نعترف ان التبرعات العينية من سلالات بكتيرية من المجموعات البروفيسور جوديث ارميتاج (جامعة أكسفورد ، المملكة المتحدة) والبروفيسور كونراد Mullineaux (جامعة كوين ماري في لندن ، المملكة المتحدة). ويتم تمويل مشترك من جانب IMD قسم الكيمياء الحيوية (جامعة أكسفورد) وOCISB ؛ وتمول من قبل AR الهندسة والعلوم الفيزيائية مجلس البحوث (EPSRC) DTC دراسية ل؛ يمول ND من التكنولوجيا الحيوية والعلوم البيولوجية مجلس البحوث (BBSRC) ؛ هو MCL بتمويل من زمالة الجمعية الملكية للبحوث الجامعة.

<ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لبدء هذا الإجراء ، يتم إذابة أول 50 ميكرولتر من الأسهم المجمدة للبروتين فلوري معربا عن كولاي ونمت الخلايا البكتيرية هوائيا مع اهتزاز وسائل الاعلام في 5 مل النمو LB بين عشية وضحاها في 37 درجة مئوية في الصباح ، ويتم استخراج 50 ميكرولتر من هذه الثقافة المشبعة وشبه مثقف إلى الحد الأدنى من وسائل الاعلام M63 ثقافة الجلوكوز ، ويحتضنها في 30 درجة مئوية لمدة 4 الى 6 ساعات. هنا نظهر باستخدام اثنين من سلالات مختلفة من الخلايا ، واحدة منها يعبر عن نقل الإلكترون السيتوكروم تنصهر لGFP ، والآخر الذي يعبر عن بروتين يشارك في المحرك في سوطي البكتيرية لتنصهر GFP. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> قد تحصد الخلايا إما مباشرة من ثقافة فرعية المتنامية اذا يعتبرهم عينات ظائفها ، أو أنها قد تكون المنفصمة لاقتطاع سياط البكتيرية إذا عرض في ظل ظروف &quot;المربوطة&quot;. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> القص ينطوي على وضع عادة 1 - 5ml ثقافة فرعية في جهاز يتكون من اثنين من المحاقن المعقمة انضم اليهم أنابيب معقمة. تتم عن طريق القص بالتناوب في كل مضخة دفع حقنة لدفع الثقافة من خلال الأنبوب الضيق. يتم ذلك 5-10 مرات ، اعتمادا على مدى القص المطلوبة. ثم يتم طرد ثقافة إلى الخلايا ، وبيليه الذي هو معلق في وسائل الإعلام الحد الأدنى لإزالة شظايا سياط. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ثم علينا إعداد تنظيف الزجاج coverslips BK7 عن طريق غمر في محلول مشبع من كوه في الإيثانول لمدة 20 دقيقة ، ثم شطف جيدا في غير المتأينة المياه والايثانول ويترك ليجف في الهواء لمدة لا تقل عن 1 ساعة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نبني بسيطة تدفق الخلية إلى الخلايا في منزل المجهر. وهذا ينطوي على رسم خطوط البارافين والشحوم على شريحة المجهر والزجاج BK7 ثم إنشاء نفق شطيرة من خلال وضع واحدة من coverlips تنظيف على أعلى ، والضغط برفق مع زوج من ملقط ، وإعطاء حجم الخلية تدفق ميكرولتر 50-10 . </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لمراقبة أداء وظائفها خلايا ملأنا تدفق الخلايا عن طريق الحقن بمحلول ث / ت 0.1 ٪ من بولي - L - يسين ، والسماح لها لاحتضان في درجة حرارة الغرفة لمدة لا تقل عن 1 دقيقة. ونحن بعد ذلك باستخدام تدفق وسائل الاعلام الحد الأدنى 100 ميكرولتر من خلال ضخ وسائل الإعلام من طرف واحد من الخلية التدفق وفتل مع المناديل الورقية من جهة أخرى. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نحن الفتيل ثم من خلال 20 ميكرولتر من التخفيف من 1:500 قطرها 200 نانومتر المجهرية اللاتكس (Polysciences) في وسائل الإعلام الحد الأدنى للاحتفال سطح ساترة. هو مقلوب تدفق الخلايا بحيث ساترة إلى أسفل ، وضعت على منصة واضحة من سطح الرطوبة في غرفة بسيطة ، وحضنت في درجة حرارة الغرفة لمدة 5 دقائق. ثم تغسل حبات غير منضم بعيدا فتل من خلال وسائل الحد الأدنى من 100 ميكرولتر. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إذا أردنا أن نلاحظ أننا الخلايا المربوطة بحذف خطوة بولي - L - يسين ، وبدلا من ملء التدفق الخلوي مع 5 الأضداد المضادة للفلاجيلين ملغ / مل. تدفق الخلايا هي المكان الرطوبة في الغرفة لمدة 10 دقيقة ومن ثم من خلال مسح بواسطة فتل. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 20 ميكرولتر للثقافة الخلية ثم الشريرة من خلال الخلية التدفق ، وذلك باستخدام إما عينة المنفصمة إذا مراقبة الخلايا المربوطة أو في عرض عينة unsheared الخلايا وظائفها. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> هو مقلوب تدفق الخلايا ووضعها في غرفة لمدة 20 دقيقة الرطوبة. ثم يتم غسل الخلايا غير منضم بها فتل من خلال وسائل الحد الأدنى من 100 ميكرولتر. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> يتم وضع قطرة من زيت الغمر في وسط السطح العلوي للساترة ويوضع بعد ذلك على تدفق الخلايا برفق على لصاحب العينة من المجهر مضان مخصصة بناؤها ، مما يجعل الاتصال البصري مع فتحة عدسة رقمية عالية الهدف. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تشغيل المجهر الإلكترون ضرب الكاميرا والكاميرا المقرر أن يتم تبريده إلى -70 درجة مئوية ، يتم تعيين البرنامج إلى الحصول على صور بمعدل إطار نموذجي من 25 هرتز في الإطار نقل واسطة ، disenabling مبدئيا على السيطرة على الكاميرا. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> يتم تبديل الإضاءة على brightfield ويتم إحضارها إلى التركيز على الصورة ، واختيار المناسب خلية أو مجموعة من الخلايا المراد تصويره على أساس تمسك يجري بالتوازي مع محورها الطويل إلى السطح ساترة. يتم ضبط دقة والتركيز على ضمان 200 نانومتر اللاتكس الخرز عالقا على السطح ساترة ليست سوى في التركيز. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ويتم الحصول على تسلسل الصور في brightfield لتسجيل الخطوط العريضة للجسم الخلية. يتم تبديل الإضاءة brightfield قبالة وتمكين الحصول على الكاميرا إلى الحد الأقصى. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لاقتناء باستخدام معيار إجمالي مضان التأمل الداخلي (أو TIRF) شعاع الليزر على الطول الموجي المناسب (هنا ، للأخضر الإثارة بروتين فلوري ، ونحن نستخدم الليزر نانومتر 473) غير محددة مسبقا بحيث تكون مركزة في مؤخرة الطائرة البؤرية عدسة موضوعية بل أفقيا النازحين من المحور البصري لتوليد حقل زائل عن الإثارة مضان في عينة الخلايا. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بدء اقتناء كاميرا والليزر فتح مصراع لإثارة البروتينات الفلورية داخل البكتيريا. المعلمات ليزر كثافة وسرعة اكتساب حاجة إلى أن يكون الأمثل للنظام بيولوجية معينة قيد التحقيق من قبل تجريب قيم مختلفة ، ولكن مجموعة نموذجية صelevant لدراسة مجمعات البروتين المحمول في غشاء الخلية 10-10 ميغاواط طاقة الليزر على منطقة الإثارة دائرية قطرها 30 ميكرومتر ~ ، مع زمن التعرض لكل إطار من 5-40 مللي. هي مضيئة عينات حتى photobleached ، وعادة لS. 10 ~ </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ويمكن استخدام هذا البروتوكول على حد سواء لخلايا المربوطة فيها الجسم للخلية يدور حول نقطة التعلق بين ساترة وكعب سوطي ، وثبتوا للخلايا التي يتم إصلاحها بشكل صارم إلى السطح ساترة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بعض سلالات الخلايا التي لديها عدد كبير من المجمعات نسخة تستفيد من وجود مواد التبييض الأولي حيود محدودة ليزر تركز على قطب واحد من الخلية قبل TIRF التصوير. هذا ما يعادل التبييض التي تستخدم في الانتعاش بعد مضان photobleaching (أو FRAP). ويمكن استخدام المجهر عادتنا أن يتغذى بعض الإثارة في ضوء الليزر قبالة مسار مستقل عن FRAP الثانية المستعملة من نوع التبييض. عادة ما يتم استخدام 1 - 10mW قوة الليزر ، مع وقت التبييض نموذجية في نطاق 10-300 مللي. هذه النتائج في المقابل التصوير أعلى بكثير في منطقة المبيضة للخلية السماح المجمعات الفردية التي نشرها لاحقا في هذا المجال إلى أن تكون أكثر سهولة تصور. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لتصور المجمعات في السيتوبلازم الخلية التي منتشر بشكل أسرع بكثير من تلك الموجودة في غشاء الخلية يعمل وضع إضاءة مختلفة تسمى &quot;slimfield&quot;. هنا يتم توسيع ليزر تركز أفقيا لتشمل مجرد خلية واحدة. هذا ينتج حقل مكثف جدا بحيث تجيز اتخاذ التعرض أسرع بكثير من ميلي ثانية واحدة a عادة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بعد الحصول على البيانات ، ويتم تغذية هذه الصور في برنامج مخصص مكتوبة (مشفرة في ابفيو (LabVIEW) 8.5). تلقائيا بالكشف عن هذه المواقف من البقع الفلورسنت في الخلايا إلى دقة عادة بضعة نانومتر ومقتطفات حجمها والسطوع. وbrightnessof ثم يتم استخدام التتبع photobleaching فيما يتعلق وقت مجمع الجزيئية مجنزرة لتقدير رياضيات الكيمياء ، أي كم من البروتينات الفلورية الفردية تشكل واحدة معقدة الجزيئية. </li></ol> ممثل النتائج : عندما يتم بشكل صحيح بروتوكول صورا لعرضها في الخلايا brightfield متميزة للغاية ، مع محيط من الهيئات زنزانة مظلمة ضد خلايا الجسم أبيض / رمادي (الشكل 1A). في الخلايا باستخدام مضان يجمد ، يمكننا أن نرى متميزة البقع كثافة من 250-300 نانومتر عادة في العرض (1B الشكل). سيتبين صحية ، والخلايا المربوطة لتدوير حول نقطة التعلق حبل brightfield في الصور. قد مضان تحت الإثارة أيضا بعض المجمعات الجزيئية في حالتنا أن ينظر في نقطة المرفق ، مما يدل على توطين البروتين المفتاحية مع المحرك سوطي. هذه البقع هي مجمعات الجزيئية الفردية ويرى عدد منهم سيتوقف على وضع الإضاءة المستخدمة وكيفية العديد من المجمعات موجودة فعلا في الخلية في أي وقت واحد. التنقل من البقع يعتمد على النظام البيولوجي محددة قيد الدراسة. إذا كانت كثافة البقع في البداية مرتفعة جدا ، كما هو الحال مع cytochromes المسمى المستخدمة هنا ، وبعد ذلك أداء التبييض FRAP الأولي يمكن تحسين التباين التصوير. <img src="/files/ftp_upload/1508/1508Figure1tmb.jpg" border="0" alt="الشكل 1" /> الشكل 1. (A) Brightfield و (ب) TIRF صورة (لون كاذبة) لخلية يجمد القولونية التعبير عن بروتين تنصهر لبروتين الفلورية الخضراء (GFP) الذي يعرف أن تشارك في المحركات سوطي من البكتيريا. الرجاء <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/1508/1508Figure1.jpg">انقر هنا</a> لرؤية نسخة أكبر من الرقم 1.

<ol>
	<li>Leake, M. C., Chandler, J. H., Wadhams, G. H., Bai, F., Berry, R. M., Armitage, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stoichiometry+and+turnover+in+single,+functioning+membrane+protein+complexes.">Stoichiometry and turnover in single, functioning membrane protein complexes.</a> Nature. 443, 355-358 (2006).</li><li>Leake, M. C., Greene, N. P., Godun, R. M., Granjon, T., Buchanan, G., Chen, S., Berry, R. M., Palmer, T., Berks, B. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Variable+stoichiometry+of+the+TatA+component+of+the+twin-arginine+protein+transport+system+observed+by+in+vivo+single-molecule+imaging.">Variable stoichiometry of the TatA component of the twin-arginine protein transport system observed by in vivo single-molecule imaging.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 105, 15376-15381 (2008).</li><li>Leake, M. C., Wilson, D., Gautel, M., Simmons, R. M., M, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+elasticity+of+single+titin+molecules+using+a+two-bead+optical+tweezers+assay.">The elasticity of single titin molecules using a two-bead optical tweezers assay.</a> Biophys. J. 87, 1112-1135 (2004).</li><li>Leake, M. C., Wilson, D., Bullard, B., Simmons, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+elasticity+of+single+kettin+molecules+using+a+two-bead+laser-tweezers+assay.">The elasticity of single kettin molecules using a two-bead laser-tweezers assay.</a> FEBS Lett. , 535-555 (2003).</li><li>Lenn, T., Leake, M. C., Mullineaux, C. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+clustering+and+dynamics+of+cytochrome+bd+complexes+in+the+Escherichia+coli+plasma+membrane.">In vivo clustering and dynamics of cytochrome bd complexes in the Escherichia coli plasma membrane.</a> Mol. Microbiol. 70, 1397-1407 (2008).</li><li>Lenn, T., Leake, M. C., Mullineaux, C. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Are+Escherichia+coli+OXPHOS+complexes+concentrated+in+specialised+zones+within+the+plasma+membrane.">Are Escherichia coli OXPHOS complexes concentrated in specialised zones within the plasma membrane.</a> Biochem. Soc. Trans. 36, 1032-1036 (2008).</li><li>Lo, C. J., Leake, M. C., Pilizota, T., Berry, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-cell+measurements+of+Membrane+Potential,+Sodium-Motive+Force+and+Flagellar+Motor+Speed+in+Escherichia+coli.">Single-cell measurements of Membrane Potential, Sodium-Motive Force and Flagellar Motor Speed in Escherichia coli.</a> Biophys. 93, 294-302 (2007).</li><li>Lo, C. J., Leake, M. C., Berry, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescence+measurement+of+intracellular+sodium+concentration+in+single+Escherichia+coli+cells.">Fluorescence measurement of intracellular sodium concentration in single Escherichia coli cells.</a> Biophys. J. 90, 357-3565 (2006).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

ويجب الحرص على عدم &quot;على القص&quot; خلية للنظر في البكتيريا المربوطة ، لأن ذلك قد يضعف من وظيفة المحركات سوطي. من المهم أن استخدام الخلايا لفترة أطول من ساعة مرة واحدة على شريحة المجهر لأنها قد تصبح الأوكسجين المستنفد. قد تكون هناك حاجة كبيرة الأمثل للعثور على أفضل مجه?...

visualizing single molecular complexes in vivo using advanced fluorescence microscopy

ويمكن تحقيق الرؤية الكاملة في آليات الخلايا الحية فقط من خلال التحقيق في العمليات الرئيسية والمباشرة التي تثير الأحداث على المستوى الخلوي. إلى تاريخ القص تعقيد النظم البيولوجية تسبب دقيقة واحدة جزيء التجارب لتكون بعيدة جدا يطالبون ، والتركيز بدلا من ذلك على دراسة النظم واحد باستخدام معظم الخام نسبيا الفرقة المتوسط ​​القياسات. ومع ذلك ، العديد من العمليات الهامة تحدث في الخلية الحية على مستوى واحد فقط أو جزيئات قليلة ؛ القياسات فرقة القناع عموما الطبيعة العشوائية وغير المتجانسة من هذه الأحداث. هنا ، وذلك باستخدام المجهر الضوئي المتطورة والأدوات التحليلية لتحليل الصور ونحن لشرح كيفية رصد البروتينات داخل الخلية الحية واحد البكتيرية إلى دقة واحدة من الجزيئات ، وكيف يمكننا مراقبة ديناميكية داخل مجمعات الجزيئية في أداء الأجهزة البيولوجية. التقنيات ذات الصلة مباشرة من الناحية الفسيولوجية. فهي طفيفة ، perturbative وغير الغازية لعينة بيولوجية هي قيد الدراسة ومتفهمين تماما عن التحقيقات في المادة الحية ، وميزات لا تتوافر لنهج واحد جزيء آخر من الفيزياء الحيوية. بالإضافة إلى ذلك ، درس جميع العينات البيولوجية إنتاج البروتين fluorescently الموسومة على المستويات التي تكاد تكون متطابقة مع سلالات خلايا معدلة (&quot;ترميز الجينومية&quot;) ، على عكس النهج الأكثر شيوعا ولكن أقل مثالية لتوليد البروتين أكثر بكثير مما يمكن أن يحدث بشكل طبيعي (&#39;التعبير البلازميد&quot;). وبالتالي ، فإن العينات البيولوجية الفعلية التي سيتم التحقيق فيها هي أقرب إلى حد كبير في الكائنات الطبيعية ، وبالتالي المزيد من الملاحظات ذات الصلة على العمليات الفيزيولوجية الحقيقية.

Watch this Scientific Journal Video about Visualizing Single Molecular Complexes In Vivo Using Advanced Fluorescence Microscopy at JoVE.com

Visualizing Single Molecular Complexes In Vivo Using Advanced Fluorescence Microscopy

نحن هنا لشرح البروتوكولات لأداء المفرد جزيء مضان المجهري على الخلايا البكتيرية الحية للتمكن من الكشف عن مجمعات الجزيئية وظيفية ، ومجنزرة كميا.

تصور المجمعات الجزيئية واحدة في فيفو استخدام الميكروسكوب الإسفار متقدم

Full insight into the mechanisms of living cells can be achieved only by investigating the key processes that elicit and direct events at a cellular ...

visualizing-single-molecular-complexes-vivo-using-advanced

Research

JoVE Journal

Biology

Visualizing Single Molecular Complexes In Vivo Using Advanced Fluorescence Microscopy

9.2K Views.  University of Oxford. نحن هنا لشرح البروتوكولات لأداء المفرد جزيء مضان المجهري على الخلايا البكتيرية الحية للتمكن من الكشف عن مجمعات الجزيئية وظيفية ، ومجنزرة كميا.

Video: Visualizing Single Molecular Complexes In Vivo Using Advanced Fluorescence Microscopy

Visualizing Single-molecule DNA Replication with Fluorescence Microscopy

We describe a simple fluorescence microscopy-based real-time method for observing DNA replication at the single-molecule level. A circular, forked DNA template is attached to a functionalized glass coverslip and replicated extensively after introduction of replication proteins and nucleotides (Figure 1). The growing product double-strand DNA (dsDNA) is extended with laminar flow and visualized by using an intercalating dye. Measuring the position of the growing DNA end in real time allows precise determination of replication rate (Figure 2). Furthermore, the length of completed DNA products reports on the processivity of replication. This experiment can be performed very easily and rapidly and requires only a fluorescence microscope with a reasonably sensitive camera.


This protocol demonstrates a simple single-molecule fluorescence microscopy technique for visualizing DNA replication by individual replisomes in real time.

تصور تكرار الحمض النووي جزيء واحدة مع مضان المجهري

We describe a simple fluorescence microscopy-based real-time method for observing DNA replication at the single-molecule level. A circular, forked DNA ...

Time-lapse Imaging of Mitosis After siRNA Transfection

Changes in cellular organization and chromosome dynamics that occur during mitosis are tightly coordinated to ensure accurate inheritance of genomic and cellular content. Hallmark events of mitosis, such as chromosome movement, can be readily tracked on an individual cell basis using time-lapse fluorescence microscopy of mammalian cell lines expressing specific GFP-tagged proteins. In combination with RNAi-based depletion, this can be a powerful method for pinpointing the stage(s) of mitosis where defects occur after levels of a particular protein have been lowered. In this protocol, we present a basic method for assessing the effect of depleting a potential mitotic regulatory protein on the timing of mitosis. Cells are transfected with siRNA, placed in a stage-top incubation chamber, and imaged using an automated fluorescence microscope. We describe how to use software to set up a time-lapse experiment, how to process the image sequences to make either still-image montages or movies, and how to quantify and analyze the timing of mitotic stages using a cell-line expressing mCherry-tagged histone H2B. Finally, we discuss important considerations for designing a time-lapse experiment. This strategy is complementary to other approaches and offers the advantages of 1) sensitivity to changes in kinetics that might not be observed when looking at cells as a population and 2) analysis of mitosis without the need to synchronize the cell cycle using drug treatments. The visual information from such imaging experiments not only allows the sub-stages of mitosis to be assessed, but can also provide unexpected insight that would not be apparent from cell cycle analysis by FACS.

Here we describe a basic protocol to image and quantify the mitotic timing of live mammalian tissue culture cells after siRNA transfection.

الوقت الفاصل بين التصوير من الانقسام الميتوزي بعد ترنسفكأيشن سيرنا

Changes in cellular organization and chromosome dynamics that occur during mitosis are tightly coordinated to ensure accurate inheritance of genomic and ...

Visualizing Bacteria in Nematodes using Fluorescent Microscopy

Symbioses, the living together of two or more organisms, are widespread throughout all kingdoms of life. As two of the most ubiquitous organisms on earth, nematodes and bacteria form a wide array of symbiotic associations that range from beneficial to pathogenic 1-3. One such association is the mutually beneficial relationship between Xenorhabdus bacteria and Steinernema nematodes, which has emerged as a model system of symbiosis 4. Steinernema nematodes are entomopathogenic, using their bacterial symbiont to kill insects 5. For transmission between insect hosts, the bacteria colonize the intestine of the nematode's infective juvenile stage 6-8. Recently, several other nematode species have been shown to utilize bacteria to kill insects 9-13, and investigations have begun examining the interactions between the nematodes and bacteria in these systems 9.
We describe a method for visualization of a bacterial symbiont within or on a nematode host, taking advantage of the optical transparency of nematodes when viewed by microscopy. The bacteria are engineered to express a fluorescent protein, allowing their visualization by fluorescence microscopy. Many plasmids are available that carry genes encoding proteins that fluoresce at different wavelengths (i.e. green or red), and conjugation of plasmids from a donor Escherichia coli strain into a recipient bacterial symbiont is successful for a broad range of bacteria. The methods described were developed to investigate the association between Steinernema carpocapsae and Xenorhabdus nematophila 14. Similar methods have been used to investigate other nematode-bacterium associations 9,15-18and the approach therefore is generally applicable.
The method allows characterization of bacterial presence and localization within nematodes at different stages of development, providing insights into the nature of the association and the process of colonization 14,16,19. Microscopic analysis reveals both colonization frequency within a population and localization of bacteria to host tissues 14,16,19-21. This is an advantage over other methods of monitoring bacteria within nematode populations, such as sonication 22or grinding 23, which can provide average levels of colonization, but may not, for example, discriminate populations with a high frequency of low symbiont loads from populations with a low frequency of high symbiont loads. Discriminating the frequency and load of colonizing bacteria can be especially important when screening or characterizing bacterial mutants for colonization phenotypes 21,24. Indeed, fluorescence microscopy has been used in high throughput screening of bacterial mutants for defects in colonization 17,18, and is less laborious than other methods, including sonication 22,25-27and individual nematode dissection 28,29.

To study the mutualism between Xenorhabdus bacteria and Steinernema nematodes, methods were developed to monitor bacterial presence and location within nematodes. The experimental approach, which can be applied to other systems, entails engineering bacteria to express the green fluorescent protein and visualizing, using fluorescence microscopy bacteria within the transparent nematode.

تصور البكتيريا في نيماتودا باستخدام المجهر الفلورسنت

 
Symbioses, the living together of two or more organisms, are widespread throughout all kingdoms of life. As two of the most ubiquitous organisms on ...

Quantitative Analysis of Autophagy using Advanced 3D Fluorescence Microscopy

Prostate cancer is the leading form of malignancies among men in the U.S. While surgery carries a significant risk of impotence and incontinence, traditional chemotherapeutic approaches have been largely unsuccessful. Hormone therapy is effective at early stage, but often fails with the eventual development of hormone-refractory tumors. We have been interested in developing therapeutics targeting specific metabolic deficiency of tumor cells. We recently showed that prostate tumor cells specifically lack an enzyme (argininosuccinate synthase, or ASS) involved in the synthesis of the amino acid arginine1. This condition causes the tumor cells to become dependent on exogenous arginine, and they undergo metabolic stress when free arginine is depleted by arginine deiminase (ADI)1,10. Indeed, we have shown that human prostate cancer cells CWR22Rv1 are effectively killed by ADI with caspase-independent apoptosis and aggressive autophagy (or macroautophagy)1,2,3. Autophagy is an evolutionarily-conserved process that allows cells to metabolize unwanted proteins by lysosomal breakdown during nutritional starvation4,5. Although the essential components of this pathway are well-characterized6,7,8,9, many aspects of the molecular mechanism are still unclear - in particular, what is the role of autophagy in the death-response of prostate cancer cells after ADI treatment? In order to address this question, we required an experimental method to measure the level and extent of autophagic response in cells - and since there are no known molecular markers that can accurately track this process, we chose to develop an imaging-based approach, using quantitative 3D fluorescence microscopy11,12.
Using CWR22Rv1 cells specifically-labeled with fluorescent probes for autophagosomes and lysosomes, we show that 3D image stacks acquired with either widefield deconvolution microscopy (and later, with super-resolution, structured-illumination microscopy) can clearly capture the early stages of autophagy induction. With commercially available digital image analysis applications, we can readily obtain statistical information about autophagosome and lysosome number, size, distribution, and degree of colocalization from any imaged cell. This information allows us to precisely track the progress of autophagy in living cells and enables our continued investigation into the role of autophagy in cancer chemotherapy.

Autophagy is a ubiquitous process that enables cells to degrade and recycle proteins and organelles. We apply advanced fluorescence microscopy to visualize and quantify the small, but essential, physical changes associated with the induction of autophagy, including the formation and distribution of autophagosomes and lysosomes, and their fusion into autolysosomes.

التحليل الكمي الالتهام الذاتي باستخدام المجهر مضان المتقدم 3D

Prostate cancer is the leading form of malignancies among men in the U.S. While surgery carries a significant risk of impotence and incontinence, ...

Visualizing Cytoplasmic Flow During Single-cell Wound Healing in Stentor coeruleus

Although wound-healing is often addressed at the level of whole tissues, in many cases individual cells are able to heal wounds within themselves, repairing broken cell membrane before the cellular contents leak out. The giant unicellular organism Stentor coeruleus, in which cells can be more than one millimeter in size, have been a classical model organism for studying wound healing in single cells. Stentor cells can be cut in half without loss of viability, and can even be cut and grafted together. But this high tolerance to cutting raises the question of why the cytoplasm does not simply flow out from the size of the cut. Here we present a method for cutting Stentor cells while simultaneously imaging the movement of cytoplasm in the vicinity of the cut at high spatial and temporal resolution. The key to our method is to use a &#34;double decker&#34; microscope configuration in which the surgery is performed under a dissecting microscope focused on a chamber that is simultaneously viewed from below at high resolution using an inverted microscope with a high NA lens. This setup allows a high level of control over the surgical procedure while still permitting high resolution tracking of cytoplasm.

Visualizing Cytoplasmic Flow During Single-cell Wound Healing in Stentor coeruleus

The giant ciliate Stentor coeruleus is a classical system for studying regeneration and wound healing in single cells.&#160;By imaging Stentor cells simultaneously at low and high magnification it is possible to measure cytoplasmic flows before, during, and after wounding.

Although wound-healing is often addressed at the level of whole tissues, in many cases individual cells are able to heal wounds within themselves, ...

Rapid Analysis and Exploration of Fluorescence Microscopy Images

Despite rapid advances in high-throughput microscopy, quantitative image-based assays still pose significant challenges. While a variety of specialized image analysis tools are available, most traditional image-analysis-based workflows have steep learning curves (for fine tuning of analysis parameters) and result in long turnaround times between imaging and analysis. In particular, cell segmentation, the process of identifying individual cells in an image, is a major bottleneck in this regard.
Here we present an alternate, cell-segmentation-free workflow based on PhenoRipper, an open-source software platform designed for the rapid analysis and exploration of microscopy images. The pipeline presented here is optimized for immunofluorescence microscopy images of cell cultures and requires minimal user intervention. Within half an hour, PhenoRipper can analyze data from a typical 96-well experiment and generate image profiles. Users can then visually explore their data, perform quality control on their experiment, ensure response to perturbations and check reproducibility of replicates. This facilitates a rapid feedback cycle between analysis and experiment, which is crucial during assay optimization. This protocol is useful not just as a first pass analysis for quality control, but also may be used as an end-to-end solution, especially for screening. The workflow described here scales to large data sets such as those generated by high-throughput screens, and has been shown to group experimental conditions by phenotype accurately over a wide range of biological systems. The PhenoBrowser interface provides an intuitive framework to explore the phenotypic space and relate image properties to biological annotations. Taken together, the protocol described here will lower the barriers to adopting quantitative analysis of image based screens.

Here we describe a workflow for rapidly analyzing and exploring collections of fluorescence microscopy images using PhenoRipper, a recently developed image-analysis platform.

التحليل السريع واستكشاف الإسفار الميكروسكوب الصور

Despite rapid advances in high-throughput microscopy, quantitative image-based assays still pose significant challenges. While a variety of specialized ...

Visualizing Stromule Frequency with Fluorescence Microscopy

Stromules, or "stroma-filled tubules", are narrow, tubular extensions from the surface of the chloroplast that are universally observed in plant cells but whose functions remain mysterious. Alongside growing attention on the role of chloroplasts in coordinating plant responses to stress, interest in stromules and their relationship to chloroplast signaling dynamics has increased in recent years, aided by advances in fluorescence microscopy and protein fluorophores that allow for rapid, accurate visualization of stromule dynamics. Here, we provide detailed protocols to assay stromule frequency in the epidermal chloroplasts of Nicotiana benthamiana, an excellent model system for investigating chloroplast stromule biology. We also provide methods for visualizing chloroplast stromules in vitro by extracting chloroplasts from leaves. Finally, we outline sampling strategies and statistical approaches to analyze differences in stromule frequencies in response to stimuli, such as environmental stress, chemical treatments, or gene silencing. Researchers can use these protocols as a starting point to develop new methods for innovative experiments to explore how and why chloroplasts make stromules.

Protocols to investigate the dynamics of chloroplast stromules, the stroma-filled tubules that extend from the surface of chloroplasts, are described.

تصور التردد Stromule مع مضان المجهر

Stromules, or "stroma-filled tubules", are narrow, tubular extensions from the surface of the chloroplast that are universally observed in plant cells but ...

Functional Imaging of Viral Transcription Factories Using 3D Fluorescence Microscopy

It is well known that spatial and temporal regulation of genes is an integral part of governing proper gene expression. Consequently, it is invaluable to understand where and when transcription is taking place within nuclear space and to visualize the relationship between episomes infected within the same cell's nucleus. Here, both immunofluorescence (IFA) and RNA-FISH have been combinedto identify actively transcribing Kaposi's sarcoma-associated herpesvirus (KSHV) episomes. By staining KSHV latency-associated nuclear antigen (LANA), it is possible to locate where viral episomes exist within the nucleus. In addition, by designing RNA-FISH probes to target the intron region of a viral gene, which is expressed only during productive infection, nascent RNA transcripts can be located. Using this combination of molecular probes, it is possible to visualize the assembly of large viral transcription factories and analyze the spatial regulation of viral gene expression during KSHV reactivation. By including anti-RNA polymerase II antibody staining, one can also visualize the association between RNA polymerase II (RNAPII) aggregation and KSHV transcription during reactivation.

Viral transcriptional factories are discrete structures that are enriched with cellular RNA polymerase II to increase viral gene transcription during reactivation. Here, a method to locate sites of actively transcribing viral chromatin in 3D nuclear space by a combination of immunofluorescence staining and in situ RNA hybridization is described.

الفنية تصوير المصانع النسخ الفيروسية باستخدام مجهر الأسفار 3D

It is well known that spatial and temporal regulation of genes is an integral part of governing proper gene expression. Consequently, it is invaluable to ...

Visualizing Lymph Node Structure and Cellular Localization using Ex-Vivo Confocal Microscopy

Lymph nodes (LNs) are organs spread within the body, where the innate immune responses can connect with the adaptive immunity. In fact, LNs are strategically interposed in the path of the lymphatic vessels, allowing intimate contact of tissue antigens with all resident immune cells in the LN. Thus, understanding the cellular composition, distribution, location and interaction using ex vivo whole LN imaging will add to the knowledge on how the body coordinates local and systemic immune responses. This protocol shows an ex vivo imaging strategy following an in vivo administration of fluorescent-labeled antibodies that allows a very reproducible and easy-to-perform methodology by using conventional confocal microscopes and stock reagents. Through subcutaneous injection of antibodies, it is possible to label different cell populations in draining LNs without affecting tissue structures that can be potentially damaged by a conventional immunofluorescence microscopy technique.

This protocol describes a technique to image different cell populations in draining lymph nodes without alterations in the organ structure.

تصور بنية العقدة الليمفاوية وتوطين الخلايا باستخدام الفحص المجهري السابق فيفيفو

Lymph nodes (LNs) are organs spread within the body, where the innate immune responses can connect with the adaptive immunity. In fact, LNs are ...

Examination of Mitotic and Meiotic Fission Yeast Nuclear Dynamics by Fluorescence Live-cell Microscopy

Live-cell imaging is a microscopy technique used to examine cell and protein dynamics in living cells. This imaging method is not toxic, generally does not interfere with cell physiology, and requires minimal experimental handling. The low levels of technical interference enable researchers to study cells across multiple cycles of mitosis and to observe meiosis from beginning to end. Using fluorescent tags such as Green Fluorescent Protein (GFP) and Red Fluorescent Protein (RFP), researchers can analyze different factors whose functions are important for processes like transcription, DNA replication, cohesion, and segregation. Coupled with data analysis using Fiji (a free, optimized ImageJ version), live-cell imaging offers various ways of assessing protein movement, localization, stability, and timing, as well as nuclear dynamics and chromosome segregation. However, as is the case with other microscopy methods, live-cell imaging is limited by the intrinsic properties of light, which put a limit to the resolution power at high magnifications, and is also sensitive to photobleaching or phototoxicity at high wavelength frequencies. However, with some care, investigators can bypass these physical limitations by carefully choosing the right conditions, strains, and fluorescent markers to allow for the appropriate visualization of mitotic and meiotic events.

Here, we present live-cell imaging which is a non-toxic microscopy method that allows researchers to study protein behavior and nuclear dynamics in living fission yeast cells during mitosis and meiosis.

فحص الديناميات النووية الخميرة الانشطارية الميتومية وMeiotic عن طريق الفلورة الخلية الحية المجهرية

Live-cell imaging is a microscopy technique used to examine cell and protein dynamics in living cells. This imaging method is not toxic, generally does ...