يسمح هذا البروتوكول عالي الإنتاجية بالفحص السريع لشتلات الطماطم من الانضمامات البرية إلى مسببات الأمراض البكتيرية Pseudomonas syringae. وs تينات الفيضانات المقايسة يقلل من وقت نمو النبات واحتياجات غرفة النمو، ويسمح دوران سريع من النباتات، ويسمح أحجام عينة كبيرة ليتم اختبارها. هذا الفحص هو أداة قوية يمكن استخدامها للكشف عن المقاومة في الانضمامات البرية وغيرها من الخطوط ذات الخلفيات الوراثية المعقدة.
ويوفر البروتوكول توجيهات محددة لإغراق الفيضانات من اثنين من سلالات Syringae Pseudomonas. ومع ذلك، فهي متعددة الاستخدامات ويمكن تعديلها للكشف عن مقاومة المضيف لمسببات الأمراض البكتيرية الأخرى. إثبات الإجراء سيكون يانا حسن، أخصائية أبحاث في مختبري.
تبدأ من خلال زراعة شتلات الطماطم. ضع بذور الطماطم في أنبوب microcentuge 2.2 ملليلتر وأضف ميليلترين من محلول التبييض بنسبة 50٪. صخرة الأنبوب لمدة 25 دقيقة ثم إزالة محلول التبييض مع ماصة.
إضافة ملليلتر اثنين من الماء النقي جدا وغسل البذور عن طريق عكس الأنبوب خمس مرات. استلهم السائل من الأنبوب، وكرر الغسل أربع مرات أخرى. بعد الغسيل النهائي، أضف مليلترين من الماء النقي للغاية وسكب البذور في طبق بيتري معقمة.
تعقيم ملقط عن طريق اشتعال لهم في الإيثانول ثم استخدامها لنقل خمس إلى سبع بذور على 100 من 25 ملليلتر لوحة مع 0.5 XMS بالإضافة إلى 0.8 في المئة agar وسائل الإعلام. ختم حواف لوحة مع الشريط الجراحي. تأكد من أن اللوحات مكدسة ومسطحة ووجهها إلى الأعلى.
وضع طبقات البذور المعقمة عند أربع درجات مئوية في الظلام لمدة ثلاثة أيام على الأقل لمزامنة الإنبات. بعد ثلاثة أيام، توجيه عموديا لوحات بحيث تنمو جذور أسفل على طول سطح لوحة ويتم توجيه خط البذور أفقيا. نقل البذور إلى غرفة النمو تعيين إلى 22 درجة مئوية مع ضوء 16 ساعة، دورة داكنة 8 ساعات.
تنمو الشتلات لمدة عشرة أيام في الغرفة، وعند هذه النقطة أنها سوف تظهر عادة ظهرت بالكامل وتوسعت كوتيليدونس والأوراق الحقيقية الأولى الناشئة. البكتيريا الطازجة المتتالية على Agar كيلو بايت المناسبة مع مسواك مسطحة ومعقمة. لـ PstT1، احتضان اللوحة عند 28 درجة مئوية لمدة 48 ساعة قبل استخدام البكتيريا في تجربة الفيضان.
لإعداد inoculum، resuspend aseptically البكتيريا في العقيمة، عشرة كلوريد المغنيسيوم ميليمولار إلى كثافة بصرية من 0.1. ثم جعل اثنين من المخففات التسلسلية للحصول على تركيز العمل مع OD600 من 0075. أيضا إعداد تخفيف واحد إلى عشرة من organosilicone غير الأيونية السطحي copolymer في عشرة ملليمولار كلوريد المغنيسيوم.
دوامة عليه وإضافته إلى البكتيريا، يحوم الأنبوب لخلط. نقل لوحات مع الشتلات عشرة أيام من غرفة النمو إلى مجلس الوزراء السلامة البيولوجية وإزالة الشريط الجراحي. ثم نقل ستة ملليلترات من inoculum إلى كل لوحة.
دفع بلطف الشتلات في inoculum مع طرف ماصة وبدء جهاز توقيت لمدة ثلاث دقائق. عقد لوحة واحدة في كل يد وإمالة الجزء الأمامي من لوحة أسفل لغمر كوتيلونس وأوراق الشتلات. حفيف الجانب inoculum إلى جانب خمس إلى سبع مرات، ثم ترجيح لوحات مرة أخرى لتغطية الجذور مع inoculum.
إمالة لوحات لأسفل مرة أخرى وكرر دورة لمدة تصل إلى ما مجموعه ثلاث دقائق. صب inoculum قبالة لوحات، تعيين لهم أسفل على سطح مستو، وصب قبالة أي inoculum المتبقية للمرة الثانية. إعادة التفاف لوحات ووضعها مرة أخرى في غرفة النمو.
وغمرت أصناف صانع المال PtoR وSpS-Ptos مع PSTDC3000 وphenotypeed سبعة إلى عشرة أيام بعد الفيضانات. تحمل شتلات موني ميكر PtoR مجموعة جينات PtoPRF وكانت مقاومة لـ PSTDC3000. في حين أن ما يقرب من ايزوجيني مونيميكر-Ptos الشتلات، والتي لا يمكن التعرف على الآثار PSTDC3000 AVRPto أو AVRPto-B توفي بسرعة، في غضون سبعة أيام بعد الفيضانات.
وغمرت الشتلات القديمة عشرة أيام مع PstT1 وphenotypeed ما لا يقل عن عشرة أيام بعد الفيضانات. وكانت عمليات الانضمام السريعة قد ماتت، وكانت قد شهدت سخرية بني، وتفتقر إلى نمو جديد. في المقابل، أظهرت الشتلات المقاومة مستوى عال ٍ من النمو الأخضر الجديد ونجوت من العدوى بـ PstT1.
وأجريت فحوصات نمو البكتيريا من أجل تأكيد كمي المقاومة PstT1 وSlylanum NeoRici LA1329. كان هناك فرق سجل 1.7 في نمو البكتيريا بين LA1329 المقاومة والمعرضة للاختلاف بين LA1329 المقاوم و Moneymaker-PtoS ، والتي ترتبط بنتائج phenotypic. عند تنفيذ هذا الفحص، أهم الأشياء التي يجب تذكرها هي إيلاء اهتمام وثيق لتقنية التعفن في جميع أنحاء البروتوكول وضمان أن جميع الشتلات على اللوحة مغمورة تماما.
تأكد من الأوتوكلاف الأنسجة النباتية المصابة والبكتيريا والتخلص من المواد وفقا للوائح المناسبة.
