אנו מכירים את התרומות סוג של זני חיידקים מן הקבוצות של פרופ &#39;יהודית ארמיטג&#39; (אוניברסיטת אוקספורד, בריטניה), פרופ&#39; קונרד Mullineaux (המלכה מרי באוניברסיטת לונדון, אנגליה). IMD ממומנת במשותף על ידי המחלקה לביוכימיה (אוניברסיטת אוקספורד) ו OCISB: AR ממומנת על ידי הנדסה המדעים הפיזיקליים המועצה למחקר (EPSRC) מלגת הלימודים DTC; ND ממומנת מן ביוטכנולוגיה ו מחקר מדעי הביולוגיה המועצה (BBSRC); MCL הוא במימון מלגה החברה המלכותית מחקר באוניברסיטה.

<ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי להתחיל בהליך זה, 50 μl של מניות קפוא של חלבון פלואורסצנטי להביע coli Escherichia תאים חיידקיים הם מפשיר הראשון גדלו aerobically עם רועד 5 מ&quot;ל LB התקשורת צמיחה לילה ב 37 מעלות צלסיוס בבוקר, 50 μl של תרבות זו רווי מופק ותת תרבות מינימלית M63 לתוך תרבות מדיה גלוקוז, דוגרים ב-C 30 מעלות למשך 4 עד 6 שעות. כאן אנו מדגימים באמצעות שני זני תאים שונים, אשר אחד מהם מבטא העברת אלקטרונים ציטוכרום התמזגו GFP, השני המבטא חלבון מעורב המנוע flagellar חיידקי התמזגו GFP. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תאים עשויים לקצור במישרין מן התרבות קטן גדל אם הצפייה בהם דגימות משותקת, או שהם עשויים להיות טעון לחתוך שוטונים חיידקי אם צפייה בתנאים &quot;קשור&quot;. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שירינג כרוך בדרך כלל הצבת 1-5 מ&quot;ל של תרבות המשנה לתוך מכשיר המורכב משתי מזרקים סטריליים הצטרפו צנרת סטרילית. הגז נעשית על ידי לסירוגין דוחפים משאבה כל מזרק כדי לדחוף את תרבות דרך צינור צר. הדבר נעשה 5-10 פעמים, בהתאם להיקף הגז הנדרשת. תרבות היא centrifuged אז גלולה התאים, אשר resuspended בתקשורת מינימלי להסיר שברי שוטונים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר מכן אנו מכינים לנקות BK7 coverslips זכוכית ידי טבילה בתמיסה רוויה של KOH באתנול במשך 20 דקות, ואז לשטוף ביסודיות במים דה מיונן אתנול ולהשאיר לייבוש באוויר לפחות 1 ח </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אנחנו פשוט לבנות תזרים תאים לבית התאים במיקרוסקופ. זה כרוך ציור קווים של שומן פרפין על שקופית BK7 מיקרוסקופ זכוכית ולאחר מכן יצירת מנהרה-כריך ידי הצבת אחד coverlips ניקו למעלה, ולחיצה מטה בעדינות עם זוג מלקחיים, נותן נפח תא זרימה של μl 5-10 . </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי לצפות בתאים משותקת אנחנו ממלאים את זרימת תאים בזריקה עם פתרון w / v 0.1% פולי-L-ליזין, ולאפשר לו דגירה בטמפרטורת החדר למשך דקות לפחות 1. לאחר מכן לשטוף החוצה באמצעות מדיה מינימלי 100 μl ידי הזרקת התקשורת מקצה אחד של התא זרימה ועל הפתילה בנייר טישו מהשני. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר מכן, אנו הפתיל דרך μl 20 של דילול 1:500 בקוטר של 200 ננומטר לטקס microspheres (Polysciences) בתקשורת מינימלי כדי לסמן את השטח coverslip. זרימת תאים הוא הפוך כזה coverslip פונה כלפי מטה, מונח על מצע ברור של השטח בתא לחות פשוט, מודגרות בטמפרטורת החדר למשך 5 דקות. חרוזים מאוגד נשטפים אז במרחק של 100 הפתילה דרך התקשורת מינימלי μl. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אם אנו רוצים לשמור התאים קשורים אנו להשמיט את הצעד poly-L-ליזין, ובמקום למלא את זרימת תאים עם נוגדן אנטי flagellin 5 מ&quot;ג / מ&quot;ל. זרימת תא הוא מקום בתא לחות במשך 10 דקות, והוא הסמיק מכן דרך על ידי הפתילה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 20 μl של התרבות התא ואז הרשעים דרך התא זרימה, בין אם באמצעות מדגם טעון התבוננות אם התאים קשורים או מדגם unsheared ב צפייה תאים משותקת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> זרימת תאים היא הפוכה והניח בתא לחות עבור 20 דקות. תאים מאוגד נשטפים החוצה ואז על ידי מדיה הפתילה דרך 100 μl מינימלי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> טיפה של שמן טבילה ממוקם במרכז המשטח העליון של coverslip ואת זרימת תאים ממוקם אז בעדינות לבעל המדגם של מיקרוסקופ פלואורסצנטי המנהג בנוי, ביצירת קשר עם עדשה אופטית מטרה גבוהה מספרי הצמצם. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> המצלמה מיקרוסקופ אלקטרונים הכפלת מופעל ונמצא המצלמה מוגדר להיות מקורר -70 מעלות צלזיוס, התוכנה מוגדרת לרכוש תמונות בקצב מסגרת טיפוסית של 25 הרץ במצב מסגרת העברה, בתחילה disenabling לקבל שליטה על המצלמה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תאורה brightfield מופעל ואת התמונה הוא הביא אל המוקד, בחירת תא או קבוצת תאים מתאים להיות צילמו על בסיס היותם תקועים עם מקביל לציר הארוך שלהם אל פני השטח coverslip. הדגש הוא מותאם היטב על מנת להבטיח כי לטקס 200 ננומטר חרוזים תקוע אל פני השטח coverslip הם רק בפוקוס. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> רצף התמונה היא רכשה brightfield להקליט את קווי המתאר של גוף התא. תאורה brightfield הוא כיבה את המצלמה מופעלת רווח מרבי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עבור רכישת תקן באמצעות השתקפות מסך פלואורסצנטי פנימי (או TIRF) קרן לייזר על הגל המתאים (כאן, עירור ירוק חלבון פלואורסצנטי, אנו משתמשים לייזר 473 ננומטר) היא שנקבע מראש כדי להיות ממוקד במישור המוקד האחורי של העדשה אובייקטיבי אבל העקורים רוחבית מהציר האופטי כדי ליצור שדה חלוף עבור עירור הקרינה לתוך המדגם התא. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הרכישה המצלמה התחיל את התריס נפתח לייזר כדי להלהיב את חלבוני ניאון בתוך החיידק. הפרמטרים עבור עוצמת הלייזר ואת המהירות של הרכישה צריך להיות מותאם למערכת ביולוגית מסוימת תחת חקירה על ידי התנסות עם ערכים שונים, אלא מגוון טיפוסי relevant ללימוד קומפלקסים חלבונים ניידים קרום התא הם 1-10 כוח mW הלייזר על פני שטח עירור עגולה בקוטר ~ 30 מיקרומטר, עם זמן חשיפה לכל מסגרת של 50-40 אלפיות השנייה. דוגמאות מוארים עד photobleached, בדרך כלל עבור ~ 10 s. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פרוטוקול זה יכול לשמש גם עבור תאים קשור בו גוף התא הוא מסתובב על נקודת ההתקשרות בין coverslip ועל בדל flagellar, ועל תאים משותקת אשר קבועים ונוקשים אל פני השטח coverslip. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כמה זנים התא שבו יש מספר גבוה עותק של קומפלקסים תועלת אקונומיקה הראשונית עקיפה מוגבל לייזר ממוקדת על מוט אחד של התא לפני TIRF הדמיה. אקונומיקה זה שווה כי בשימוש התאוששות הקרינה לאחר photobleaching (או FRAP). באמצעות מיקרוסקופ המנהג שלנו קצת אור לייזר עירור יכול להיות מוזן לתוך נתיב עצמאי second המשמש FRAP מסוג הלבנה. בדרך כלל 1-10mW כוח לייזר משמש, עם זמן אקונומיקה טיפוסי בטווח 10-300 מילישניות. התוצאה היא הרבה יותר גבוהה לעומת הדמיה באזור מולבן של התא ומאפשר מתחמי יחיד אשר לאחר מכן מפוזר לאזור זה יהיה בקלות רבה יותר דמיינו. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עבור חזותי מתחמי בציטופלסמה של התא אשר מפוזר הרבה יותר מהר מאשר אלה קרום התא מצב תאורה שונים בשם &quot;slimfield&quot; הוא מועסק. הנה לייזר ממוקדת מורחבת רוחבית כדי להקיף רק תא בודד. זה מייצר שדה חזק מאוד ומאפשר חשיפה הרבה יותר מהר בדרך כלל של אלפית השנייה להילקח. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעקבות הרכישה נתונים, תמונות מוזנים לתוך התוכנה כתובה מותאמת אישית (מקודד LabVIEW 8.5). זה מזהה אוטומטית את עמדות נקודות פלורסנט בתאים עד לדיוק של ננומטרים ספורים בדרך כלל ותמציות גודלם ואת הבהירות. Brightnessof עקבות photobleaching ביחס לזמן ממכלול מולקולרית מעקב לאחר מכן נעשה שימוש כדי להעריך את stoichiometry, כלומר כמה חלבוני ניאון הפרט לפצות קומפלקס מולקולרי יחיד. </li></ol> נציג תוצאות: כאשר הפרוטוקול הוא נעשה בצורה נכונה את התמונות של התאים שנצפו ב brightfield שונה מאוד, עם היקפה של גופי התא כהה נגד גוף תא לבן / אפור (איור 1 א). ב הקרינה משותקים באמצעות תאים, אנו יכולים לראות עוצמת כתמים ברורים, בדרך כלל של 250-300 ננומטר רוחב (איור 1b). בריאים, התאים קשורים יראו לסובב סביב נקודת ההתקשרות לקשור בתמונות brightfield. תחת עירור הקרינה מתחמי כמה מולקולרית במקרה שלנו יכול להיות גם לראות בנקודת ההתקשרות, מה שמעיד על לוקליזציה של החלבון מתוייגים עם המנוע flagellar. כתמים אלה הם קומפלקסים מולקולריים בודדים ומספר להם לראות יהיה תלוי במצב תאורה המשמשים וכמה מתחמי הם בעצם להציג בתא בכל רגע נתון. הניידות של כתמים תלוי מערכת ביולוגית ספציפית תחת מחקר. אם את הצפיפות של הנקודות בהתחלה הוא גבוה מאוד, כפי שקורה עם cytochromes שכותרתו משמש כאן, ולאחר מכן ביצוע אקונומיקה FRAP הראשוני יכול לשפר את הניגודיות הדמיה. <img src="/files/ftp_upload/1508/1508Figure1tmb.jpg" border="0" alt="איור 1" /> באיור 1. (א) brightfield ו (ב) התמונה TIRF (צבע שקר) עבור תא Escherichia coli משותקת לבטא חלבון התמזגו חלבון פלואורסצנטי ירוק (GFP) אשר ידוע להיות מעורב המנועים flagellar של חיידקים. אנא <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/1508/1508Figure1.jpg">לחץ כאן</a> כדי לראות גרסה גדולה יותר של דמות 1.

<ol>
	<li>Leake, M. C., Chandler, J. H., Wadhams, G. H., Bai, F., Berry, R. M., Armitage, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stoichiometry+and+turnover+in+single,+functioning+membrane+protein+complexes.">Stoichiometry and turnover in single, functioning membrane protein complexes.</a> Nature. 443, 355-358 (2006).</li><li>Leake, M. C., Greene, N. P., Godun, R. M., Granjon, T., Buchanan, G., Chen, S., Berry, R. M., Palmer, T., Berks, B. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Variable+stoichiometry+of+the+TatA+component+of+the+twin-arginine+protein+transport+system+observed+by+in+vivo+single-molecule+imaging.">Variable stoichiometry of the TatA component of the twin-arginine protein transport system observed by in vivo single-molecule imaging.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 105, 15376-15381 (2008).</li><li>Leake, M. C., Wilson, D., Gautel, M., Simmons, R. M., M, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+elasticity+of+single+titin+molecules+using+a+two-bead+optical+tweezers+assay.">The elasticity of single titin molecules using a two-bead optical tweezers assay.</a> Biophys. J. 87, 1112-1135 (2004).</li><li>Leake, M. C., Wilson, D., Bullard, B., Simmons, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+elasticity+of+single+kettin+molecules+using+a+two-bead+laser-tweezers+assay.">The elasticity of single kettin molecules using a two-bead laser-tweezers assay.</a> FEBS Lett. , 535-555 (2003).</li><li>Lenn, T., Leake, M. C., Mullineaux, C. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+clustering+and+dynamics+of+cytochrome+bd+complexes+in+the+Escherichia+coli+plasma+membrane.">In vivo clustering and dynamics of cytochrome bd complexes in the Escherichia coli plasma membrane.</a> Mol. Microbiol. 70, 1397-1407 (2008).</li><li>Lenn, T., Leake, M. C., Mullineaux, C. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Are+Escherichia+coli+OXPHOS+complexes+concentrated+in+specialised+zones+within+the+plasma+membrane.">Are Escherichia coli OXPHOS complexes concentrated in specialised zones within the plasma membrane.</a> Biochem. Soc. Trans. 36, 1032-1036 (2008).</li><li>Lo, C. J., Leake, M. C., Pilizota, T., Berry, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-cell+measurements+of+Membrane+Potential,+Sodium-Motive+Force+and+Flagellar+Motor+Speed+in+Escherichia+coli.">Single-cell measurements of Membrane Potential, Sodium-Motive Force and Flagellar Motor Speed in Escherichia coli.</a> Biophys. 93, 294-302 (2007).</li><li>Lo, C. J., Leake, M. C., Berry, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescence+measurement+of+intracellular+sodium+concentration+in+single+Escherichia+coli+cells.">Fluorescence measurement of intracellular sodium concentration in single Escherichia coli cells.</a> Biophys. J. 90, 357-3565 (2006).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

יש להקפיד שלא &quot;על גזירה&quot; התא מסתכל חיידקים קשור, שכן הדבר עשוי לפגום את הפונקציונליות של מנועים flagellar. חשוב להשתמש בתאי הרבה יותר משעה אחת בשקופית מיקרוסקופ שכן הם עלולים להפוך חמצן מדולדל. אופטימיזציה ניכרת ייתכן שיהיה צורך למצוא הדמיה את התנאים הטובים ביותר מי?...

visualizing single molecular complexes in vivo using advanced fluorescence microscopy

התובנה המלאה לתוך המנגנונים של תאים חיים יכולה להיות מושגת רק על ידי חוקר את תהליכי המפתח לעורר ולכוון אירועים ברמה התאית. עד כה מורכבות גזירה של מערכות ביולוגיות גרמה ניסויים מדויקים מולקולה בודדת להיות תובעני מדי, במקום התמקדות במחקרים של מערכות יחיד באמצעות בתפזורת גולמי יחסית ההרכב הממוצע מדידות. עם זאת, תהליכים חשובים רבים המתרחשים בתא החי ברמה של רק אחת או כמה מולקולות; מדידות ההרכב כלל להסוות את טבעו סטוכסטיים והטרוגניות של אירועים אלה. כאן, בעזרת מיקרוסקופיה אופטית מתקדמת כלי ניתוח אנליטיים תמונה אנחנו מדגימים כיצד לפקח חלבונים בתוך תא חי בודד החיידק עד לדיוק של מולקולות בודדות וכיצד אנו יכולים לצפות הדינמיקה בתוך קומפלקסים מולקולריים בתפקוד מכונות ביולוגיות. טכניקות רלוונטיים ישירות פיזיולוגית. הם מינימלית perturbative ולא פולשנית המדגם ביולוגי תחת לימוד מכוונים באופן מלא בחקירות בחומר חי, תכונות לא זמינים מולקולה בודדת גישות אחרות של ביופיזיקה. בנוסף, דגימות ביולוגיות למד לייצר כל חלבון fluorescently-tagged ברמות אשר כמעט זהים לצלילי תא ללא שינוי (&quot;הקידוד הגנומי&quot;), בניגוד לגישה נפוצה יותר אך פחות אידיאלי להפקת חלבון משמעותי יותר היה להתרחש באופן טבעי (&#39;פלסמיד ביטוי &quot;). לפיכך, בפועל דגימות ביולוגיות אשר תיחקר באופן משמעותי קרוב יותר אורגניזמים טבעיים, ולכן התצפיות רלוונטי יותר תהליכים פיזיולוגיים אמיתי.

Watch this Scientific Journal Video about Visualizing Single Molecular Complexes In Vivo Using Advanced Fluorescence Microscopy at JoVE.com

Visualizing Single Molecular Complexes In Vivo Using Advanced Fluorescence Microscopy

כאן אנו מדגימים את הפרוטוקולים לביצוע מולקולה בודדת מיקרוסקופ פלואורסצנטי לחיות תאים חיידקיים לאפשר קומפלקסים מולקולריים תפקודית כדי להתגלות, מעקב לכמת.

הדמיה מולקולרית מכלולים יחיד In vivo באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי מתקדם

Full insight into the mechanisms of living cells can be achieved only by investigating the key processes that elicit and direct events at a cellular ...

visualizing-single-molecular-complexes-vivo-using-advanced

Research

JoVE Journal

Biology

Visualizing Single Molecular Complexes In Vivo Using Advanced Fluorescence Microscopy

9.2K Views.  University of Oxford. כאן אנו מדגימים את הפרוטוקולים לביצוע מולקולה בודדת מיקרוסקופ פלואורסצנטי לחיות תאים חיידקיים לאפשר קומפלקסים מולקולריים תפקודית כדי להתגלות, מעקב לכמת.

Video: Visualizing Single Molecular Complexes In Vivo Using Advanced Fluorescence Microscopy

Visualizing Single-molecule DNA Replication with Fluorescence Microscopy

We describe a simple fluorescence microscopy-based real-time method for observing DNA replication at the single-molecule level. A circular, forked DNA template is attached to a functionalized glass coverslip and replicated extensively after introduction of replication proteins and nucleotides (Figure 1). The growing product double-strand DNA (dsDNA) is extended with laminar flow and visualized by using an intercalating dye. Measuring the position of the growing DNA end in real time allows precise determination of replication rate (Figure 2). Furthermore, the length of completed DNA products reports on the processivity of replication. This experiment can be performed very easily and rapidly and requires only a fluorescence microscope with a reasonably sensitive camera.


This protocol demonstrates a simple single-molecule fluorescence microscopy technique for visualizing DNA replication by individual replisomes in real time.

חזותי יחיד מולקולת הדנ&quot;א שכפול עם מיקרוסקופ פלואורסצנטי

We describe a simple fluorescence microscopy-based real-time method for observing DNA replication at the single-molecule level. A circular, forked DNA ...

Time-lapse Imaging of Mitosis After siRNA Transfection

Changes in cellular organization and chromosome dynamics that occur during mitosis are tightly coordinated to ensure accurate inheritance of genomic and cellular content. Hallmark events of mitosis, such as chromosome movement, can be readily tracked on an individual cell basis using time-lapse fluorescence microscopy of mammalian cell lines expressing specific GFP-tagged proteins. In combination with RNAi-based depletion, this can be a powerful method for pinpointing the stage(s) of mitosis where defects occur after levels of a particular protein have been lowered. In this protocol, we present a basic method for assessing the effect of depleting a potential mitotic regulatory protein on the timing of mitosis. Cells are transfected with siRNA, placed in a stage-top incubation chamber, and imaged using an automated fluorescence microscope. We describe how to use software to set up a time-lapse experiment, how to process the image sequences to make either still-image montages or movies, and how to quantify and analyze the timing of mitotic stages using a cell-line expressing mCherry-tagged histone H2B. Finally, we discuss important considerations for designing a time-lapse experiment. This strategy is complementary to other approaches and offers the advantages of 1) sensitivity to changes in kinetics that might not be observed when looking at cells as a population and 2) analysis of mitosis without the need to synchronize the cell cycle using drug treatments. The visual information from such imaging experiments not only allows the sub-stages of mitosis to be assessed, but can also provide unexpected insight that would not be apparent from cell cycle analysis by FACS.

Here we describe a basic protocol to image and quantify the mitotic timing of live mammalian tissue culture cells after siRNA transfection.

זמן לשגות הדמיה של מיטוזה לאחר transfection siRNA

Changes in cellular organization and chromosome dynamics that occur during mitosis are tightly coordinated to ensure accurate inheritance of genomic and ...

Visualizing Bacteria in Nematodes using Fluorescent Microscopy

Symbioses, the living together of two or more organisms, are widespread throughout all kingdoms of life. As two of the most ubiquitous organisms on earth, nematodes and bacteria form a wide array of symbiotic associations that range from beneficial to pathogenic 1-3. One such association is the mutually beneficial relationship between Xenorhabdus bacteria and Steinernema nematodes, which has emerged as a model system of symbiosis 4. Steinernema nematodes are entomopathogenic, using their bacterial symbiont to kill insects 5. For transmission between insect hosts, the bacteria colonize the intestine of the nematode's infective juvenile stage 6-8. Recently, several other nematode species have been shown to utilize bacteria to kill insects 9-13, and investigations have begun examining the interactions between the nematodes and bacteria in these systems 9.
We describe a method for visualization of a bacterial symbiont within or on a nematode host, taking advantage of the optical transparency of nematodes when viewed by microscopy. The bacteria are engineered to express a fluorescent protein, allowing their visualization by fluorescence microscopy. Many plasmids are available that carry genes encoding proteins that fluoresce at different wavelengths (i.e. green or red), and conjugation of plasmids from a donor Escherichia coli strain into a recipient bacterial symbiont is successful for a broad range of bacteria. The methods described were developed to investigate the association between Steinernema carpocapsae and Xenorhabdus nematophila 14. Similar methods have been used to investigate other nematode-bacterium associations 9,15-18and the approach therefore is generally applicable.
The method allows characterization of bacterial presence and localization within nematodes at different stages of development, providing insights into the nature of the association and the process of colonization 14,16,19. Microscopic analysis reveals both colonization frequency within a population and localization of bacteria to host tissues 14,16,19-21. This is an advantage over other methods of monitoring bacteria within nematode populations, such as sonication 22or grinding 23, which can provide average levels of colonization, but may not, for example, discriminate populations with a high frequency of low symbiont loads from populations with a low frequency of high symbiont loads. Discriminating the frequency and load of colonizing bacteria can be especially important when screening or characterizing bacterial mutants for colonization phenotypes 21,24. Indeed, fluorescence microscopy has been used in high throughput screening of bacterial mutants for defects in colonization 17,18, and is less laborious than other methods, including sonication 22,25-27and individual nematode dissection 28,29.

To study the mutualism between Xenorhabdus bacteria and Steinernema nematodes, methods were developed to monitor bacterial presence and location within nematodes. The experimental approach, which can be applied to other systems, entails engineering bacteria to express the green fluorescent protein and visualizing, using fluorescence microscopy bacteria within the transparent nematode.

Visualizing חיידקים בנמטודות באמצעות מיקרוסקופיה פלורסנט

 
Symbioses, the living together of two or more organisms, are widespread throughout all kingdoms of life. As two of the most ubiquitous organisms on ...

Quantitative Analysis of Autophagy using Advanced 3D Fluorescence Microscopy

Prostate cancer is the leading form of malignancies among men in the U.S. While surgery carries a significant risk of impotence and incontinence, traditional chemotherapeutic approaches have been largely unsuccessful. Hormone therapy is effective at early stage, but often fails with the eventual development of hormone-refractory tumors. We have been interested in developing therapeutics targeting specific metabolic deficiency of tumor cells. We recently showed that prostate tumor cells specifically lack an enzyme (argininosuccinate synthase, or ASS) involved in the synthesis of the amino acid arginine1. This condition causes the tumor cells to become dependent on exogenous arginine, and they undergo metabolic stress when free arginine is depleted by arginine deiminase (ADI)1,10. Indeed, we have shown that human prostate cancer cells CWR22Rv1 are effectively killed by ADI with caspase-independent apoptosis and aggressive autophagy (or macroautophagy)1,2,3. Autophagy is an evolutionarily-conserved process that allows cells to metabolize unwanted proteins by lysosomal breakdown during nutritional starvation4,5. Although the essential components of this pathway are well-characterized6,7,8,9, many aspects of the molecular mechanism are still unclear - in particular, what is the role of autophagy in the death-response of prostate cancer cells after ADI treatment? In order to address this question, we required an experimental method to measure the level and extent of autophagic response in cells - and since there are no known molecular markers that can accurately track this process, we chose to develop an imaging-based approach, using quantitative 3D fluorescence microscopy11,12.
Using CWR22Rv1 cells specifically-labeled with fluorescent probes for autophagosomes and lysosomes, we show that 3D image stacks acquired with either widefield deconvolution microscopy (and later, with super-resolution, structured-illumination microscopy) can clearly capture the early stages of autophagy induction. With commercially available digital image analysis applications, we can readily obtain statistical information about autophagosome and lysosome number, size, distribution, and degree of colocalization from any imaged cell. This information allows us to precisely track the progress of autophagy in living cells and enables our continued investigation into the role of autophagy in cancer chemotherapy.

Autophagy is a ubiquitous process that enables cells to degrade and recycle proteins and organelles. We apply advanced fluorescence microscopy to visualize and quantify the small, but essential, physical changes associated with the induction of autophagy, including the formation and distribution of autophagosomes and lysosomes, and their fusion into autolysosomes.

ניתוח כמותי של Autophagy באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי 3D מתקדם

Prostate cancer is the leading form of malignancies among men in the U.S. While surgery carries a significant risk of impotence and incontinence, ...

Visualizing Cytoplasmic Flow During Single-cell Wound Healing in Stentor coeruleus

Although wound-healing is often addressed at the level of whole tissues, in many cases individual cells are able to heal wounds within themselves, repairing broken cell membrane before the cellular contents leak out. The giant unicellular organism Stentor coeruleus, in which cells can be more than one millimeter in size, have been a classical model organism for studying wound healing in single cells. Stentor cells can be cut in half without loss of viability, and can even be cut and grafted together. But this high tolerance to cutting raises the question of why the cytoplasm does not simply flow out from the size of the cut. Here we present a method for cutting Stentor cells while simultaneously imaging the movement of cytoplasm in the vicinity of the cut at high spatial and temporal resolution. The key to our method is to use a &#34;double decker&#34; microscope configuration in which the surgery is performed under a dissecting microscope focused on a chamber that is simultaneously viewed from below at high resolution using an inverted microscope with a high NA lens. This setup allows a high level of control over the surgical procedure while still permitting high resolution tracking of cytoplasm.

Visualizing Cytoplasmic Flow During Single-cell Wound Healing in Stentor coeruleus

The giant ciliate Stentor coeruleus is a classical system for studying regeneration and wound healing in single cells.&#160;By imaging Stentor cells simultaneously at low and high magnification it is possible to measure cytoplasmic flows before, during, and after wounding.

Although wound-healing is often addressed at the level of whole tissues, in many cases individual cells are able to heal wounds within themselves, ...

Rapid Analysis and Exploration of Fluorescence Microscopy Images

Despite rapid advances in high-throughput microscopy, quantitative image-based assays still pose significant challenges. While a variety of specialized image analysis tools are available, most traditional image-analysis-based workflows have steep learning curves (for fine tuning of analysis parameters) and result in long turnaround times between imaging and analysis. In particular, cell segmentation, the process of identifying individual cells in an image, is a major bottleneck in this regard.
Here we present an alternate, cell-segmentation-free workflow based on PhenoRipper, an open-source software platform designed for the rapid analysis and exploration of microscopy images. The pipeline presented here is optimized for immunofluorescence microscopy images of cell cultures and requires minimal user intervention. Within half an hour, PhenoRipper can analyze data from a typical 96-well experiment and generate image profiles. Users can then visually explore their data, perform quality control on their experiment, ensure response to perturbations and check reproducibility of replicates. This facilitates a rapid feedback cycle between analysis and experiment, which is crucial during assay optimization. This protocol is useful not just as a first pass analysis for quality control, but also may be used as an end-to-end solution, especially for screening. The workflow described here scales to large data sets such as those generated by high-throughput screens, and has been shown to group experimental conditions by phenotype accurately over a wide range of biological systems. The PhenoBrowser interface provides an intuitive framework to explore the phenotypic space and relate image properties to biological annotations. Taken together, the protocol described here will lower the barriers to adopting quantitative analysis of image based screens.

Here we describe a workflow for rapidly analyzing and exploring collections of fluorescence microscopy images using PhenoRipper, a recently developed image-analysis platform.

ראפיד ניתוח וחקירה של תמונות מיקרוסקופ פלואורסצנטי

Despite rapid advances in high-throughput microscopy, quantitative image-based assays still pose significant challenges. While a variety of specialized ...

Visualizing Stromule Frequency with Fluorescence Microscopy

Stromules, or "stroma-filled tubules", are narrow, tubular extensions from the surface of the chloroplast that are universally observed in plant cells but whose functions remain mysterious. Alongside growing attention on the role of chloroplasts in coordinating plant responses to stress, interest in stromules and their relationship to chloroplast signaling dynamics has increased in recent years, aided by advances in fluorescence microscopy and protein fluorophores that allow for rapid, accurate visualization of stromule dynamics. Here, we provide detailed protocols to assay stromule frequency in the epidermal chloroplasts of Nicotiana benthamiana, an excellent model system for investigating chloroplast stromule biology. We also provide methods for visualizing chloroplast stromules in vitro by extracting chloroplasts from leaves. Finally, we outline sampling strategies and statistical approaches to analyze differences in stromule frequencies in response to stimuli, such as environmental stress, chemical treatments, or gene silencing. Researchers can use these protocols as a starting point to develop new methods for innovative experiments to explore how and why chloroplasts make stromules.

Protocols to investigate the dynamics of chloroplast stromules, the stroma-filled tubules that extend from the surface of chloroplasts, are described.

חזותי תדר Stromule עם מיקרוסקופ פלואורסצנטי

Stromules, or "stroma-filled tubules", are narrow, tubular extensions from the surface of the chloroplast that are universally observed in plant cells but ...

Functional Imaging of Viral Transcription Factories Using 3D Fluorescence Microscopy

It is well known that spatial and temporal regulation of genes is an integral part of governing proper gene expression. Consequently, it is invaluable to understand where and when transcription is taking place within nuclear space and to visualize the relationship between episomes infected within the same cell's nucleus. Here, both immunofluorescence (IFA) and RNA-FISH have been combinedto identify actively transcribing Kaposi's sarcoma-associated herpesvirus (KSHV) episomes. By staining KSHV latency-associated nuclear antigen (LANA), it is possible to locate where viral episomes exist within the nucleus. In addition, by designing RNA-FISH probes to target the intron region of a viral gene, which is expressed only during productive infection, nascent RNA transcripts can be located. Using this combination of molecular probes, it is possible to visualize the assembly of large viral transcription factories and analyze the spatial regulation of viral gene expression during KSHV reactivation. By including anti-RNA polymerase II antibody staining, one can also visualize the association between RNA polymerase II (RNAPII) aggregation and KSHV transcription during reactivation.

Viral transcriptional factories are discrete structures that are enriched with cellular RNA polymerase II to increase viral gene transcription during reactivation. Here, a method to locate sites of actively transcribing viral chromatin in 3D nuclear space by a combination of immunofluorescence staining and in situ RNA hybridization is described.

הדמיה תפקודית של מפעלי שעתוק ויראלי באמצעות מיקרוסקופ פלורסצנטיות תלת-ממד

It is well known that spatial and temporal regulation of genes is an integral part of governing proper gene expression. Consequently, it is invaluable to ...

Visualizing Lymph Node Structure and Cellular Localization using Ex-Vivo Confocal Microscopy

Lymph nodes (LNs) are organs spread within the body, where the innate immune responses can connect with the adaptive immunity. In fact, LNs are strategically interposed in the path of the lymphatic vessels, allowing intimate contact of tissue antigens with all resident immune cells in the LN. Thus, understanding the cellular composition, distribution, location and interaction using ex vivo whole LN imaging will add to the knowledge on how the body coordinates local and systemic immune responses. This protocol shows an ex vivo imaging strategy following an in vivo administration of fluorescent-labeled antibodies that allows a very reproducible and easy-to-perform methodology by using conventional confocal microscopes and stock reagents. Through subcutaneous injection of antibodies, it is possible to label different cell populations in draining LNs without affecting tissue structures that can be potentially damaged by a conventional immunofluorescence microscopy technique.

This protocol describes a technique to image different cell populations in draining lymph nodes without alterations in the organ structure.

חזותי מבנה צומת לימפה ולוקליזציה לסלולר באמצעות Ex-Vivo Confocal מיקרוסקופ

Lymph nodes (LNs) are organs spread within the body, where the innate immune responses can connect with the adaptive immunity. In fact, LNs are ...

Examination of Mitotic and Meiotic Fission Yeast Nuclear Dynamics by Fluorescence Live-cell Microscopy

Live-cell imaging is a microscopy technique used to examine cell and protein dynamics in living cells. This imaging method is not toxic, generally does not interfere with cell physiology, and requires minimal experimental handling. The low levels of technical interference enable researchers to study cells across multiple cycles of mitosis and to observe meiosis from beginning to end. Using fluorescent tags such as Green Fluorescent Protein (GFP) and Red Fluorescent Protein (RFP), researchers can analyze different factors whose functions are important for processes like transcription, DNA replication, cohesion, and segregation. Coupled with data analysis using Fiji (a free, optimized ImageJ version), live-cell imaging offers various ways of assessing protein movement, localization, stability, and timing, as well as nuclear dynamics and chromosome segregation. However, as is the case with other microscopy methods, live-cell imaging is limited by the intrinsic properties of light, which put a limit to the resolution power at high magnifications, and is also sensitive to photobleaching or phototoxicity at high wavelength frequencies. However, with some care, investigators can bypass these physical limitations by carefully choosing the right conditions, strains, and fluorescent markers to allow for the appropriate visualization of mitotic and meiotic events.

Here, we present live-cell imaging which is a non-toxic microscopy method that allows researchers to study protein behavior and nuclear dynamics in living fission yeast cells during mitosis and meiosis.

בחינת Mitotic ומיוטיק ביקוע הדינמיקה הגרעינית על ידי הזריחה לחיות-מיקרוסקופ התא

Live-cell imaging is a microscopy technique used to examine cell and protein dynamics in living cells. This imaging method is not toxic, generally does ...