Prep+and+cell+block+preparation+for+the+evaluation+of+Thyroid+epithelial+lesions+on+fine+needle+aspiration+biopsy.">Comparison of Thin-Prep and cell block preparation for the evaluation of Thyroid epithelial lesions on fine needle aspiration biopsy.</a> CytoJournal. 5, 3-3 (2008).</li><li>Kyroudi, A., Paefthimiou, M., Symiakaki, H., Mentzelopoulou, P., Voulgaris, Z., Karakitsos, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Increasing+diagnostic+accuracy+with+a+cell+block+preparation+from+thin-layer+endometrial+cytology:+a+feasibility+study.">Increasing diagnostic accuracy with a cell block preparation from thin-layer endometrial cytology: a feasibility study.</a> Acta Cytol. 50, 63-69 (2006).</li><li>Atkinson, B. F., Shidham, V. B., Atkinson, B. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chapter+5:+Immunocytochemistry+of+effusion+fluids:+introduction+to+SCIP+approach+(Chapter+5.">Chapter 5: Immunocytochemistry of effusion fluids: introduction to SCIP approach (Chapter 5.</a> Cytopathologic Diagnosis of Serous Fluids. , (2007).</li><li>Shidham, V. B., Shidham, V. B., Atkinson, B. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chapter+15,+Appendix+II:+Immunocytochemistry+of+effusions+processing+and+commonly+used+immunomarkers.">Chapter 15, Appendix II: Immunocytochemistry of effusions processing and commonly used immunomarkers.</a> Cytopathologic Diagnosis of Serous Fluids. , (2007).</li></ol>

셀 블록은 다양한 세포학의 표본 (1) 평가를위한 유용한 도구입니다. 가장 중요한 표본의 구조물 세부 정보 이외에, 셀 블록은 immunocytochemistry과 같은 부수적인 연구, chromogenic / 형광등 원위치 하이브리드화 시험 (물고기 / CISH) 및 - 현장 PCR의 평가를 위해 수 있습니다. 셀 블록의 준비를위한 다양한 방법이 설명되어 있습니다. 그러나 이러한 대부분은 상대적으로 많은 세포를 포함하고 조직 FNA aspirates에서 같은 microfragments와 같은 effusions (1,3,4,5) 같은 묽은 유체와 비 gynecologic 세포학의 표본에 적합합니다. 셀 블록 주로 immunocytochemical 평가를위한 기회를 제공하기 때문에, 그들의 처리되도록이면 포르말린 고정 파라핀 - - 임베디드 (FFPE) 조직의와 유사해야합니다. 결국 셀 블록 섹션의 immunocytochemical 평가 후 얻은 결과는 FFPE 조직 섹션에서 주로 수행 출판 문학 가진 사람에 비해입니다. 프로토콜의 모든 변경은 잠재적으로 손상시키고 다른 fixatives 및 일상 FFPE에 사용되는 이외의 시약 시퀀스를 통해 처리 세포 블록에서 얻어진 결과의 유효성을 파기할. 일부 상업적인 기술은 다른 정착액 - 시약에 노출 노출의 프로토콜을 통해 처리 단점을 가지고 있습니다. 셀 블록 준비 다양한 방법 침전물 및 조직 조각의 상당 수량 표본 사용할 수 있습니다. 주로, 집중 퇴적물은 어떤 젤 또는 응고 원리에 의해 지원됩니다. 기동성 버튼은 다음 수술 병리 표본 / biopsies 같은 처리 후 파라핀에 모두 담겨있다. 사용하는 젤은 젤라틴, 한천, 피브리노겐 / 플라즈마 - 트롬빈과 같은 HG 같은 다른 상업 젤이 포함되어 있습니다. 집중의 방법은 원심 분리하여 침전물의 단순한 pelleting에서 세포막을 따라 다양한 종류의 세포의 농도에 따라 다릅니다. 예는 다음과 같습니다 Milipore, collodin (Celloidin) 가방이나 유리 슬라이드 (1)에 세포학 얼룩으로부터 세포를 근근이 살아가고 있습니다. 또한 한천과 젤라틴의 다른 조합을 시도하여 젤 다양한 평가했다. 조합 중 누구 한 조각의 시편에서 포함된 세포로 확정 젤의 쉽게 기동성 디스크를 얻기 위해 회사 충분한 일관성을 달성하지 않습니다. HG 적절한 일관성을 보여주 우리의 경험 HG 셀 블록 섹션에 immunostaining 결과는 우수했다. 상기와 같은 cervicovaginal 세포학에 대한 액체 기반 세포학 (LBC) 표본이 아닌 gynecologic 표본보다 일반적으로 더 적은 세포 수 있습니다. 또한, gynecologic LBC의 표본이 주로 cervicovaginal 점막에서 각각 흩어져있는 피부 박피 피상적인 세포가 포함되어 있습니다. 이것 때문에, 셀 블록 섹션 내에서 해당 cellularity는 특별한 방법없이는 달성되지 않을 수 있습니다. 이들은 단독으로 블록의 세포 구성 요소를 분산과 같은 섹션 절단 동안 histotechnologist에서 볼 수없는, 세포 부분에 나타나는 시작되는 수준은 중 대부분의 세포와 수준 과거 절단이나하지, 평가 수 없으며, 놓칠 수 있습니다 샘플 세포의 높은 농도 (그림 4)와 수준에 깊은만큼 절단. Shidham의 프로토콜은 매체 및 일반 실험실 장비 (2) (그림 2)를 포함으로 HG를 사용하여 이러한 문제를 모두 해결할 수 있습니다. 이 프로토콜은 두 가지 주요 기능 (그림 1) 다음 포함 : <ol><li> 농도와 인접하고 셀 블록 (그림 5)의 절단 표면에 평행하게 좁은 비행기에서 단독으로 흩어져있는 세포의 정렬. </li><li> 푯말로 등대처럼 어둠 AV - 마커의 포함. 이것은 다음과 같은 기능 달성을위한 중요 : <ol style="list-style-type:lower-alpha;"><li> 식별 및 세포가 세포 블록에 집중되어있는의 수준을 모니터링. 어두운 색깔 정작의 노출은 셀 블록에 단독으로 흩어져있는 세포의 대부분은 (그림 4)에 위치한 것으로 예상되는의 수준을 강조 표시합니다.이 방지 overcutting (대부분의 세포와 레벨 지난 커팅) 또는 (샘플 세포의 높은 농도와 수준에 깊은만큼 절단되지 않음) undercutting 셀 블록에서 높은 농도로 해당 셀 블록 수준에서 섹션의 선택을 허용 세포. </li><li> 섹션에있는 어두운 색 푯말도 다른 슬라이드에있는 셀 블록 (그림 4)의 다양한 시리얼 섹션에 똑같은 세포를 조사하고 식별하는 참조 지점 역할을합니다. 통역과 스키피오 방식으로 특정 세포의 이러한 immunoprofile 다른 섹션 (6,7)에서 동일한 세포를 따라 좌표 속성을 평가하면서이 중요합니다. </li></ol></li></ol> 하지만 OUR 프로토콜 표준화 및 액체 기반의 자궁 경부 세포학의 표본에 대한보고, 그것도 또한 같은 유출 유체, FNA, brushings, 낭종 컨텐츠 등 다른 많은 비 gynecologic 표본의 진단 수율을 향상시키는 데 사용할 수있는 AV 마커 향상 촉진 것입니다 이러한 표본의 셀 블록 섹션의 immunohistochemical 평가하는 동안 스키피오 방식의 응용 프로그램을 만듭니다. 퍼가기 매체는 관련 절차에 적절한 수정을 다른 시약에 의해 바뀔 수 있습니다. HG는 실온 (1)에서 트롬빈에 의해 gelled 수 플라즈마 (피브리노겐)에 의해 대체될 수 있습니다.

cell block preparation from cytology specimen with predominance of individually scattered cells

이 동영상은 개별적으로 흩어져 세포와 작은 세포 그룹을 포함하는 액체 기반 cervicovaginal 세포학의 표본에서 셀 블록의 준비 Shidham의 방법을 보여줍니다. 이 기술은 기존의 실험실 장비 HistoGel (써모 과학)를 사용합니다. 셀 블록 섹션의 사용이 아닌 gynecologic 세포학 평가를위한 가치있는 부수적인 도구입니다. 그들은 병변의 아키텍처를 포함한 추가 morphologic 표본 세부 공부를 cytopathologist을 가능하게합니다. 가장 중요한 것은, 그들은 원위치 하이브리드화 시험 (물고기 / CISH) 및 원위치 중합 효소의 연쇄 반응 (PCR)은 같은 immunocytochemistry 같은 부수적인 연구의 평가를 위해 수 있습니다. 전통적인 셀 블록 준비 기술은 대부분 일반적으로 신체 유체 effusions 및 미세 바늘 흡인의 biopsies위한 비 gynecologic 세포학의 표본에 적용되었습니다. 액체 기반 cervicovaginal 표본은 많은 개인 흩어져 세포와의 비 gynecologic 대응보다 상대적으로 적은 세포 수 있습니다. 이 때문에, 셀 블록 섹션 내에 적절한 cellularity는 달성하기 어렵습니다. 또한, 블록을 sectioning histotechnologist은 세포가 가장 높은 농도에있는의 수준을 시각화 수 없습니다. 따라서 섹션이 테스트를 위해 유리 슬라이드로 전송하기 위해 선택할 수있는의 적절한 수준을 모니터링하기가 어렵습니다. 그 결과, 관심의 세포와 세포 블록의 지역 중 과거의 절단이나 깊이만큼 절단하지 않음으로써, 놓칠 수 있습니다. Shidham의 방법 현재 프로토콜은 이러한 문제를 해결합니다. 이 프로토콜은 표준화와 gynecologic 액체 기반 세포학의 표본에 대해보고 있지만, 그것은 이러한 세포 블록 섹션에 진단 자료의 품질 향상을위한 유출의 체액, FNA, brushings, 낭종 내용 등 비 gynecologic 표본에도 적용할 수 있습니다.

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Cell Block Preparation from Cytology Specimen with Predominance of Individually Scattered Cells

개별적으로 흩어져 세포와 작은 세포 그룹을 포함하는 세포학의 표본에서 AV - 마커와 셀 블록의 준비 Shidham의 방법.

개별적으로 흩어져 셀의 우위와 세포학 표본에서 셀 블록 준비

This video demonstrates Shidham's method for preparation of cell blocks from liquid based cervicovaginal cytology specimens containing individually ...

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Research

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Biology

73.4K 조회수.  University of Wisconsin - Milwaukee. 개별적으로 흩어져 세포와 작은 세포 그룹을 포함하는 세포학의 표본에서 AV - 마커와 셀 블록의 준비 Shidham의 방법.

비디오: Cell Block Preparation from Cytology Specimen with Predominance of Individually Scattered Cells

Preparation of Primary Acute Lymphoblastic Leukemia Cells in Different Cell Cycle Phases by Centrifugal Elutriation

The ability to synchronize cells has been central to advancing our understanding of cell cycle regulation. Common techniques employed include serum deprivation; chemicals which arrest cells at different cell cycle phases; or the use of mitotic shake-off which exploits their reduced adherence. However, all of these have disadvantages. For example, serum starvation works well for normal cells but less well for tumor cells with compromised cell cycle checkpoints due to oncogene activation or tumor suppressor loss. Similarly, chemically-treated cell populations can harbor drug-induced damage and show stress-related alterations. A technique which circumvents these problems is counterflow centrifugal elutriation (CCE), where cells are subjected to two opposing forces, centrifugal force and fluid velocity, which results in the separation of cells on the basis of size and density. Since cells advancing through the cycle typically enlarge, CCE can be used to separate cells into different cell cycle phases. Here we apply this technique to primary acute lymphoblastic leukemia cells. Under optimal conditions, an essentially pure population of cells in G1 phase and a highly enriched population of cells in G2/M phases can be obtained in excellent yield. These cell populations are ideally suited for studying cell cycle-dependent mechanisms of action of anticancer drugs and for other applications. We also show how modifications to the standard procedure can result in suboptimal performance and discuss the limitations of the technique. The detailed methodology presented should facilitate application and exploration of the technique to other types of cells.

This protocol describes the use of centrifugal elutriation to separate primary acute lymphoblastic leukemia cells into different cell cycle phases.

원심 Elutriation에 의해 다른 세포 주기 단계에서 기본 급성 림프 구성 백혈병 세포의 준비

The ability to synchronize cells has been central to advancing our understanding of cell cycle regulation. Common techniques employed include serum ...

연구

암 연구학

Micromanipulation of Circulating Tumor Cells for Downstream Molecular Analysis and Metastatic Potential Assessment

Blood-borne metastasis accounts for&#160;most cancer-related deaths and involves circulating tumor cells (CTCs) that are successful in establishing new tumors at distant sites. CTCs are found in the bloodstream of patients as single cells (single CTCs) or as multicellular aggregates (CTC clusters and CTC-white blood cell clusters), with the latter displaying a higher metastatic ability. Beyond enumeration, phenotypic and molecular analysis is extraordinarily important to dissect CTC biology and to identify actionable vulnerabilities. Here, we provide a detailed description of a workflow that includes CTC immunostaining and micromanipulation, ex vivo culture to assess&#160;proliferative and survival capabilities of individual cells, and in vivo metastasis-formation assays. Additionally, we provide a protocol to achieve the dissociation of CTC clusters into individual cells and the investigation of intra-cluster heterogeneity. With these approaches, for instance, we precisely quantify survival and proliferative potential of single CTCs and individual cells within CTC clusters, leading us to the observation that cells within clusters display better survival and proliferation in ex vivo cultures compared to single CTCs. Overall, our workflow offers a platform to dissect the characteristics of CTCs at the single cell level, aiming towards the identification of metastasis-relevant pathways and a better understanding of CTC biology.

Here, we present an integrated workflow to identify phenotypic and molecular features that characterize circulating tumor cells (CTCs). We combine live immunostaining and robotic micromanipulation of single and clustered CTCs with single cell-based techniques for downstream analysis and assessment of metastasis-seeding ability.

하류 분자 분석 및 전이성 전위 평가를 위한 순환 종양 세포의 미세 조작

Blood-borne metastasis accounts for&#160;most cancer-related deaths and involves circulating tumor cells (CTCs) that are successful in establishing new ...

Cell Fractionation of U937 Cells by Isopycnic Density Gradient Purification

This protocol describes a method to obtain subcellular protein fractions from mammalian cells using a combination of detergents, mechanical lysis, and isopycnic density gradient centrifugation. The major advantage of this procedure is that it does not rely on the sole use of solubilizing detergents to obtain subcellular fractions. This makes it possible to separate the plasma membrane from other membrane-bound organelles of the cell. This procedure will facilitate the determination of protein localization in cells with a reproducible, scalable, and selective method. This method has been successfully used to isolate cytosolic, nuclear, mitochondrial, and plasma membrane proteins from the human monocyte cell line, U937. Although optimized for this cell line, this procedure may serve as a suitable starting point for the subcellular fractionation of other cell lines. Potential pitfalls of the procedure and how to avoid them are discussed as are alterations that may need to be considered for other cell lines.

This fractionation protocol will allow researchers to isolate cytoplasmic, nuclear, mitochondrial, and membrane proteins from mammalian cells. The latter two subcellular fractions are further purified via isopycnic density gradient.

아이소피크닉 밀도 구배 정제에 의한 U937 세포의 세포 분획

This protocol describes a method to obtain subcellular protein fractions from mammalian cells using a combination of detergents, mechanical lysis, and ...

생화학

Collection, Isolation, and Flow Cytometric Analysis of Human Endocervical Samples

Despite the public health importance of mucosal pathogens (including HIV), relatively little is known about mucosal immunity, particularly at the female genital tract (FGT). Because heterosexual transmission now represents the dominant mechanism of HIV transmission, and given the continual spread of sexually transmitted infections (STIs), it is critical to understand the interplay between host and pathogen at the genital mucosa. The substantial gaps in knowledge around FGT immunity are partially due to the difficulty in successfully collecting and processing mucosal samples. In order to facilitate studies with sufficient sample size, collection techniques must be minimally invasive and efficient. To this end, a protocol for the collection of cervical cytobrush samples and subsequent isolation of cervical mononuclear cells (CMC) has been optimized. Using ex vivo flow cytometry-based immunophenotyping, it is possible to accurately and reliably quantify CMC lymphocyte/monocyte population frequencies and phenotypes. This technique can be coupled with the collection of cervical-vaginal lavage (CVL), which contains soluble immune mediators including cytokines, chemokines and anti-proteases, all of which can be used to determine the anti- or pro-inflammatory environment in the vagina.

The use of cytobrush sampling to collect lymphocytes and monocytes from the endocervix is a minimally invasive technique that provides samples for analysis of female genital tract immunity. In this protocol, we describe the collection of cytobrush samples and immune cell isolation for flow cytometry assays.

컬렉션, 격리, 인간 자궁 경부 샘플의 유세포 분석

Despite the public health importance of mucosal pathogens (including HIV), relatively little is known about mucosal immunity, particularly at the female ...

의학

Isolation and Characterization of a Head and Neck Squamous Cell Carcinoma Subpopulation Having Stem Cell Characteristics

Despite advances in the understanding of head and neck squamous cell carcinomas (HNSCC) progression, the five-year survival rate remains low due to local recurrence and distant metastasis. One hypothesis to explain this recurrence is the presence of cancer stem-like cells (CSCs) that present inherent chemo- and radio-resistance. In order to develop new therapeutic strategies, it is necessary to have experimental models that validate the effectiveness of targeted treatments and therefore to have reliable methods for the identification and isolation of CSCs. To this end, we present a protocol for the isolation of CSCs from human HNSCC cell lines that relies on the combination of two successive cell sortings performed by fluorescence activated cell sorting (FACS). The first one is based on the property of CSCs to overexpress ATP-Binding Cassette (ABC) transporter proteins and thus exclude, among others, vital DNA dyes such as Hoechst 33342. The cells sorted with this method are identified as a &#34;side population&#34; (SP). As the SP cells represent a low percentage (&#60;5%) of parental cells, a growing phase is necessary in order to increase their number before the second cell sorting. The next step allows for the selection of cells that possess two other HNSCC stem cell characteristics i.e. high expression level of the cell surface marker CD44 (CD44high) and the over-expression of aldehyde dehydrogenase (ALDHhigh). Since the use of a single marker has numerous limitations and pitfalls for the isolation of CSCs, the combination of SP, CD44 and ALDH markers will provide a useful tool to isolate CSCs for further analytical and functional assays requiring viable cells. The stem-like characteristics of CSCs was finally validated in vitro by the formation of tumorispheres and the expression of &#946;-catenin.

Understanding the role of cancer stem-like cells in tumor recurrence and resistance to therapies has become a topic of great interest in the last decade. This article describes the isolation and characterization of the sub-population of cancer stem-like cells from head and neck squamous carcinoma cell lines (HNSCC).

머리와 목 편평​​ 상피 세포 암의 모집단 갖는 줄기 세포 특성의 분리 및 특성

Despite advances in the understanding of head and neck squamous cell carcinomas (HNSCC) progression, the five-year survival rate remains low due to local ...

Chromosome Preparation From Cultured Cells

Chromosome (cytogenetic) analysis is widely used for the detection of chromosome instability. When followed by G-banding and molecular techniques such as fluorescence in situ hybridization (FISH), this assay has the powerful ability to analyze individual cells for aberrations that involve gains or losses of portions of the genome&#160;and rearrangements involving one or more chromosomes. In humans, chromosome abnormalities occur in approximately 1 per 160 live births1,2, 60-80% of all miscarriages3,4, 10% of stillbirths2,5, 13% of individuals with congenital heart disease6, 3-6% of infertility cases2, and in many patients with developmental delay&#160;and birth defects7. Cytogenetic analysis of malignancy is routinely used by researchers and clinicians, as observations of clonal chromosomal abnormalities have been shown to have both diagnostic and prognostic significance8,9.&#160; Chromosome isolation is invaluable for gene therapy and stem cell research of organisms including nonhuman primates and rodents10-13.
Chromosomes can be isolated from cells of live tissues, including blood lymphocytes, skin fibroblasts, amniocytes, placenta, bone marrow, and tumor specimens. Chromosomes are analyzed at the metaphase stage of mitosis, when they are most condensed and therefore more clearly visible. The first step of the chromosome isolation technique involves the disruption of the spindle fibers by incubation with Colcemid, to prevent the cells from proceeding to the subsequent anaphase stage. The cells are then treated with a hypotonic solution and preserved in their swollen state with Carnoy&#39;s fixative. The cells are then dropped on to slides and can then be utilized for a variety of procedures. G-banding involves trypsin treatment followed by staining with Giemsa to create characteristic light and dark bands. The same procedure to isolate chromosomes can be used for the preparation of cells for procedures such as fluorescence in situ hybridization (FISH), comparative genomic hybridization (CGH), and spectral karyotyping (SKY)14,15.

Chromosomes can be isolated from live cells such as lymphocytes or skin fibroblasts, and from organisms including humans or mice. These chromosome preparations can be further utilized for routine G-banding and molecular cytogenetic procedures such as fluorescence in situ hybridization (FISH), comparative genomic hybridization (CGH), and spectral karyotyping (SKY).

배양 세포에서 염색체 준비

Chromosome (cytogenetic) analysis is widely used for the detection of chromosome instability. When followed by G-banding and molecular techniques such as ...

생물학

An Alternative Approach for Sample Preparation with Low Cell Number for TEM Analysis

Transmission electron microscopy (TEM) provides details of the cellular organization and ultrastructure. However, TEM analysis of rare cell populations, especially cells in suspension such as hematopoietic stem cells (HSCs), remains limited due to the requirement of a high cell number during sample preparation. There are a few cytospin or monolayer approaches for TEM analysis from scarce samples, but these approaches fail to get significant quantitative data from the limited number of cells. Here, an alternative and novel approach for sample preparation in TEM studies is described for rare cell populations that enables quantitative analysis.
A relatively low cell number, i.e., 10,000 HSCs, was successfully used for TEM analysis compared to the millions of cells typically used for TEM studies. In particular, Evans blue staining was performed after paraformaldehyde-glutaraldehyde (PFA-GA) fixation to visualize the tiny cell pellet, which facilitated embedding in agarose. Clusters of numerous cells were observed in ultra-thin sections. The cells had a well preserved morphology, and the ultra-structural details of the Golgi complex and several mitochondria were visible. This efficient, easy and reproducible protocol allows sample preparation from a low cell number and can be used for qualitative and quantitative TEM analysis on rare cell populations from limited biological samples.

Here, we present a protocol to prepare samples with low cell numbers for transmission electron microscopy (TEM) analysis.

TEM 분석을위한 낮은 셀 번호와 샘플 준비를위한 다른 방법

Transmission electron microscopy (TEM) provides details of the cellular organization and ultrastructure. However, TEM analysis of rare cell populations, ...

Multiome 10X 유전체학 분석을 위한 고품질 시료 전처리

High-Quality Brain and Bone Marrow Nuclei Preparation for Single Nuclei Multiome Assays

Single-cell analysis has become the approach of choice for unraveling the complexity of biological processes that require assessing the variability of individual cellular responses to treatment or infection with single-cell resolution. 
Many techniques for single-cell molecular profiling have been developed over the past 10 years, and several dedicated technologies have been commercialized. The 10X Genomics droplet-based single-cell profiling is a widespread technology that offers ready-to-use reagents for transcriptomic and multi-omic single-cell profiling. The technology includes workflows for single-cell and single-nuclei RNA sequencing (scRNA-Seq and snRNA-Seq, respectively), scATAC-Seq, single-cell immune profiling (BCR/TCR sequencing), and multiome. The latter combines transcriptional (scRNA-Seq) and epigenetic information (scATAC-Seq) coming from the same cell. 
The quality (viability, integrity, purity) of single-cell or single-nuclei suspensions isolated from tissues and analyzed by any of these approaches is critical for generating high-quality data. Therefore, the sample preparation protocols should be adapted to the particularities of each biological tissue and ensure the generation of high-quality cell and nuclei suspensions.
This article describes two protocols for preparing brain and bone marrow samples for the downstream multiome 10X Genomics pipeline. The protocols are performed stepwise and cover tissue dissociation, cell sorting, nuclei isolation, and quality control of prepared nuclei suspension that is used as starting material for cell partitioning and barcoding, library preparation, and sequencing. These standardized protocols produce high-quality nuclei libraries and robust and reliable data.

저자 스포트라이트: 단일 세포 분석을 통한 생물의학 연구의 발전 

The success of single-cell/single-nuclei transcriptomics and multi-omics largely depends on the quality of cells/nuclei. Therefore, isolating cells/nuclei from tissue and their purification must be highly standardized. This protocol describes the preparation of nuclei from the brain and bone marrow for downstream single-nuclei multiome assay.

단일 핵 멀티옴 분석을 위한 고품질 뇌 및 골수 핵 준비

Single-cell analysis has become the approach of choice for unraveling the complexity of biological processes that require assessing the variability of ...

개별적으로 흩어져 셀의 우위와 세포학 표본에서 셀 블록 준비

요약

더 많은 비디오 탐색

원심 Elutriation에 의해 다른 세포 주기 단계에서 기본 급성 림프 구성 백혈병 세포의 준비

하류 분자 분석 및 전이성 전위 평가를 위한 순환 종양 세포의 미세 조작

아이소피크닉 밀도 구배 정제에 의한 U937 세포의 세포 분획

컬렉션, 격리, 인간 자궁 경부 샘플의 유세포 분석

머리와 목 편평 상피 세포 암의 모집단 갖는 줄기 세포 특성의 분리 및 특성

배양 세포에서 염색체 준비

TEM 분석을위한 낮은 셀 번호와 샘플 준비를위한 다른 방법

단일 핵 멀티옴 분석을 위한 고품질 뇌 및 골수 핵 준비

단일 핵 멀티옴 분석을 위한 고품질 뇌 및 골수 핵 준비

단일 핵 멀티옴 분석을 위한 고품질 뇌 및 골수 핵 준비

개별적으로 흩어져 셀의 우위와 세포학 표본에서 셀 블록 준비

요약

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아이소피크닉 밀도 구배 정제에 의한 U937 세포의 세포 분획

컬렉션, 격리, 인간 자궁 경부 샘플의 유세포 분석

머리와 목 편평​​ 상피 세포 암의 모집단 갖는 줄기 세포 특성의 분리 및 특성

배양 세포에서 염색체 준비

TEM 분석을위한 낮은 셀 번호와 샘플 준비를위한 다른 방법

단일 핵 멀티옴 분석을 위한 고품질 뇌 및 골수 핵 준비

단일 핵 멀티옴 분석을 위한 고품질 뇌 및 골수 핵 준비

단일 핵 멀티옴 분석을 위한 고품질 뇌 및 골수 핵 준비

머리와 목 편평 상피 세포 암의 모집단 갖는 줄기 세포 특성의 분리 및 특성