خلية دورة quiescence هو سمة رئيسية من سمات الخلايا الجذعية الدموية. يساعد هذا البروتوكول على فهم سلوك HSCs البشرية هادئة في المختبر في ظل ظروف فسيولوجية قريبة. باستخدام هذا البروتوكول، يمكن للباحثين اختبار تأثير مختلف المركبات أو المواد الغذائية أو البروتينات التي تنظم حالة دورة الخلية وكذلك التمييز بين مركبات الكربون الهيدروفلورية بطريقة قابلة للتطوير دون استخدام نماذج حيوانية.
الأدوية المضادة للسرطان لها آثار متفاوتة على بقاء HSCs هادئة وسلف ركوب الدراجات. هذا البروتوكول يجعل من الممكن العثور على العوامل التي تدخر HSCs هادئة أو العوامل التي تضر بشكل انتقائي الخلايا الجذعية اللوكيميا هادئة. وسيبرهن على الإجراء هيروشي كوباياشي، وهو زميل باحث أقدم من مختبر تاكوبو.
للبدء، حل 16 ملليغرام لكل ملليلتر الصوديوم بالميتات، 30 ملليغرام لكل ملليلتر أوليات الصوديوم، وأربعة ملليغرام لكل ملليلتر الكوليسترول في الميثانول في أنابيب زجاجية. تخزين المحاليل الدهون في 30 درجة مئوية السلبية وذوبان لهم قبل الاستخدام. في أنبوب زجاجي طازج، اخلط المحاليل الدهنية للحصول على التركيز النهائي البالغ 100 ميكروغرام لكل ملليلتر بالميتات، و100 ميكروغرام لكل أوليات ملليلتر، و20 ميكروغرام لكل كوليسترول ملليلتر.
تبخر الميثانول عن طريق تمرير غاز النيتروجين من خلال محلول الدهون. تتبخر تماما الميثانول المتبقية عن طريق تسخين أنبوب زجاجي في حمام مائي في 37 درجة مئوية. إعداد DMEM / F - 12 المتوسطة مع HEPES والغلوتامين.
أضف البنسلين وكبريتات الستربتومايسين لتركيز نهائي من 50 وحدة و 50 ميكروغرام لكل ملليلتر على التوالي. يمكن تخزين الوسيطة عند أربع درجات مئوية لمدة شهرين على الأقل. أضف 4٪ من BSA إلى متوسط DMEM/F-12 مع HEPES والغلوتامين، ثم اضبط درجة الحموضة للوسط إلى 7.6 باستخدام محلول هيدروكسيد الصوديوم.
إضافة المتوسطة إلى أنبوب زجاجي مع الدهون. حل تماما الدهون عن طريق سونيكيشن. إذا كان الوسط معتما بعد سونيكيشن، قم بتمديد وقت الصوتنة.
عندما يذوب BSA والدهون، يجب تخزين العينات في درجة حرارة سالبة 80 درجة مئوية واستخدامها في غضون شهرين. إضافة 0.001X من الأنسولين، نقل، سيلينيت الصوديوم، وخليط أمين الإيثانول إلى DMEM/F-12 ومن ثم تصفية المتوسطة المختلطة باستخدام مرشح 0.22 ميكرومتر. قبل الاستخدام، أضف عامل الخلايا الجذعية البشرية أو SCF والجلطات البشرية أو TPO إلى وسائط الثقافة بتركيز نهائي قدره ثلاثة نانوجرامات لكل ملليلتر لكل منهما.
نقل 200 ميكرولتر من وسائل الإعلام الثقافة المعدة سابقا مع السيتوكينات إلى لوحات مسطحة أسفل 96 بئرا. لتجنب تبخر الوسط، قم بملء جميع الآبار غير المستخدمة بما بين 100 إلى 200 ميكرولتر من برنامج تلفزيوني. إعادة إنفاق الخلايا الجذعية الدموية أو HSCs فرزها في وسائل الإعلام الثقافية دون cytokines في 60 خلية لكل ميكرولتر.
Aliquot 600 الخلايا في كل بئر. أقل من 300 خلية سوف تؤدي إلى اختلاف تقني أكبر وزراعة أكثر من 1000 خلية في بئر واحد يجب تجنبها بسبب الحرمان من المغذيات أو تراكم السيتوكينات غير المواتية أو chemokines. زراعة الخلايا في حاضنة متعددة الغازات الرطبة عند 37 درجة مئوية في ثاني أكسيد الكربون بنسبة 5٪ و1٪ من الغلاف الجوي للأوكسجين.
بعد سبعة أيام من زراعة HSCs المنقى، ما يصل إلى 80٪ من الخلايا عرض علامة CD34 إيجابية وCD38 الأنماط الظاهرية السلبية. يعتمد إجمالي عدد الخلايا على تركيز السيتوكين. تركيزات أعلى من SCF و TPO المستحثة الدخول في دورة الخلية, الانتشار والتمايز.
وزاد عدد مركبات الكربون الهيدروكلورية فلورية الظاهرية التي تتميز بعلامة CD34 الإيجابية، وCD38 السلبية، وCD90 الإيجابية، والأنماط الظاهرية السلبية CD45 RA بما يتناسب مع تركيزات SCF أو TPO في حين انخفض التردد بين الخلايا الإجمالية. بعد ثلاثة أشهر من زرع نخاع العظام البالغ المستزرع HSCs ، يمكن تقييم إعادة التشكيل كدالة على ترددها في الدم المحيطي للجين الإيجابي CD45 البشري ، الخلايا السلبية CD45 Ter119 السلبية. أعيد تشكيل ثلاثة أنساب بما في ذلك خلايا CD19 B الإيجابية ، وCD13 السلبية ، وخلايا النخاع الإيجابي CD33 ، والخلايا التائية الإيجابية CD3 في فئران NOG المزروعة إما بمركبات HSCs المذابة حديثا أو المستزرعة.
بعد الثقافة، يمكن أن تخضع HSCs لتسلسل التعبير الجيني مثل PCR في الوقت الحقيقي وتسلسل الحمض النووي الريبي. كما يمكن إجراء التحقق الوظيفي باستخدام زرع الفئران التي تعاني من نقص المناعة. يمكن للباحثين مقارنة مباشرة ركوب الدراجات وHSCs هادئة في ظل ظروف محددة عن طريق ضبط تركيزات السيتوكين.
وهذا سوف يساعد على فهم برامج التجديد الذاتي الخاصة HSC هادئة، وآليات مقاومة الإجهاد، والخصائص الأيضية، والتي يصعب اختبارها في إعدادات الجسم الحي.
