1. الصيانة : رصد الثقافات تحت المجهر <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إزالة واحد من الخلايا لوحة HES من الحاضنة 37 درجة مئوية ، وتقديمهم إلى المجهر. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> مراقبة المستعمرات في انخفاض القوة ، وذلك باستخدام 2X أو التكبير 5X ، لتقييم نوعية الثقافة عموما. لاحظ ما يلي : عادي اللون المتوسط ​​، وغياب أي تلوث مرئية ، عموما حجم مستعمرة ، والجودة والكثافة ، وأية ملاحظات أخرى. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ملاحظة يتغير لون المتوسطة. بسبب التغير في درجة الحموضة واستنفاد المواد المغذية في المتوسط ​​بعد الحضانة بين عشية وضحاها مع الخلايا HES ، سوف تغير من المتوسط ​​الى اللون الاحمر الى اللون &quot;القش&quot;. إذا كان المتوسط ​​تبدو الأرجواني ، حدث تحول الرقم الهيدروجيني الأساسية. إذا كان المتوسط ​​تبدو صفراء للغاية ، ويحمض المتوسط. قد المتوسطة الصفراء جدا أن تكون نتيجة المستعمرات مكتظة للغاية في البئر أو التلوث. وينبغي أن تظهر واضحة على المديين المتوسط ​​في جميع الأوقات. على الرغم من مستوى معين من حطام خلية في المتوسط ​​أمر طبيعي ، وينبغي لها أن تظهر أبدا غائما. إذا لوحظ على مستوى عال من حطام خلية ، الثقافة ليست صحية ، ويمكن أن تكون ملوثة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إذا كانت الثقافات لا تتطلب الصيانة أو الركض ، يمكن أن تؤخذ على مجلس الوزراء السلامة البيولوجية لتغذية (انظر القسم 2). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إذا كانت الثقافات تحتوي على أكثر من 10 ٪ تقريبا التفريق المستعمرات ، ينبغي أن الخلايا &quot;تنظيف&quot; من خلال إزالة يدويا مناطق متمايزة (انظر القسم 3). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إذا كانت تحتوي على ثقافات المستعمرات الكبيرة أو الكثيفة ، أو الطبقة المغذية MEF أكثر من 12 يوما من العمر ، ينبغي passaged الخلايا (انظر القسم 4). </li></ol> 2. تغذية خلايا HES <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> في خزانة السلامة البيولوجية العقيمة ، وإزالة غطاء الطبق الثقافة ونضح المتوسط ​​المستهلك. لا تسمح للطرف ماصة للمس أي جزء من لوحة أخرى غير مباشرة داخل الآبار. إذا كان هناك أي قلق من التلوث ، وتغير إلى ماصة جديدة معقمة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> باستخدام الماصة زجاجية معقمة ، إضافة كمية مناسبة من حرارة HES الخلية مستنبت لكل بئر. للثقافات في صفيحة 6 - جيدا ، إضافة 2.5 مل في المتوسط ​​أيضا. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> عودة إلى لوحة الحاضنة لتبقى عند 37 درجة مئوية و 5 ٪ CO 2. </li></ol> 3. إزالة التمايز من الثقافات الخلية HES <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تحويل 9 بوصة زجاج باستور ماصات في اختيار الأدوات التي صب على نصائح حول اللهب الحارق للرقابة من الكحول. تأكد من أن يتم إغلاق غيض من ماصة لمنع التلوث وتقريبه لتجنب خدش بلاستيكية الطبق الثقافة. تعقيم الأدوات قبل استخدامها التقاط باستخدام مصدر ضوء الأشعة فوق البنفسجية في مجلس الوزراء السلامة البيولوجية أو التقاط ضميمة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إزالة مناطق متمايزة. التمايز يحدث في كثير من الأحيان جزء فقط من مستعمرة HES الخلية ، وعادة على طول الحواف أو على شكل بقع معزولة في الوسط. إلا إذا كان جزء من مستعمرة هو التفريق ، فقط في منطقة متباينة يحتاج إلى إزالتها. ويمكن التمييز في كثير من الأحيان رفع قبالة لوحة في ورقة &quot;لزجة&quot; ، وأنه من المفيد لأول فصل خلايا متمايزة عن بقية مستعمرة عن طريق رسم خط من خلال مستعمرة مع نهاية أداة التقاط. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> مرة واحدة يتم فصل أجزاء من مستعمرة ، تنزلق برفق أداة التقاط على طول لوحة لفصل الخلايا غير المرغوب فيها. الحرص على عدم كشط بعيدا الكثير من الطبقة المغذية MEF بين المستعمرات في هذه العملية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> عندما تتم إزالة كافة الخلايا متمايزة عن لوحة (وعائمة في المتوسط) ، العودة الى مجلس الوزراء ثقافة السلامة البيولوجية. نضح المتوسط ​​تحتوي على خلايا متمايزة واستبدال الطازجة HES خلية متوسطة الثقافة. </li></ol> 4. الركض خلايا HES انزيم الحضانة <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> في خزانة السلامة البيولوجية العقيمة ، وإزالة غطاء الطبق الثقافة 6 - جيدا ونضح المتوسط ​​أمضى من الآبار لتكون passaged. لا تسمح للطرف ماصة للمس أي جزء من لوحة أخرى غير مباشرة داخل الآبار. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> باستخدام الماصة زجاجية معقمة ، إضافة 1 مل من الرابع إلى كل كولاجيناز تحسنت بشكل جيد لتكون passaged. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> عودة إلى لوحة الحاضنة 37 درجة مئوية لمدة 5 دقائق. </li></ol> القشط وتجمع خلايا HES <ol start="4" style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بعد حضانة الخلايا مع كولاجيناز ، ومراقبة المستعمرات تحت المجهر. ينبغي للانزيم يسبب تغيير خفية ولكن يمكن ملاحظتها في حواف المستعمرة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> في مجلس الوزراء السلامة البيولوجية ، ونضح بلطف الانزيم من كل بئر واستبدالها مع متوسط ​​2.0 مل HES ثقافة الخلية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تلميح لوحة ثقافة قليلا نحوك ويستغرق المتوسط ​​2.0 مل في البئر الأولى مع الزجاج الماصة 5 مل. عقد عمودي الماصة على الجزء السفلي من لوحة ، وتنزلق برفق طرف الماصة عبر بشكل جيد في حين الإفراج عن ببطء المتوسط. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> كرر القشط وpipettiأوقات الحركة نانوغرام 3-4 حتى كل من المستعمرات قد أزيلت من البئر. الماصة بلطف لتجنب تفكك المستعمرات في صغير جدا من القطع. عندما تم إزالة الخلايا من البئر الأولى ، وترك محتويات في البئر وتبدأ الخلايا كشط قبالة القرن المقبل أيضا. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> عندما تم كشط كل من الآبار لتكون passaged وحمام سباحة والمتوسطة التي تحتوي على قطع من كل مستعمرة جيدا في أنبوب معقم 15 مليلتر المخروطية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> شطف الآبار كشط بإضافة 1 مل من خلية HES مستنبت لكل بئر. جمع هذا شطف ونقل في أنبوب مخروطي الشكل. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الخلايا الماصة برفق في أنبوب لتفريق قطع مستعمرة تصل إلى الحجم المطلوب. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الطرد المركزي الخلايا لمدة 5 دقائق في غرام × 200 </li></ol> طلاء للخلايا الخلية HES <ol start="12" style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> في حين أن خلايا HES في جهاز الطرد المركزي ، وإعداد وحدة التغذية الجديدة MEF 6 - جيدا لوحة. التسمية مع لوحة المعلومات المناسبة الخلية HES : خط خلية جديدة مرور عدد وتاريخ إقراره. نضح المتوسط ​​MEF من الآبار وإضافة 1.0 مل PBS إلى كل بئر. دوامة بلطف عازلة حول الآبار ونضح غسل برنامج تلفزيوني. إضافة 1.5 مل الخلية HES مستنبت لكل بئر ووضع لوحة جانبا. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> عندما يتم الانتهاء من الخلايا HES الطرد المركزي ، ليصبح أنبوب يعود الى مجلس الوزراء السلامة البيولوجية. نضح لطاف ، والحرص على عدم تعكير صفو فضفاضة معبأة الخلية بيليه. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Resuspend الخلايا في بيليه مع المتوسط ​​بما فيه الكفاية ل1 مل HES المتوسطة الثقافة في الخلية بشكل جيد لتكون مطلية. عندما resuspend تنقسم الى 6 آبار جديدة ، وبيليه في المتوسط ​​6 مل. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بلطف وبشكل متساو إضافة 1 مل من التعليق على كل خلية مستعدة بشكل جيد من لوحة التغذية MEF. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وضع لوحة في الحاضنة 37 درجة مئوية والشريحة بعناية لوحة الأمام إلى الخلف ، وجنبا إلى جنب لتوزيعها بالتساوي على الخلايا في جميع أنحاء البئر. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> السماح للخلايا لنعلق على 37 درجة مئوية خلال الليل. </li></ol> 5. ممثل النتائج : غير متمايزة خلايا HES صغيرة ، ومعبأة بإحكام ، وعادة ما تتألف من انتشار أكبر وأكثر من الخلايا. ويمكن التفريق يحدث داخل مستعمرة (الشكل 1A) أو بين المستعمرات (الشكل 3B). ويمكن رؤية morhopologies مختلفة تحت التكبير منخفضة تحت المجهر. ومورفولوجيا الخلايا الجيدة ، كما رأينا في الشكل 2A ، ويحتوي على الصغيرة ، والخلايا معبأة بإحكام التي تنمو في أحادي الطبقة. وينبغي أن يكون الخلايا نظيفة ، حواف محددة ، مع قليل من دون تمييز. الخلايا هو موضح في الشكل 2B مستعدون لالركض ، ومكتظة الخلايا هو موضح في الشكل 2C. <img src="/files/ftp_upload/1427/1427fig1.jpg" alt="الشكل 1" /> الشكل 1. التمايز في الثقافات HES : (أ) التفريق بين مستعمرة (ب) التفريق بين المستعمرات. <img src="/files/ftp_upload/1427/1427fig2.jpg" alt="الشكل 2" /> الشكل 2. Morphologies ينظر في الثقافات HES. (أ) جيدة مورفولوجية الخلية (ب) الخلايا HES التي هي على استعداد لالركض (C) زنزانات مكتظة.

<ol>
	<li>Freshney, R. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Culture of Animal Cells: A Manual of Basic Technique. , (2005).</li></ol>

يجب الحفاظ على عقم في جميع الأوقات عند التعامل مع الخلايا HES. تنظيف وتعقيم مجلس الوزراء السلامة البيولوجية وجميع المعدات قبل استخدامها. يجب أن تتم تصفيته جميع الكواشف باستخدام 0.22 ميكرون تصفية حجم المسام قبل الاستخدام. استخدام antiboiotics في الثقافة خلية HES غير ضروري ويجب تجنبها. وينبغي أن تكون هناك بيئة منفصلة كمحطة اختيار المعين. يمكن أن العلبة المعقمة لتكون محطة الضميمة ثابت (مثل محطة عمل PCR) مع مصدر ضوء الأشعة فوق البنفسجية ، وهو غطاء تدفق الصفحي ، أو خزانة السلامة البيولوجية. وثمة حاجة إلى مجهر تشريح داخل محطة التقاط لمراقبة مستعمرات كما تتم إزالة مناطق متمايزة. يجب أن يتم تعديل لوحة من الزجاج الأمامي للسياج ثابت أو خزانة السلامة البيولوجية للسماح oculars من المجهر لتوسيع من خلال لوحة دون المساس تدفق الهواء المناسب والعقم. للحفاظ على صحة الخلايا HES الثقافات ، يجب passaged الخلايا في الوقت الأمثل ، وعادة كل 4-7 أيام. في هذا الوقت وصلت إلى أقصى حجمها المستعمرات وربما تبدأ في الدمج. ويمكن دمج المستعمرات زيادة معدل التمايز في الثقافة. تقسيم نسب الانخفاض عموما 1:03 حتي 1:05 ، اعتمادا على عدد من المستعمرات مطلي ، ومعدل التوسع ، وظروف الثقافة. سوف المستعمرات Overplated (نسبة منخفضة جدا تقسيم) دمج المحتمل قبل الأوان ، وتحتاج إلى passaged قبل ان تصل الى حجمها الأقصى. يجب passaged الثقافات على الطبقة المغذية MEF أن أكثر من 2 أسابيع من العمر إلى MEFs جديدة من شأنها أن تدعم النمو والانتشار غير متمايزة. منذ التمايز يحدث بشكل طبيعي في الخلية HES الثقافات ، ومن المتوقع أن كمية صغيرة. قد تمايز متكررة أو المفرط يحدث إذا الثقافات لا يتلقون الرعاية المناسبة. يجب تغذية الخلايا كل يوم ، ينبغي تجنب فرط بين الممرات. دائما استخدام الكواشف الطازجة. وينبغي استخدام كل MEFs ووسائل الإعلام والكواشف في غضون 14 يوما لتجنب نمو الخلايا غير المتمايزة HES. لا بد من فحص الكثير من الكواشف الجديدة ، مثل استبدال المصل خروج المغلوب ، وMEFs FBS ، وذلك قبل الاستخدام. تذكر انه سيتم نقل أي خلايا متمايزة لا تتم إزالة قبل الركض على ثقافات جديدة. أيضا ، في محاولة للحفاظ على الخلايا عند 37 درجة مئوية كلما أمكن ذلك. تقليل الوقت الذي يقضونه خارج الخلايا في الحاضنة (مثل المجهر على المسرح أو في مجلس الوزراء السلامة البيولوجية.) مرحلة ساخنة المجهر يمكن أن تكون مفيدة جدا إذا كانت الخلايا ستكون الحاضنة لفترات طويلة من الزمن. عند مراقبة الثقافات HES الخلية تحت المجهر ، وتقييم الجودة الشاملة لأول مرة وحجم مستعمرات عرضها باستخدام طاقة منخفضة (2X أو 5X) الهدف. إذا لاحظ خلايا متمايزة المحتمل في الطاقة منخفضة ، وتأكيد مورفولوجيا متباينة باستخدام هدفا أعلى التكبير (10X). فورا بعد إزالة التمايز ، قد حواف خشنة تظهر المستعمرات أو معطوب. احتضان المستعمرات في المتوسط ​​بين عشية وضحاها جديدة للسماح للخلايا غير متمايزة المتبقية للتعافي. دون التأثير على التمايز في الثقافة ، فإن هذه المستعمرات المتبقية مواصلة تتكاثر بشكل طبيعي. إذا كان ذلك ممكنا ، بدء التجارب باستخدام الخلايا منخفضة مرور HES. النمط النووي للخلايا قبل وبعد كل التجارب الكبرى.

<!DOCTYPE html PUBLIC "-//W3C//DTD XHTML 1.0 Transitional//EN" "http://www.w3.org/TR/xhtml1/DTD/xhtml1-transitional.dtd">
<html xmlns="http://www.w3.org/1999/xhtml" xml:lang="en" lang="en">	
		
		<div>
		<table border="1">
		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>D-MEM</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>11965-092</td>
<td>For MEF medium</td>
</tr>
<tr>
<td>Fetal Bovine Serum (FBS), Certified</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>16000-044</td>
<td>Heat-inactivated 
For MEF medium</td>
</tr>
<tr>
<td>D-MEM/F-12</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>11330-057</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Knockout&trade; Serum Replacement</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>10828-028</td>
<td>Pre-screen to ensure support of hES cells</td>
</tr>
<tr>
<td>bFGF</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Stemgent</td>
<td>03-0002</td>
<td>Use at [4 ng/mL] final</td>
</tr>
<tr>
<td>Non-essential Amino Acids</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>11140-050</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>L-glutamine</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>25030-081</td>
<td>200 mM (100X) 
Use at [1X] final
</td>
</tr>
<tr>
<td>PBS</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>14190-250</td>
<td>Without Ca2+ or Mg2+</td>
</tr>
<tr>
<td>Collagenase IV</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>17104-019</td>
<td>Make a fresh solution at 1 mg/mL in D-MEM/F-12</td>
</tr>
<tr>
<td>Gelatin</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>G1890</td>
<td>Type A, Porcine</td>
</tr>
<tr>
<td>Fetal Bovine Serum (FBS), Defined</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>HyClone</td>
<td>SH300.70.01</td>
<td>For freezing medium</td>
</tr>
<tr>
<td>6-well plates</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Nunc</td>
<td>140675</td>
<td>For general culture</td>
</tr>
<tr>
<td>4-well plates</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Nunc</td>
<td>176740</td>
<td>For thawing</td>
</tr>
<tr>
<td>5 mL glass pipets</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fisher</td>
<td>13-678-27E</td>
<td>Individually wrapped</td>
</tr>
<tr>
<td>15 mL conical tubes</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Corning</td>
<td>430052</td>
<td>Polypropylene</td>
</tr>
<tr>
<td>Pasteur pipettes</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fisher</td>
<td>13-678-20D</td>
<td>9&#x201D; glass</td>
</tr>		</tbody>
		</table>
		</div>

culture and maintenance of human embryonic stem cells  

يجب أن تراقب الجذعية الجنينية البشرية (HES) الخلايا ورعايتهم من أجل الحفاظ على صحة والثقافات غير متمايزة. في الحد الأدنى ، لا بد من تغذيتها ثقافات كل يوم عن طريق إجراء تغيير كامل المتوسطة لتجديد المغذيات المفقودة والحفاظ على ثقافات خالية من عوامل التفرقة غير المرغوب فيها. على الرغم من أن كمية صغيرة من التفريق أمر طبيعي ومتوقع في الثقافات الخلايا الجذعية ، ينبغي أن تكون ثقافة تنظيفها بشكل روتيني من قبل إزالة يدويا ، أو &quot;قطف&quot; مناطق متمايزة. تحديد وإزالة الزائدة من تمايز الثقافات الخلية HES وتقنيات أساسية في الحفاظ على صحة السكان من الخلايا.

Watch this Scientific Journal Video about Culture and Maintenance of Human Embryonic Stem Cells at JoVE.com

Culture and Maintenance of Human Embryonic Stem Cells

هذا البروتوكول يوضح كيفية المحافظة ، غير متمايزة صحية الجذعية الجنينية البشرية (ES) الخلايا.

الثقافة والمحافظة على الخلايا الجذعية الجنينية البشرية

Human embryonic stem (hES) cells must be monitored and cared for in order to maintain healthy, undifferentiated cultures. At minimum, the cultures must be ...

culture-and-maintenance-of-human-embryonic-stem-cells

Research

JoVE Journal

Biology

Culture and Maintenance of Human Embryonic Stem Cells  

47.5K Views.  Stemgent. هذا البروتوكول يوضح كيفية المحافظة ، غير متمايزة صحية الجذعية الجنينية البشرية (ES) الخلايا.

Video: Culture and Maintenance of Human Embryonic Stem Cells

Propagation of Human Embryonic Stem (ES) Cells

Propagation of Human Embryonic Stem ES Cells

انتشار الخلايا الجنينية البشرية (ES) الجذعية

Derivation of Human Embryonic Stem Cells by Immunosurgery

The ability of human embryonic stem cells to self-renew and differentiate into all cell types of 
the body suggests that they hold great promise for both medical applications and as a research 
tool for addressing fundamental questions in development and disease. Here, we provide a 
concise, step-by-step protocol for the derivation of human embryonic stem cells from embryos 
by immunosurgical isolation of the inner cell mass. 


The ability of human embryonic stem cells to self-renew and differentiate into all cell types of 
the body suggests that they hold great promise for both medical applications and as a research 
tool for addressing fundamental questions in development and disease. Here, we provide a 
concise, step-by-step protocol for the derivation of human embryonic stem cells from embryos 
by immunosurgical isolation of the inner cell mass.

اشتقاق الخلايا الجذعية الجنينية البشرية التي Immunosurgery

The ability of human embryonic stem cells to self-renew and differentiate into all cell types of 
the body suggests that they hold great promise for both ...

Probing for Mitochondrial Complex Activity in Human Embryonic Stem Cells

Mitochondria are cytoplasmic organelles that have a primary role in cellular metabolism and homeostasis, regulation of the cell signaling network, and programmed cell death. Mitochondria produce ATP, regulate the cytoplasmic redox state and Ca2+ balance, catabolize fatty acids, synthesize heme, nucleotides, steroid hormones, amino acids, and help assemble iron-sulfur clusters in proteins. Mitochondria also have an essential role in heat production. Mutations of the mitochondrial genome cause several types of human disorder. The accumulation of mtDNA mutations correlates with aging and is suspected to have an important role in the development of cancer. Due to their vitally important role in all cell types, the function of mitochondria must also be critical for stem cells. Key advances have been made in our understanding of stem cell viability, proliferation, and differentiation capacity. But the functional activity of stem cells, in particular their energy status, was not yet been studied in detail. Almost nothing is known about the mitochondrial properties of human embryonic stem cells (hESCs) and their differentiated precursor progeny. One way to understand and evaluate the role of mitochondria in hESC function and developmental potential is to directly measure the activity of mitochondrial respiratory complexes. Here, we describe high resolution clear native gel electrophoresis and subsequent in gel activity visualization as a method for analyzing the five respiratory chain complexes of hESCs.

In this video, we will show you how the mitochondrial respiratory chain complexes of human embryonic stem cells can be analyzed using in gel activity assays.

سبر للنشاط مجمع الميتوكوندريا في خلايا المنشأ الجنينية البشرية

Mitochondria are cytoplasmic organelles that have a primary role in cellular metabolism and homeostasis, regulation of the cell signaling network, and ...

Chromatin Immunoprecipitation from Human Embryonic Stem Cells

The functional and structural complexity of the myriad of cells in metazoan organisms arises from a small number of stem cells. Stem cells are characterized by two fundamental properties: self-renewal and multipotency that allows a stem cell to differentiate into virtually any cell type 1. The progression stem cell to differentiated cell is characterized by loss of multipotency, structural and morphological changes and the hierarchic activity of transcription factors and signaling molecules, whose activities establish and maintain cell-type specific gene expression patterns. At the molecular level, cell differentiation involves dynamic changes of the structure and composition of chromatin and the detection of those dynamic changes can provide valuable insights into the functional features of stem cells and the cell differentiation process 2,3. Chromatin is a highly compacted DNA-protein complex that forms when cells package chromosomal DNA with proteins, mainly histones 4. Stemcellness and cell differentiation has been correlated with the presence of specific arrays of regulatory proteins such as epigenetic factors, histone variants, and transcription factors 2,3,5.
 Chromatin immunoprecipitation (ChIP) provides a valuable method to monitor the presence of RNA, proteins, and protein modifications in chromatin 6,7. The comparison of chromatin from different cell types can elucidate dynamic changes in protein-chromatin associations that occur during cell differentiation.
Chromatin immunoprecipitation involves the purification of in vivo cross-linked chromatin. The isolated chromatin is reduced to smaller fragments by enzymatic digestion or mechanical force. Chromatin fragments are precipitated using specific antibodies to target proteins or protein and DNA modifications. The precipitated DNA or RNA is purified and used as a template for PCR or DNA microarray based assays. Prerequisites for a successful ChIP are high quality antibodies to the desired antigen and the availability of chromatin from control cells that do not express the target molecule. ChIP can correlate the presence of proteins, protein and RNA modifications, and RNA with specific target DNA, and depending on the choice of outread tool, detects the association of target molecules at specific target genes or in the context of an entire genome. The comparison of the distribution of proteins in the chromatin of differentiating cells can elucidate the dynamic changes of chromatin composition that coincide with the progression of cells along a cell lineage.

The differentiation of ESC coincides with cell-type specific changes in the structure and composition of chromatin. The detection of those changes provides valuable insights into the mechanisms that define stemcellness and cell differentiation. Chromatin immunoprecipitation (ChIP) represents a valuable method to dissect the molecular mechanisms underlying stem cell differentiation.

مناعي لونين من الخلايا الجذعية الجنينية البشرية

The functional and structural complexity of the myriad of cells in metazoan organisms arises from a small number of stem cells. Stem cells are ...

In vitro Labeling of Human Embryonic Stem Cells for Magnetic Resonance Imaging

Human embryonic stem cells (hESC) have demonstrated the ability to restore the injured myocardium. Magnetic resonance imaging (MRI) has emerged as one of the predominant imaging modalities to assess the restoration of the injured myocardium. Furthermore, ex-vivo labeling agents, such as iron-oxide nanoparticles, have been employed to track and localize the transplanted stem cells. However, this method does not monitor a fundamental cellular biology property regarding the viability of transplanted cells. It has been known that manganese chloride (MnCl2) enters the cells via voltage-gated calcium (Ca2+) channels when the cells are biologically active, and accumulates intracellularly to generate T1 shortening effect. Therefore, we suggest that manganese-guided MRI can be useful to monitor cell viability after the transplantation of hESC into the myocardium.
In this video, we will show how to label hESC with MnCl2 and how those cells can be clearly seen by using MRI in vitro. At the same time, biological activity of Ca2+-channels will be modulated utilizing both Ca2+-channel agonist and antagonist to evaluate concomitant signal changes.

In this video, we are showing how to label human embryonic stem cells (hESC) with manganese chloride (MnCl2) which can enter cells via voltage-gated calcium channels when the cells are biologically active. Additionally, we show the use of MnCl2 as cellular MRI contrast agent to determine the in vitro viability of hESC.

وصفها في المختبر من خلايا المنشأ الجنينية البشرية لتصوير بالرنين المغناطيسي

Human embryonic stem cells (hESC) have demonstrated the ability to restore the injured myocardium. Magnetic resonance imaging (MRI) has emerged as one of ...

Chromosomal Spread Preparation of Human Embryonic Stem Cells for Karyotyping

Although human embryonic stem cells (hESC) have been shown to present a stable diploid karyotype 1, many studies have reported that depending on culture conditions they become prone to acquire chromosomal anomalies such as addition of whole or parts of chromosomes. Indeed, during long-term culture, karyotypic alterations are observed when enzymatic or chemical dissociation are used 2,3,4, while manual dissection of colonies for passaging retains a stable karyotype 5. Besides, changes in the environment such as the removal of feeder cells also seem to compromise the genetic integrity of hESC 3,6. Once chromosomal alterations could affect cellular physiology, the characterization of the genetic integrity of hESC in vitro is crucial considering hESC as an essential tool in embryogenesis studies and drug testing. Furthermore, for future therapeutic purposes chromosomal changes are a real concern as it is frequently associated to carcinogenesis.
Here we show a simple and useful method to obtain high quality chromosome spreads for subsequent analysis of chromosome set by G-banding, FISH, SKY or CGH techniques 7,8. We recommend checking the chromosomal status routinely with intervals of 5 passages in order to monitor the appearance of translocations and aneuploidies
Priscila Britto and Rafaela Sartore contributed equally to the paper.

Karyotyping is a simple and useful technique widely used for detecting genetic alterations. Here we describe a step by step protocol for chromosome spread preparation of human embryonic stem cells for monitoring the chromosomal status of these cells maintained in culture.

الكروموسومات التحضير انتشار الخلايا الجذعية الجنينية البشرية لKaryotyping

Although human embryonic stem cells (hESC) have been shown to present a stable diploid karyotype 1, many studies have reported that depending on culture ...

Freezing and Thawing Human Embryonic Stem Cells

Since James Thomson et al developed a technique in 1998 to isolate and grow hES in culture, freezing cells for later use and thawing and expanding cells from a frozen stock have become important procedures performed in routine hES cell culture. Since hES cells are very sensitive to the stresses of freezing and thawing, special care must taken. Here we demonstrate the proper technique for rapidly thawing hES cells from liquid nitrogen stocks, plating them on mouse embryonic feeder cells, and slowly freezing them for long-term storage.

Since James Thomson et al developed a technique in 1998 to isolate and grow hES in culture, freezing cells for later use and thawing and expanding cells from a frozen stock have become important procedures performed in routine hES cell culture. Since hES cells are very sensitive to the stresses of freezing and thawing, special care must taken. Here we demonstrate the proper technique for rapidly thawing hES cells from liquid nitrogen stocks, plating them on mouse embryonic feeder cells, and slowly freezing them for long-term storage.

تجميد والذوبان الخلايا الجذعية الجنينية البشرية

Since James Thomson et al developed a technique in 1998 to isolate and grow hES in culture, freezing cells for later use and thawing and expanding cells ...

Differentiation of Embryonic Stem Cells into Oligodendrocyte Precursors

Oligodendrocytes are the myelinating cells of the central nervous system. For regenerative cell therapy in demyelinating diseases, there is significant interest in deriving a pure population of lineage-committed oligodendrocyte precursor cells (OPCs) for transplantation. OPCs are characterized by the activity of the transcription factor Olig2 and surface expression of a proteoglycan NG2. Using the GFP-Olig2 (G-Olig2) mouse embryonic stem cell (mESC) reporter line, we optimized conditions for the differentiation of mESCs into GFP+Olig2+NG2+ OPCs. In our protocol, we first describe the generation of embryoid bodies (EBs) from mESCs. Second, we describe treatment of mESC-derived EBs with small molecules: (1) retinoic acid (RA) and (2) a sonic hedgehog (Shh) agonist purmorphamine (Pur) under defined culture conditions to direct EB differentiation into the oligodendroglial lineage. By this approach, OPCs can be obtained with high efficiency (&gt;80%) in a time period of 30 days. Cells derived from mESCs in this protocol are phenotypically similar to OPCs derived from primary tissue culture. The mESC-derived OPCs do not show the spiking property described for a subpopulation of brain OPCs in situ. To study this electrophysiological property, we describe the generation of spiking mESC-derived OPCs by ectopically expressing NaV1.2 subunit. The spiking and nonspiking cells obtained from this protocol will help advance functional studies on the two subpopulations of OPCs.

We describe a small molecule-based protocol for differentiation of mouse embryonic stem cells into oligodendrocyte precursor cells (OPCs). This protocol generates Olig2+NG2+ OPCs with high efficiency by 30 days of differentiation. We also describe a method to generate "spiking" OPCs that can fire action potentials.

تمايز الخلايا الجذعية الجنينية في السلائف Oligodendrocyte

Oligodendrocytes are the myelinating cells of the central nervous system. For regenerative cell therapy in demyelinating diseases, there is significant ...

Fate Mapping of Human Embryonic Stem Cells by Teratoma Formation

Human embryonic stem cells (hESCs) have an unlimited capacity for self-renewal, and the ability to differentiate into cells derived from all three embryonic germ layers (1). Directed differentiation of hESCs into specific cell types has generated much interest in the field of regenerative medicine (e.g., (2-5)), and methods for determining the in vivo fate of selected or manipulated hESCs are essential to this endeavor. We have adapted a highly efficient teratoma formation assay for this purpose. A small number of specifically selected hESCs is mixed with undifferentiated wild type hESCs and Phaseolus vulgaris lectin to form a cell pellet. This is grafted beneath the kidney capsule in an immunodeficient mouse. As few as 2.5 x 105 hESCs are needed to form a 16 cm3 teratoma within 8-12 weeks. The fate of the originally selected hESCs can then be determined by immunohistochemistry. This method provides a valuable tool for characterizing tissue-specific reagents for cell-based therapy.

Directed differentiation of hESCs into specific cells has generated much interest in regenerative medicine. We provide a concise, step-by-step protocol for determining the in vivo fate of selected hESCs that provides a valuable tool for characterizing tissue-specific reagents for cell-based therapy.

رسم مصير الخلايا الجذعية الجنينية البشرية من خلال تكوين ورم مسخي

Human embryonic stem cells (hESCs) have an unlimited capacity for self-renewal, and the ability to differentiate into cells derived from all three ...

Adult and Embryonic Skeletal Muscle Microexplant Culture and Isolation of Skeletal Muscle Stem Cells

Cultured embryonic and adult skeletal muscle cells have a number of different uses. The micro-dissected explants technique described in this chapter is a robust and reliable method for isolating relatively large numbers of proliferative skeletal muscle cells from juvenile, adult or embryonic muscles as a source of skeletal muscle stem cells. The authors have used micro-dissected explant cultures to analyse the growth characteristics of skeletal muscle cells in wild-type and dystrophic muscles. Each of the components of tissue growth, namely cell survival, proliferation, senescence and differentiation can be analysed separately using the methods described here. The net effect of all components of growth can be established by means of measuring explant outgrowth rates. The micro-explant method can be used to establish primary cultures from a wide range of different muscle types and ages and, as described here, has been adapted by the authors to enable the isolation of embryonic skeletal muscle precursors.
Uniquely, micro-explant cultures have been used to derive clonal (single cell origin) skeletal muscle stem cell (SMSc) lines which can be expanded and used for in vivo transplantation. In vivo transplanted SMSc behave as functional, tissue-specific, satellite cells which contribute to skeletal muscle fibre regeneration but which are also retained (in the satellite cell niche) as a small pool of undifferentiated stem cells which can be re-isolated into culture using the micro-explant method.

The micro-dissected explants technique is a robust and reliable method for isolating proliferative skeletal muscle cells from juvenile, adult or embryonic muscles as a source of skeletal muscle stem cells. Uniquely, these cells have been clonally derived to produce skeletal muscle stem cell lines used for in vivo transplantation.

الكبار والعضلات والهيكل العظمي الجنينية Microexplant الثقافة وعزل خلايا جذعية عضلية هيكلية

Cultured embryonic and adult skeletal muscle cells have a number of different uses. The micro-dissected explants technique described in this chapter is a ...