نشكر هاي سوك أوه ، مريللو جوان ألن وCollmer ، قسم أمراض النبات وعلم الأحياء النباتية ، ميكروب ، جامعة كورنيل ، لإجراء مناقشات قيمة. نشكر جيسي Munkvold للتعليقات على هذه المادة. تم توفير التمويل من قبل البرنامج الوطني لمؤسسة العلوم النباتية الجينوم ، وعدد الجوائز DBI - 0605059 (GBM).

الجزء 1 : نمو النبات والصيانة ينبغي نيكوتيانا benthamiana النباتات المستخدمة في فحص يكون حوالي 7 أسابيع من العمر. وينبغي تقليص أنهم على الأقل 4-5 أيام قبل الفحص لإزالة جميع فروع الإبطين والزهور. انها فكرة جيدة لإزالة فروع الإبطين بعد وقت قصير من ظهورها في النظام لجعل النباتات أكثر سهولة. الجزء 2 : ثقافة البكتيرية DAY 1 : <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وبدأت لوحات أو الثقافات عن كل السلالات المستخدمة في فحص في الوقت نفسه. لأنواع الزائفة. والتي تشمل 2 المستحثات وسلالات التحدي 3 ، والبكتيريا على لوحات متتالية KBM تحتوي على المضادات الحيوية المناسبة من الأسهم المجمدة الجلسرين (الجدول 2). وينبغي نشر كمية صغيرة من البكتيريا في وسط اللوحة. احتضان لوحة على 30 درجة مئوية لعدة ساعات حوالي 18-24. لالأجرعية ، بدء ثقافة السائل في LB 2 مل من لوحة جديدة وتنمو بين عشية وضحاها في 250 دورة في الدقيقة ، 30 درجة مئوية. </li></ol> يوم 2 : <ol start="2" style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لالزائفة ، إضافة 150-200 KBM ميكرولتر من السائل إلى انتشار البكتيريا وتسليمهم لوحة بأكمله باستخدام نثر الزجاج العقيمة. وضع لوحة مرة أخرى في حاضنة وتركها تنمو لمدة ساعة 20-24. يجب أن يكون هناك حديقة البكتيرية على لوحة في اليوم التالي ، مشيرا إلى نمو جيدة. لالأجرعية ، بدء ثقافة الثانوي في حوالي 50-10 مل LB مع acetosyringone ميكرومتر 20 وتركها تنمو بين عشية وضحاها إلى 20 ساعة في 250 دورة في الدقيقة ، 30 درجة مئوية. </li></ol> الجزء 3 : محطات الاستعداد للمقايسة يوم 2 : <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> قبل يوم واحد الفحص يجب أن يتم نقل النباتات إلى غرفة في 22-24 درجة مئوية ، ~ 35-40 ٪ RH الخفيفة والمستمرة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> علامة الدوائر على الأوراق التي لا يقل عن 1.5 سم في القطر باستخدام علامة سميكة سوداء. يمكن أن تكون علامة سنتين إلى أربع دوائر لكل ورقة. وينبغي أن تكون دوائر متباعدة بشكل جيد ويفضل ألا عبر وريد كبير. اختيار جيد توسيع الأوراق. تجنب يترك كبار السن أو الأوراق التي هي صعبة أو سميكة لمسة وتجنب وضع علامات على الدوائر أقل أجزاء من ورقة. </li></ol> الدوائر بمناسبة يوم قبل التجربة ليس من الضروري على البروتوكول. ومع ذلك ، فإنه يوفر الوقت إذا كانت هناك أعداد كبيرة من النباتات التي يعاير ، ويجعل من الاسهل لتحقيق توقيت دقيق بين الوكالة وتحريض التطعيمات التحدي. الجزء 4 : تحريض الوكالة اليوم 3 : <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> حصاد الخلايا من لوحة في MgCl 10 مم 2 للالمتألقة وP. P. الكريهة. لالأجرعية ، ثقافة الطرد المركزي لجمع الخلايا وresuspend في MgCl 10MM 2 + 10 ملي MES الرقم الهيدروجيني 5.6. كرر الطرد المركزي وresuspend في حل 2 - MES MgCl. قياس الكثافة الضوئية (OD) من الخلايا في 600 نانومتر. ضبط المواد المستنفدة للأوزون القيم النهائي المطلوب كما هو موضح في الجدول رقم 2 ، وينبغي الزائفة معلق أخيرا في 10 ملي MgCl 2 و الأجرعية في حل 2 MgCl زارة التربية والعلم. وحدة تخزين ما مجموعه 25 مل يكفي لتلقيح 40-50 البقع. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> اختراق محرضات الوكالة في الاوساط قبل ملحوظ على الأوراق باستخدام حقنة 1 مل needleless. أكتب بالترتيب الذي كانت مخترقة من النباتات والوقت بالضبط عندما بدأ التسلل. </li></ol> الجزء 5 : التلقيح التحدي <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد P. syringae الكهروضوئية. DC3000 الطماطم ، PST DC3000 Δ hopQ1 - 1 و PS الكهروضوئية الذبابة. لهذا التحدي كما هو موضح في الجدول جزءا 4.1 و 2. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بعد سبع ساعات من تسلل محفز ، نفذ تسلل التحدي في نفس الترتيب من النباتات كما فعل الاستقراء. عموما ، يمكن استخدام نقطة على محيط الدائرة التلقيح الأولى بوصفها مركز الدائرة التلقيح الثانية. إذا كان هناك بقع متعددة على ورقة ثم تأكد من عدم تداخل عمليات التسلل. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> التخفيفات لوحة التسلسلي جميع الثقافات التي استخدمت في مقايسة على لوحات KBM LB أو التي تحتوي على المضادات الحيوية المناسبة لتحديد العدد الدقيق CFU. </li></ol> الجزء 6 : سجل للانهيار الوكالة اليوم 5 : <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ابحث عن مظهر من موت الخلايا بسبب ETI في البقع التي تم الطعن مع DC3000 PST. موت الخلايا داخل المنطقة متداخلة من تسلل يشير إلى انهيار الوكالة ، وينبغي أن سجل باعتبارها النمط الظاهري إيجابية. </li></ol> يوم 7 : <ol start="2" style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ابحث عن مظهر من موت الخلايا بسبب المرض في المناطق التي تم الطعن مع توقيت المحيط الهادي DC3000 Δ hopQ1 PV - 1 أو فرع فلسطين. الذبابة </em&gt;. النتيجة الإيجابية لالنمط الظاهري في نفس الطريقة كما هو موضح في الجزء 6.1. </li></ol> عند محطات مراقبة (التي لا ينبغي المساس عن كونا) تبدأ في إظهار موت الخلايا في منطقة تداخل عمليات التسلل ، ووقف اتخاذ أية ملاحظات أخرى. الجزء 7 : النتائج الممثل الشكل 1 يبين نتائج الفحص لحين P. وقد استخدم المتألقة كما محفز وDC3000 توقيت المحيط الهادي مثل التحدي. <img src="/files/ftp_upload/1442/fig1tmb.jpg" alt="الشكل 1" border="0" /> الشكل 1. P. تم اختراق المتألقة على N. benthamiana يترك (دائرة سوداء) للحث على الوكالة و 7 ساعات في وقت لاحق ، وكان الطعن في البقعة مع DC3000 PST (دائرة بيضاء). وأظهرت محطات لإسكات FLS2 انهيار الوكالة في المنطقة ، حيث P. تم اختراق المتألقة (A) ، من وجهة نظر موت الخلية. وأظهرت محطات المراقبة التي لم تكن إسكات أي موت الخلايا في منطقة تداخل بسبب تحريض الوكالة (B). السهام الحمراء تشير إلى عدم وجود أو موت الخلايا في منطقة تداخل التسلل. وقد اتخذت صورا 2 بعد أيام من عمليات التسلل. الرجاء <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/1442/fig1.jpg">انقر هنا</a> لرؤية نسخة أكبر من الرقم 1. <table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> الوكالة محفز </td><td> خلية الموت انتزاع التحدي </td><td> طبيعة موت الخلية </td><td> رمز </td></tr><tr><td> الزائفة المتألقة 55 </td><td> الزوائف syringae الكهروضوئية الطماطم (PST). DC3000 6 </td><td> ETI </td><td> ع ع / DC </td></tr><tr><td> P. الكريهة KT2440 </td><td> PST DC3000 </td><td> ETI </td><td> ص / DC </td></tr><tr><td> P. 55 المتألقة </td><td> PST DC3000 Δ hopQ1 - 1 6 </td><td> مرض </td><td> Pf/Q1-1 </td></tr><tr><td> الأجرعية المورمة GV2260 </td><td> P. syringae الكهروضوئية. الذبابة 11528R </td><td> مرض </td><td> الزراعية / PTAB </td></tr></tbody></table> الجدول رقم 1 : مزيج من تحريض وكالة الانباء الخلية الموت استخلاص الميكروبات المستخدمة في فحص الخلية بالاعدام لكونا. <table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> سلالة بكتيرية </td><td> اختيار المتوسطة </td><td> استخدمت في التجربة النهائية OD </td><td> المقابلة CFU / مل </td></tr><tr><td> P. 55 المتألقة </td><td> KBM أمبيسيلين (100 ميكروغرام / مل) </td><td> 0.5 </td><td> 1 × 10 9 </td></tr><tr><td> P. الكريهة KT2440 </td><td> KBM أمبيسيلين (100 ميكروغرام / مل) </td><td> 0.5 </td><td> 1 × 10 8 </td></tr><tr><td> ألف المورمة GV2260 </td><td> LB ريفامبيسين (100 ميكروغرام / مل) </td><td> 0.5 </td><td> 5 × 10 8 </td></tr><tr><td> PST DC3000 </td><td> KBM ريفامبيسين (100 ميكروغرام / مل) </td><td> 0.02 </td><td> 2 × 10 7 </td></tr><tr><td> PST DC3000 Δ hopQ1 - 1 </td><td> KBM ريفامبيسين (100 ميكروغرام / مل) </td><td> 100 التخفيف من 0.1 أضعاف </td><td> 1 × 10 6 </td></tr><tr><td> P. syringae الكهروضوئية. الذبابة 11528R </td><td> KBM ريفامبيسين (100 ميكروغرام / مل) </td><td> 100 التخفيف من 0.1 أضعاف </td><td> 1 × 10 6 </td></tr></tbody></table> الجدول 2 : شروط ومستويات الثقافة قيحة المستخدمة في الفحص. قد OD وما يقابلها من مستويات CFU تختلف بين ماركة مختلفة من الطيف.

<ol>
	<li>Abramovitch, R. B., Anderson, J. C., Martin, G. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bacterial+elicitation+and+evasion+of+plant+innate+immunity.">Bacterial elicitation and evasion of plant innate immunity.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 7 (8), 601-60 (2006).</li><li>Jones, J. D., Dangl, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+plant+immune+system.">The plant immune system.</a> Nature. 444 (7117), 323-323 (2006).</li><li>Zipfel, C., Robatzek, S., Navarro, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bacterial+disease+resistance+in+Arabidopsis+through+flagellin+perception.">Bacterial disease resistance in Arabidopsis through flagellin perception.</a> Nature. 428 (6984), 764-764 (2004).</li><li>Oh, H. S., Collmer, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Basal+resistance+against+bacteria+in+Nicotiana+benthamiana+leaves+is+accompanied+by+reduced+vascular+staining+and+suppressed+by+multiple+Pseudomonas+syringae+type+III+secretion+system+effector+proteins.">Basal resistance against bacteria in Nicotiana benthamiana leaves is accompanied by reduced vascular staining and suppressed by multiple Pseudomonas syringae type III secretion system effector proteins.</a> Plant J. 44 (2), 348-348 (2005).</li><li>Goodin, M. M., Zaitlin, D., Naidu, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nicotiana+benthamiana:+its+history+and+future+as+a+model+for+plant-pathogen+interactions.">Nicotiana benthamiana: its history and future as a model for plant-pathogen interactions.</a> Mol Plant Microbe Interact. 21 (8), 1015-1015 (2008).</li><li>Wei, C. F., Kvitko, B. H., Shimizu, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Pseudomonas+syringae+pv.+tomato+DC3000+mutant+lacking+the+type+III+effector+HopQ1-1+is+able+to+cause+disease+in+the+model+plant+Nicotiana+benthamiana.">A Pseudomonas syringae pv. tomato DC3000 mutant lacking the type III effector HopQ1-1 is able to cause disease in the model plant Nicotiana benthamiana.</a> Plant J. 51 (1), 32-32 (2007).</li></ol>

ويمكن استخدام الخلية مقايسة الموت القائم على تحديد تورط الجينات في الوكالة. على سبيل المثال ، يمكن اختبار الخسارة من وظيفة الجين المسوخ عن الاهتمام باستخدام هذا الاختبار. من أصل 4 من تركيبات محفز والتطعيمات التحدي الوارد في الجدول رقم 1 ، فمن الممكن أن تركيبة واحدة فقط قد يؤدي إلى النمط الظاهري في الخلفية محطة الخاص بك. وقد لاحظنا أن النباتات لإسكات FLS2 تظهر انهيار الوكالة في الجبهة الوطنية / DC Pf/Q1-1 وتركيبات من محفز والتطعيمات التحدي (الجدول 1). فمن الضروري أن الظروف البيئية للمقايسة قريبة قدر الإمكان من تلك الموصوفة في الجزء 3.1. الرطوبة المنخفضة أسباب موت الخلايا والمضي قدما بسرعة كبيرة جدا ، مما يجعل من الصعب فحص درجة. إذا كانت الشروط الواردة في بروتوكول لدينا لا تعمل في المختبر الخاص بك ، ثم حاول تغيير مستوى محفز أو التلقيح التحدي. مقياس آخر يمكن تعديلها هي الفجوة الزمنية بين الاستقراء والتحدي ، على الرغم من أننا قد وجدت أن الفجوات الزمنية الأقصر تسببت في مقايسة لكسر بسرعة كبيرة جدا في محطات التحكم. نوصي بأن ما لا يقل عن 4-5 نباتات يتم اختبارها في تجربة وينبغي تكرار النمط الظاهري إيجابية في تجارب مستقلة على الأقل 3-4.

<!DOCTYPE html PUBLIC "-//W3C//DTD XHTML 1.0 Transitional//EN" "http://www.w3.org/TR/xhtml1/DTD/xhtml1-transitional.dtd">
<html xmlns="http://www.w3.org/1999/xhtml" xml:lang="en" lang="en">	
		
		<div>
		<table border="1">
		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>MES</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fisher Scientific</td>
<td>BP300-100</td>
<td>Prepare as a1M stock, adjust pH and filter sterilize. Store at room temperature. </td>
</tr>
<tr>
<td>Life Science UV/Vis Spectrophotometer</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Beckman Coulter</td>
<td>DU 730</td>
<td>&nbsp;</td>		</tbody>
		</table>
		</div>

assay for pathogen-associated molecular pattern (pamp)-triggered immunity (pti) in plants

ينظرون إلى مسببات الأمراض المحتملة في بيئتهم ، واستخدام النباتات مستقبلات التعرف على الأنماط (PRRs) موجودة على أغشية البلازما الخاصة بهم. PRRs الاعتراف ميزات الميكروبية الحفظ يسمى الممرض المرتبطة بأنماط الجزيئي (PAMPs) وهذا يؤدي إلى الكشف عن العوامل PAMP الحصانة (كونا) ، الذي يمنع بشكل فعال استعمار الأنسجة النباتية من غير مسببات 1،2. النظام الأكثر مدروسة في الوكالة هو السبيل 3 FLS2 المعتمدة. FLS2 تعترف flg22 PAMP الذي هو عنصر من عناصر فلاجيلين البكتيرية. الممرضة الناجحة تمتلك عوامل الفوعة المستجيبات أو التي يمكن أن قمع الوكالة والسماح للالممرض لتسبب المرض 1. بعض النباتات بدورها تمتلك جينات المقاومة التي تكشف عن المستجيبات أو نشاطها ، مما يؤدي إلى تحفيز استخدام الحصانة المستجيب (ETI) 2. وصفنا زنزانة المحكوم عليهم بالإعدام على أساس مقايسة للتعديل من الوكالة يا وCollmer 4. كانت موحدة في مقايسة N. benthamiana ، الذي يستخدم على نحو متزايد على نظام نموذجي لدراسة التفاعلات بين النبات والممرض 5. هي التي يسببها تسلل الوكالة لسلالة من البكتيريا المسببة للأمراض غير في الأوراق. سبع ساعات في وقت لاحق ، وهي السلالة البكتيرية التي تسبب المرض أو إما هو الذي ينشط ETI تسللت إلى منطقة تداخل المنطقة تسلل الأصلي. الوكالة الناجمة عن تسلل الأولى هي قادرة على تأخير أو منع ظهور موت الخلايا بسبب تسلل التحدي الثاني. على العكس ، وظهور موت الخلايا في منطقة تداخل التلقيح يدل على انهيار الوكالة. وكانت أربع مجموعات مختلفة من المستحثات من الوكالة والتطعيمات التحدي موحدة (الجدول 1). تم اختبار الفحص على عدم إسكات N. benthamiana النباتات التي كانت بمثابة محطات مراقبة وإسكات للFLS2 التي يتوقع أن تتعرض للخطر في قدرتها على تطوير الوكالة.

Watch this Scientific Journal Video about Assay for Pathogen-Associated Molecular Pattern PAMP-Triggered Immunity PTI in Plants at JoVE.com

Assay for Pathogen-Associated Molecular Pattern PAMP-Triggered Immunity PTI in Plants

ووصف موت الخلايا المستندة للمقايسة الوكالة في محطات benthamiana نيكوتيانا.

مقايسة لمسببات الأمراض ، المرتبطين نمط الجزيئية (PAMP) - الحفز الحصانة (كونا) في النباتات

To perceive potential pathogens in their environment, plants use pattern recognition receptors (PRRs) present on their plasma membranes. PRRs recognize ...

assay-for-pathogen-associated-molecular-pattern-pamp-triggered

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Assay for Pathogen-Associated Molecular Pattern (PAMP)-Triggered Immunity (PTI) in Plants

27.1K Views.  Boyce Thompson Institute for Plant Research. ووصف موت الخلايا المستندة للمقايسة الوكالة في محطات benthamiana نيكوتيانا.

Video: Assay for Pathogen-Associated Molecular Pattern PAMP-Triggered Immunity PTI in Plants

Selection of Plasmodium falciparum Parasites for Cytoadhesion to Human Brain Endothelial Cells

Most human malaria deaths are caused by blood-stage Plasmodium falciparum parasites. Cerebral malaria, the most life-threatening complication of the disease, is characterised by an accumulation of Plasmodium falciparum infected red blood cells (iRBC) at pigmented trophozoite stage in the microvasculature of the brain2-4. This microvessel obstruction (sequestration) leads to acidosis, hypoxia and harmful inflammatory cytokines (reviewed in 5). Sequestration is also found in most microvascular tissues of the human body2, 3. The mechanism by which iRBC attach to the blood vessel walls is still poorly understood.
The immortalized Human Brain microvascular Endothelial Cell line (HBEC-5i) has been used as an in vitro model of the blood-brain barrier6. However, Plasmodium falciparum iRBC attach only poorly to HBEC-5i in vitro, unlike the dense sequestration that occurs in cerebral malaria cases. We therefore developed a panning assay to select (enrich) various P. falciparum strains for adhesion to HBEC-5i in order to obtain populations of high-binding parasites, more representative of what occurs in vivo.
A sample of a parasite culture (mixture of iRBC and uninfected RBC) at the pigmented trophozoite stage is washed and incubated on a layer of HBEC-5i grown on a Petri dish. After incubation, the dish is gently washed free from uRBC and unbound iRBC. Fresh uRBC are added to the few iRBC attached to HBEC-5i and incubated overnight. As schizont stage parasites burst, merozoites reinvade RBC and these ring stage parasites are harvested the following day. Parasites are cultured until enough material is obtained (typically 2 to 4 weeks) and a new round of selection can be performed. Depending on the P. falciparum strain, 4 to 7 rounds of selection are needed in order to get a population where most parasites bind to HBEC-5i. The binding phenotype is progressively lost after a few weeks, indicating a switch in variant surface antigen gene expression, thus regular selection on HBEC-5i is required to maintain the phenotype.
In summary, we developed a selection assay rendering P. falciparum parasites a more "cerebral malaria adhesive" phenotype. We were able to select 3 out of 4 P. falciparum strains on HBEC-5i. This assay has also successfully been used to select parasites for binding to human dermal and pulmonary endothelial cells. Importantly, this method can be used to select tissue-specific parasite populations in order to identify candidate parasite ligands for binding to brain endothelium. Moreover, this assay can be used to screen for putative anti-sequestration drugs7.

Selection of Plasmodium falciparum Parasites for Cytoadhesion to Human Brain Endothelial Cells

An in vitro model for cerebral malaria sequestration is described1. Plasmodium falciparum infected red blood cells are selected for binding to immortalized human brain microvascular endothelial cells. The selected parasites show a distinct phenotype. The selection process can be applied using various P. falciparum strains and endothelial cell lines.

اختيار المتصورة المنجلية الطفيليات لCytoadhesion لخلايا المخ البشري غشائي

Most human malaria deaths are caused by blood-stage Plasmodium falciparum parasites. Cerebral malaria, the most life-threatening complication of the ...

Investigating the Effects of Probiotics on Pneumococcal Colonization Using an In Vitro Adherence Assay

Adherence of Streptococcus pneumoniae (the pneumococcus) to the epithelial lining of the nasopharynx can result in colonization and is considered a prerequisite for pneumococcal infections such as pneumonia and otitis media. In vitro adherence assays can be used to study the attachment of pneumococci to epithelial cell monolayers and to investigate potential interventions, such as the use of probiotics, to inhibit pneumococcal&#160;colonization.&#160;The protocol described here is used to investigate the effects of the probiotic Streptococcus salivarius on the adherence of pneumococci to the human epithelial cell line CCL-23 (sometimes referred to as HEp-2 cells). The assay involves three main steps: 1) preparation of epithelial and bacterial cells, 2) addition of bacteria to epithelial cell monolayers, and 3) detection of adherent pneumococci by viable counts (serial dilution and plating) or quantitative real-time PCR (qPCR). This technique is relatively straightforward and does not require specialized equipment other than a tissue culture setup. The assay can be used to test other probiotic species and/or potential inhibitors of pneumococcal colonization and can be easily modified to address other scientific questions regarding pneumococcal adherence and invasion.

Investigating the Effects of Probiotics on Pneumococcal Colonization Using an In Vitro Adherence Assay

In vitro adherence assays can be used to study the attachment of Streptococcus pneumoniae to epithelial cell monolayers and to investigate potential interventions such as the use of probiotics for inhibiting pneumococcal colonization.

التحقيق في آثار البروبيوتيك على المكورات الرئوية الاستعمار باستخدام<em&gt; في المختبر</em&gt; الالتزام الفحص

Adherence of Streptococcus pneumoniae (the pneumococcus) to the epithelial lining of the nasopharynx can result in colonization and is considered a ...

A Flow Adhesion Assay to Study Leucocyte Recruitment to Human Hepatic Sinusoidal Endothelium Under Conditions of Shear Stress

Leucocyte infiltration into human liver tissue is a common process in all adult inflammatory liver diseases. Chronic infiltration can drive the development of fibrosis and progression to cirrhosis. Understanding the molecular mechanisms that mediate leucocyte recruitment to the liver could identify important therapeutic targets for liver disease. The key interaction during leucocyte recruitment is that of inflammatory cells with endothelium under conditions of shear stress. Recruitment to the liver occurs within the low shear channels of the hepatic sinusoids which are lined by hepatic sinusoidal endothelial cells (HSEC). The conditions within the hepatic sinusoids can be recapitulated by perfusing leucocytes through channels lined by human HSEC monolayers at specific flow rates. In these conditions leucocytes undergo a brief tethering step followed by activation and firm adhesion, followed by a crawling step and subsequent transmigration across the endothelial layer. Using phase contrast microscopy, each step of this &#39;adhesion cascade&#39; can be visualized and recorded followed by offline analysis. Endothelial cells or leucocytes can be pretreated with inhibitors to determine the role of specific molecules during this process.

Leucocyte recruitment to the liver occurs within the specialized channels of the hepatic sinusoids which are lined by unique hepatic sinusoidal endothelial cells. Phase contrast microscopy of leucocyte recruitment across human hepatic sinusoidal endothelium under conditions of physiological shear stress can facilitate the elucidation of the molecular mechanisms which underlie this process.

تدفق التصاق الفحص لدراسة توظيف الكرية البيضاء لالكبدي الإنسان جيبية البطانة Endothelium تحت ظروف إجهاد القص

Leucocyte infiltration into human liver tissue is a common process in all adult inflammatory liver diseases. Chronic infiltration can drive the ...

High Yield Purification of Plasmodium falciparum Merozoites For Use in Opsonizing Antibody Assays

Plasmodium falciparum merozoite antigens are under development as potential malaria vaccines. One aspect of immunity against malaria is the removal of free merozoites from the blood by phagocytic cells. However assessing the functional efficacy of merozoite specific opsonizing antibodies is challenging due to the short half-life of merozoites and the variability of primary phagocytic cells. Described in detail herein is a method for generating viable merozoites using the E64 protease inhibitor, and an assay of merozoite opsonin-dependent phagocytosis using the pro-monocytic cell line THP-1. E64 prevents schizont rupture while allowing the development of merozoites which are released by filtration of treated schizonts. &#160;Ethidium bromide labelled merozoites are opsonized with human plasma samples and added to THP-1 cells. Phagocytosis is assessed by a standardized high throughput protocol. Viable merozoites are a valuable resource for assessing numerous aspects of P. falciparum biology, including assessment of immune function. Antibody levels measured by this assay are associated with clinical immunity to malaria in naturally exposed individuals. The assay may also be of use for assessing vaccine induced antibodies. &#160;

High Yield Purification of Plasmodium falciparum Merozoites For Use in Opsonizing Antibody Assays

Measuring antibody function is key to understanding immunity to Plasmodium falciparum malaria. This method describes the purification of viable merozoites, and measurement of opsonization-dependent phagocytosis by flow cytometry.

ارتفاع العائد تنقية<em&gt; المتصورة المنجلية</em&gt; Merozoites للاستخدام في فحوصات ضد طهائي

Plasmodium falciparum merozoite antigens are under development as potential malaria vaccines. One aspect of immunity against malaria is the removal of ...

Neutrophil Isolation and Analysis to Determine their Role in Lymphoma Cell Sensitivity to Therapeutic Agents

Neutrophils are the most abundant (40% to 75%) type of white blood cells and among the first inflammatory cells to migrate towards the site of inflammation. They are key players in the innate immune system and play major roles in cancer biology. Neutrophils have been proposed as key mediators of malignant transformation, tumor progression, angiogenesis and in the modulation of the antitumor immunity; through their release of soluble factors or their interaction with tumor cells. To characterize the specific functions of neutrophils, a fast and reliable method is coveted for in vitro isolation of neutrophils from human blood. Here, a density gradient separation method is demonstrated to isolate neutrophils as well as mononuclear cells from the blood. The procedure consists of layering the density gradient solution such as Ficoll carefully above the diluted blood obtained from patients diagnosed with chronic lymphocytic leukemia (CLL), followed by centrifugation, isolation of mononuclear layer, separation of neutrophils from RBCsby dextran then lysis of residual erythrocytes. This method has been shown to isolate neutrophils &#8805; 90 % pure. To mimic the tumor microenvironment, 3-dimensional (3D) experiments were performed using basement membrane matrix such as Matrigel. Given the short half-life of neutrophils in vitro, 3D experiments with fresh human neutrophils cannot be performed. For this reason promyelocytic HL60 cells are differentiated along the granulocytic pathway using the differentiation inducers dimethyl sulfoxide (DMSO) and retinoic acid (RA). The aim of our experiments is to study the role of neutrophils on the sensitivity of lymphoma cells to anti-lymphoma agents. However these methods can be generalized to study the interactions of neutrophils or neutrophil-like cells with a large range of cell types in different situations.

Neutrophils are the most abundant type of white blood cells. The isolation of neutrophils from human blood by density gradient separation method and the differentiation of human promyelocytic (HL60) cells along the granulocytic pathway are described here; to test their role on sensitivity of lymphoma cells to anti-lymphoma agents.

عزل وتحليل العدلة لتحديد ما دورها في الغدد اللمفاوية حساسية الخلية وكلاء العلاجية

Neutrophils are the most abundant (40% to 75%) type of white blood cells and among the first inflammatory cells to migrate towards the site of ...

Fluorescence-based Neuraminidase Inhibition Assay to Assess the Susceptibility of Influenza Viruses to The Neuraminidase Inhibitor Class of Antivirals

The neuraminidase (NA) inhibitors are the only class of antivirals approved for the treatment and prophylaxis of influenza that are effective against currently circulating strains. In addition to their use in treating seasonal influenza, the NA inhibitors have been stockpiled by a number of countries for use in the event of a pandemic. It is therefore important to monitor the susceptibility of circulating influenza viruses to this class of antivirals. There are different types of assays that can be used to assess the susceptibility of influenza viruses to the NA inhibitors, but the enzyme inhibition assays using either a fluorescent substrate or a chemiluminescent substrate are the most widely used and recommended. This protocol describes the use of a fluorescence-based assay to assess influenza virus susceptibility to NA inhibitors. The assay is based on the NA enzyme cleaving the 2&#8242;-(4-Methylumbelliferyl)-&#945;-D-N-acetylneuraminic acid (MUNANA) substrate to release the fluorescent product 4-methylumbelliferone (4-MU). Therefore, the inhibitory effect of an NA inhibitor on the influenza virus NA is determined based on the concentration of the NA inhibitor that is required to reduce 50% of the NA activity, given as an IC50 value.

We describe the use of a phenotypic fluorescence-based neuraminidase inhibition assay to assess the susceptibility of influenza A and B viruses to the neuraminidase inhibitor class of antivirals.

مضان القائم على النورامينيداز تثبيط الفحص لتقييم مدى حساسية فيروسات الأنفلونزا إلى والنورامينيداز المانع فئة من الأدوية المضادة للفيروسات

The neuraminidase (NA) inhibitors are the only class of antivirals approved for the treatment and prophylaxis of influenza that are effective against ...

Mouse Models Of Helicobacter Infection And Gastric Pathologies

Helicobacter pylori is a gastric pathogen that is present in half of the global population and is a significant cause of morbidity and mortality in humans. Several mouse models of gastric Helicobacter infection have been developed to study the molecular and cellular mechanisms whereby H. pylori bacteria colonize the stomach of human hosts and cause disease. Herein, we describe protocols to: 1) prepare bacterial suspensions for the in vivo infection of mice via intragastric gavage; 2) determine bacterial colonization levels in mouse gastric tissues, by polymerase chain reaction (PCR) and viable counting; and 3) assess pathological changes, by histology. To establish Helicobacter infection in mice, specific pathogen-free (SPF) animals are first inoculated with suspensions (containing &#8805;105 colony-forming units, CFUs) of mouse-colonizing strains of either Helicobacter pylori or other gastric Helicobacter spp. from animals, such as Helicobacter felis. At the appropriate time-points post-infection, stomachs are excised and dissected sagittally into two equal tissue fragments, each comprising the antrum and body regions. One of these fragments is then used for either viable counting or DNA extraction, while the other is subjected to histological processing. Bacterial colonization and histopathological changes in the stomach may be assessed routinely in gastric tissue sections stained with Warthin-Starry, Giemsa or Haematoxylin and Eosin (H&#38;E) stains, as appropriate. Additional immunological analyses may also be undertaken by immunohistochemistry or immunofluorescence on mouse gastric tissue sections. The protocols described below are specifically designed to enable the assessment in mice of gastric pathologies resembling those in human-related H. pylori diseases, including inflammation, gland atrophy and lymphoid follicle formation. The inoculum preparation and intragastric gavage protocols may also be adapted to study the pathogenesis of other enteric human pathogens that colonize mice, such as Salmonella Typhimurium or Citrobacter rodentium.

Mouse Models Of Helicobacter Infection And Gastric Pathologies

Mice represent an invaluable in vivo model to study infection and diseases caused by gastrointestinal microorganisms. Here, we describe the methods used to study bacterial colonization and histopathological changes in mouse models of Helicobacter pylori-related disease.

نماذج الماوس الملوية العدوى وأمراض المعدة

Helicobacter pylori is a gastric pathogen that is present in half of the global population and is a significant cause of morbidity and mortality in ...

Establishment of Viral Infection and Analysis of Host-Virus Interaction in Drosophila Melanogaster

Virus spreading is a major cause of epidemic diseases. Thus, understanding the interaction between the virus and the host is very important to extend our knowledge of prevention and treatment of viral infection. The fruit fly Drosophila melanogaster has proven to be one of the most efficient and productive model organisms to screen for antiviral factors and investigate virus-host interaction, due to powerful genetic tools and highly conserved innate immune signaling pathways. The procedure described here demonstrates a nano-injection method to establish viral infection and induce systemic antiviral responses in adult flies. The precise control of the viral injection dose in this method enables high experimental reproducibility. Protocols described in this study include the preparation of flies and the virus, the injection method, survival rate analysis, the virus load measurement, and an antiviral pathway assessment. The influence effects of viral infection by the flies' background were mentioned here. This infection method is easy to perform and quantitatively repeatable; it can be applied to screen for host/viral factors involved in virus-host interaction and to dissect the crosstalk between innate immune signaling and other biological pathways in response to viral infection.

Establishment of Viral Infection and Analysis of Host-Virus Interaction in Drosophila Melanogaster

This protocol describes how to establish viral infection in vivo in Drosophila melanogaster using the nano-injection method and basic techniques to analyze virus-host interaction.

إنشاء العدوى الفيروسية، وتحليل التفاعل المضيف للفيروسات في Melanogaster المورفولوجية

Virus spreading is a major cause of epidemic diseases. Thus, understanding the interaction between the virus and the host is very important to extend our ...

Confocal Imaging of Double-Stranded RNA and Pattern Recognition Receptors in Negative-Sense RNA Virus Infection

Double-stranded (ds) RNA is produced as a replicative intermediate during RNA virus infection. Recognition of dsRNA by host pattern recognition receptors (PRRs) such as the retinoic acid (RIG-I) like receptors (RLRs) RIG-I and melanoma differentiation-associated protein 5 (MDA-5) leads to the induction of the innate immune response. The formation and intracellular distribution of dsRNA in positive-sense RNA virus infection has been well characterized by microscopy. Many negative-sense RNA viruses, including some arenaviruses, trigger the innate immune response during infection. However, negative-sense RNA viruses were thought to produce low levels of dsRNA, which hinders the imaging study of PRR recognition of viral dsRNA. Additionally, infection experiments with highly pathogenic arenaviruses must be performed in high containment biosafety level facilities (BSL-4). The interaction between viral RNA and PRRs for highly pathogenic RNA virus is largely unknown due to the additional technical challenges that researchers need to face in the BSL-4 facilities. Recently, a monoclonal antibody (Mab) (clone 9D5) originally used for pan-enterovirus detection has been found to specifically detect dsRNA with a higher sensitivity than the traditional J2 or K1 anti-dsRNA antibodies. Herein, by utilizing the 9D5 antibody, we describe a confocal microscopy protocol that has been used successfully to visualize dsRNA, viral protein and PRR simultaneously in individual cells infected by arenavirus. The protocol is also suitable for imaging studies of dsRNA and PRR distribution in pathogenic arenavirus infected cells in BSL4 facilities.

Double-stranded RNA produced during RNA virus replication can be recognized by pattern recognition receptors to induce an innate immune response. For negative-sense RNA viruses, the interaction between the low-level dsRNA and PRRs remains unclear. We have developed a confocal microscopy method to visualize arenavirus dsRNA and PRR in individual cells.

تصوير [كنفوكل] الحمض النووي الريبي مزدوج-الذين تقطعت بهم السبل ونمط الاعتراف مستقبلات في الإصابة بفيروسات الرنا الشعور السلبي

Double-stranded (ds) RNA is produced as a replicative intermediate during RNA virus infection. Recognition of dsRNA by host pattern recognition receptors ...

Intravital Imaging of Intraepithelial Lymphocytes in Murine Small Intestine

Intraepithelial lymphocytes expressing &#947;&#948; T cell receptor (&#947;&#948; IEL) play a key role in immune surveillance of the intestinal epithelium. Due in part to the lack of a definitive ligand for the &#947;&#948; T cell receptor, our understanding of the regulation of &#947;&#948; IEL activation and their function in vivo remains limited. This necessitates the development of alternative strategies to interrogate signaling pathways involved in regulating &#947;&#948; IEL function and the responsiveness of these cells to the local microenvironment. Although &#947;&#948; IELs are widely understood to limit pathogen translocation, the use of intravital imaging has been critical to understanding the spatiotemporal dynamics of IEL/epithelial interactions at steady-state and in response to invasive pathogens. Herein, we present a protocol for visualizing IEL migratory behavior in the small intestinal mucosa of a GFP &#947;&#948; T cell reporter mouse using inverted spinning disk confocal laser microscopy. Although the maximum imaging depth of this approach is limited relative to the use of two-photon laser-scanning microscopy, spinning disk confocal laser microscopy provides the advantage of high speed image acquisition with reduced photobleaching and photodamage. Using 4D image analysis software, T cell surveillance behavior and their interactions with neighboring cells can be analyzed following experimental manipulation to provide additional insight into IEL activation and function within the intestinal mucosa.

We describe a method to visualize GFP-labeled &#947;&#948; IELs using intravital imaging of murine small intestine by inverted spinning disk confocal microscopy. This technique enables the tracking of live cells within the mucosa for up to 4 h and can be used to investigate a variety of intestinal immune-epithelial interactions. &#160;