وأيد هذا العمل من قبل المعاهد الوطنية الأميركية للصحة منح NS-024572 (لRSW).

1. إعداد وصمة عار مع الأصباغ فوق حيوي <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لبروتوكول تشريح سام ثعبان رؤية ستيوارت وآخرون. 5 وتنغ وآخرون لا يزال 6 الأنسجة زاحف الفسيولوجية لأوقات أطول، وأقل التلوث الجرثومي، عندما يحتفظ بها في درجات حرارة منخفضة (انظر أدناه). وعادة ما يتم الاحتفاظ أنسجة الثدييات في درجة حرارة الغرفة أو أعلى. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لالليزوزومية صبغ تلطيخ الحيوية، ويحل الصبغة في البرد الزواحف 1:5،000 الحل قارعو الأجراس (0.2 ميكرومتر). احتضان عند 4 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة. يغسل عدة مرات مع قارعو الأجراس الباردة. صورة في أقرب وقت ممكن. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لFM1-43 تلطيخ باستخدام التحفيز بوكل، ويخفف من الصبغة في عالية بوكل-قارعو الأجراس 1:500 (7 ميكرومتر). احتضان عند 4 درجة مئوية لمدة 30-60 ثانية كحد أقصى. يغسل ثلاث مرات بسرعة مع قارعو الأجراس الباردة، ~ 1 دقيقة / الشطف. صورة في أقرب وقت ممكن. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لFM1-43 تلطيخ باستخدام مفرط التوتر (السكروز) التحفيز، ويخفف من الصبغة في 0.5 M قارعو الأجراس السكروز على النحو الوارد أعلاه. احتضان عند 4 &amp; #176؛ مئوية لمدة 2-5 دقيقة. يغسل كما في الخطوة 1.3 أعلاه مع قارعو الأجراس الباردة. صورة في أقرب وقت ممكن. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لFM1-43 تلطيخ عبر التحفيز الكهربائي، انظر تنغ وآخرون. 6 لفترة وجيزة، يتم وضع إعداد طبق يحتوي على محلول ملحي الفسيولوجية والصبغة. يتم تحفيز العصب مع قطار مبرمج مسبقا من 200 μsec البقول مستطيلة (~ 7 V، 30 هرتز، 18 μsec). يغسل كما في الخطوة 1.3 أعلاه مع قارعو الأجراس الباردة. صورة في أقرب وقت ممكن. </li></ol> 2. تكوين إعداد للتصوير <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> توجيه إعداد بحيث هياكل الفائدة في أقرب وقت ممكن إلى الهدف المجهر. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إذا تم استخدام مجهر مقلوب، واستخدام غرفة التي تحتوي على رقيقة جولة زلة تغطية القاع. عادة، يجب أن يكون غرفة التصوير رقيقة أسفل الفولاذ المقاوم للصدأ مع 25 مم # 1 كوب سمك الغطاء زلة في المركز. إذا تم استخدام المجهر تستقيم، لا يشترط ساترة القاع ولكن من المفيدللسماح التصوير مع ضوء المنقولة (مثل تدخل الفرق النقيض من ذلك، DIC) لتوجيه العينة وتحديد مواقع الأشياء المثيرة للاهتمام. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> اختيار الهدف المناسب للحصول على أعلى دقة ممكنة 3D. هناك مفاضلات بين الفتحة العددية (غير متوفر)، بعد العمل، التكبير، ونوع من عدسة (الجاف، المياه والنفط الغمر). لمستحضرات رقيقة مثل مزارع الأنسجة، والأهداف النفط هي الأفضل. باستخدام المجهر تستقيم، تطفو زلة تغطية على حمام مائي، واستخدام زيت الغمر بين الجزء العلوي من الغطاء زلة وموضوعية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إذا تم استخدام البرمجيات deconvolution، البائع قد تقدم سلفا انتشار نقطة ظائف (PSFS) لتحقيق أهداف معينة. إذا لم يتم توفير هذه المعلومات، أو إذا ما تم اختيار هدف غير معتمد، وتحديد PSF عن طريق التصوير microdots الفلورسنت أو الأجسام محدودة حيود مماثلة 7،8. </li></ol> 3. تأسيس العمق المرغوب الميدانية وعدد إيماغيس المرغوب في الوقت الفاصل بين الإطار <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> حدد عمق إجمالي قدره حقل بحيث تتحرك أو التفاعل هياكل الفائدة لا تختفي أو الخروج من التركيز لأنها تتحرك في اتجاه زي. في الميدان ض يجب أن يتجاوز قليلا البعد العمودي للعملية الخلية أو الخلايا التي يجري تصويرها. لمحطات السيارات الفقاريات، 15-20 ميكرومتر هو نموذجي. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> حساب الخطوة ض محور اللازمة لكل زيادة التركيز. القرار على طول محور ض يختلف تبعا خصائص الهدف؛ فهو يقع في حوالي ربع هذا القرار الطائرة س ص. إذا تم استخدام إما التصوير متحد البؤر أو برامج deconvolution، تم تحسين القرار ض محور. تحسين القرار النهائي من قبل الإفراط المتعمد في اتجاه زي 5، ولكن انظر أيضا الخطوة 3.3 أدناه. فاصل خطوة نموذجية في نطاق من 400-1،500 نانومتر لأهداف 40-100X. ينبغي أن أغلقت ضوء قبالة بين كل صورة ض الخطوة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> حدد عدد الصور في كل ض المكدس، وهما العمق المطلوب من حقل تقسيمقبل الفاصل الخطوة. الوقت لاستكمال نموذجي ض المكدس هو 1-10 ثانية. الأجسام التي تتحرك بسرعة (100 نيوتن متر / ثانية) يمكن أن تظهر واضحة في صورة كومة 3D لأن كل صورة الطائرة يتوافق مع نقطة زمنية مختلفة قليلا. أيضا، يساهم كل صورة إضافية لphotobleaching من والضيائية ممكن (انظر مناقشة). إذا تنتمي إما الوضع، واختيار أكبر ض خطوة لجمع الصور أقل في المكدس. تعويض في وقت لاحق باستخدام برنامج صورة الاستيفاء (الخطوة 6.3 أدناه). </li></ol> 4 حدد الوقت الفاصل بين معدل الإطار تختار من التجريب المعدل الذي هو مجرد كافية لحل بسلاسة يتغير مع الزمن مثل الحركة، أو تفاعلات الأحداث الانصهار 9. تحت أخذ العينات يمكن أن تنتج الحركة الفنية (أخطاء أخذ العينات)، في حين أن الإفراط يزيد التعرض للضوء دون داع. جمع إما سلسلة طويلة واحدة أو عدة سلاسل متكررة من نفس التحضير، مع كل فترة زمنية صغيرة نسبيا الوقت الإجمالي ( <eم&gt; على سبيل المثال 10 نقاط زمنية × 30 ثانية فاصل = 5 دقائق). إذا كان ذلك ممكنا، مع إعداد عرض مستمر epifluorescence الإضاءة إلى ما يقرب من سرعات الحركة التقدير، بما في ذلك الانجراف من إعداد كامل إذا كان موجودا. 5. أكمل جميع تصوير لايف لإعداد خاص ولا تزال الاستعدادات الزواحف عادة قوية ل~ 1-2 ساعة، أطول إذا تبريده. 6. تحليل البيانات وفقا لاستخدام المرغوب <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الاحتفاظ بجميع ملفات البيانات الخام. بينما التخزين الرقمية هي عادة ليست مشكلة، زمن هو كبير حتى مع أجهزة الكمبيوتر الشخصية بسرعة أو محطات العمل. لهذا السبب، والصور المحاصيل في المنطقة ذات الاهتمام [ROI]. أؤكد أن المنطقة بأسرها من الفائدة في إطار اقتصاص خلال طوال الوقت. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Deconvolve صورة مداخن باستخدام البرمجيات المناسبة والصحيحة انتشار نقطة وظيفة. تأكيد تم تحسين هذا القرار والتي تم إنشاؤها من قبل أي قطعة أثريةخوارزمية deconvolution. ويبين الشكل 3 مثالا الصور. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> استخدام خوارزمية الاستيفاء لتوسيع محور ض قرار واضح. واقترح التوسع 6X من الصورة الفعلية 1.5 ميكرون فصل الطائرة إلى 0.25 ميكرون واضحة الانفصال. بدلا من ذلك، استخدام بعض مزيج من الإفراط (الخطوة 3.2) والاستيفاء. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> أداء النقيض من ذلك، السطوع، وتصفية الضوضاء، photobleaching من التعديلات ومعالجة الصور النمطية الأخرى إذا رغبت في ذلك. معايير التلاعب صورة تملي أنه بالنسبة لمعظم الأعمال العلمية، فمن المناسب أن نفس التصحيحات تطبيقها على جميع الصور، سواء داخل كومة وعند نقاط زمنية مختلفة. ينبغي تقييم نتيجة لتسوية خاصة بين جميع الصور 9. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> حدد وضع عرض خاص لتصدير البيانات. العرض الأكثر وضوحا هو الفيديو ستيريو باستخدام إما anaglyphs الأحمر والأخضر أو الأحمر والأزرق (الأمثلة في الشكل 3)، أزواج ستيريو، أو بالتناوب يسار / righإطارات ر العين مع نظارات المصراع. Anaglyphs تقتصر على لون واحد. تعزيز عمق الصورة واضحة إذا رغبت في تحسين محور ض القرار البصرية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تجربة مع مختلف التصفية وتقنيات تعزيز الصورة. على سبيل المثال، والترشيح ابلاس الرياضية مفيد لزيادة النقيض من الهياكل صغيرة فوق الخلفية. ومما يعزز سطوع بكسل في وسط نافذة تشغيل بينما يتم تقليل سطوع المناطق المحيطة بها. نلاحظ أن بعض وسائل التصفية لا تعمل بشكل جيد في الجمع. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تطبيق تصحيح الانحراف إذا كان هناك حركة كبيرة للإعداد مع مرور الوقت. هذه الحركة هو شائع في العضلات الحية، حتى مع إضافة الأدوية لقمع إمكانات العمل وإمكانات متشابك. خوارزمية تسجيل بكسل (على سبيل المثال. IMARIS، أدوبي رجعية، TurboReg المساعد ليماغيج) محاذاة الصور الوقت الفاصل بين ويمكن أن تقلل، ولكن عادة لا تقضي تماما، مثل الحركة. </li></ol>

<ol>
	<li>Frigault, M. M., Lacoste, J., Swift, J. L., Brown, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Live-cell+microscopy-tips+and+tools.">Live-cell microscopy-tips and tools.</a> J. Cell Sci. 122 (6), 753-767 (2009).</li><li>Tinevez, J. -. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+quantitative+method+for+measuring+phototoxicity+of+a+live+cell+imaging+microscope.">A quantitative method for measuring phototoxicity of a live cell imaging microscope.</a> Meth. Enzymol. 506, 291-309 (2012).</li><li>Dunn, K. W., Kamocka, M. M., McDonald, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+practical+guide+to+evaluating+colocalization+in+biological+microscopy.">A practical guide to evaluating colocalization in biological microscopy.</a> Am. J. Physiol. Cell Physiol. 300, (2011).</li><li>Snapp, E. L., Hegde, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rational+design+and+evaluation+of+FRETexperiments+to+measure+proteinproximities+in+cells.">Rational design and evaluation of FRETexperiments to measure proteinproximities in cells.</a> Curr. Protoc. Cell Biol. 17, (2006).</li><li>Stewart, R. S., Teng, H., Wilkinson, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Late"+macroendosomes+and+acidic+endosomes+in+vertebrate+motor+nerve+terminals.">Late" macroendosomes and acidic endosomes in vertebrate motor nerve terminals.</a> J. Comp. Neurol. 520, 4275-4293 (2012).</li><li>Teng, H., Lin, M. Y., Wilkinson, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Macroendocytosis+and+endosome+processing+in+snake+motor+boutons.">Macroendocytosis and endosome processing in snake motor boutons.</a> J. Physiol. 582, 243-262 (2007).</li><li>McNally, J. G., Karpova, T., Cooper, J., Conchello, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-dimensional+imaging+by+deconvolution+microscopy.">Three-dimensional imaging by deconvolution microscopy.</a> Methods. 19, 373-385 (1999).</li><li>Swedlow, J. R., Platani, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Live+cell+imaging+using+wide-field+microscopy+and+deconvolution.">Live cell imaging using wide-field microscopy and deconvolution.</a> Cell Struct. Funct. 27, 335-341 (2002).</li><li>Cromey, D. W., Taatjes, D. J., Roth, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Digital+images+are+data:+and+should+be+treated+as+such.">Digital images are data: and should be treated as such.</a> Methods Mol. Biol. 931, 1-27 (2013).</li><li>Teng, H., Wilkinson, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clathrin-mediated+endocytosis+near+active+zones+in+snake+motor+terminals.">Clathrin-mediated endocytosis near active zones in snake motor terminals.</a> J. Neurosci. 20 (21), 7986-7993 (2000).</li><li>Teng, H., Cole, J. C., Roberts, R. L., Wilkinson, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endocytic+active+zones:+hot+spots+for+endocytosis+in+vertebrate+nerve+terminals.">Endocytic active zones: hot spots for endocytosis in vertebrate nerve terminals.</a> J. Neurosci. 19 (12), 4855-4866 (1999).</li><li>Tan, T. T. T., Khaw, C., Ng, M. M. L., Mendez-Vilas, A., Diaz, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Challenges+and+recent+advances+in+live+cell+bioimaging.">Challenges and recent advances in live cell bioimaging.</a> Microscopy: Science, Technology, Applications and Education. , 1495-1505 (2010).</li><li>Verbrugghe, K. J. C., Chan, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+C.+elegans+embryos+using+an+epifluorescent+microscope+and+open+source+software.">Imaging C. elegans embryos using an epifluorescent microscope and open source software.</a> J. Vis. Exp. (49), (2011).</li></ol>

الكتاب تعلن أي المصالح المالية المتنافسة.

الجانب الأكثر أهمية من التصوير 4D هو إدارة مدة وشدة التعرض للضوء. photobleaching من النقصان صورة نسبة الإشارة إلى الضوضاء ويمكن أن يكون مشكلة أم لا اعتمادا على عوامل مختلفة، بما في ذلك اختيار fluorophores. ويرتبط الضرر غير محددة لالأنسجة الحية (الضيائية) لphotobleaching من، ويمكن في بعض ا...

الوقت الفاصل بين التصوير من الأنسجة الحية يوفر الوصول البصرية للعلاقات هيكل الوظائف الديناميكية التي لا يمكن تقديره في الأعمال التحضيرية ثابتة أو يعيشون تصويرها عند نقطة واحدة في الوقت المناسب. في كثير من الأحيان، ومع ذلك، والمقايضة للحصول على المعلومات الزمانية هو انخفاض في القرار البصرية. الأهداف النفط الغمر عالية الفتحة العددية هي غير عملي في الأنسجة الحية بسبب نطاق ضيق على التركيز، وترك الغمر بالماء أو أهداف الجافة باعتبارها بدائل فقط. وعلاوة على ذلك، فإن قرار زيادة يوفرها البصريات متحد البؤر لا يمكن استخدامها في بعض الاستعدادات المعيشة بسبب الضيائية من مستويات عالية نسبيا من الإضاءة المطلوبة 1،2. أخيرا، في حين أن العديد من الوقت الحقيقي أو الوقت الفاصل بين التقنيات البصرية المتاحة التي عرض القرار المحسن تطبيقها يقتصر على الاستعدادات حيث يمكن وضعه داخل هياكل الفائدة بضع مئات نانومتر الهدف 1. الطريقة الموضحةيجعل من استخدام المعدات قليلة التكلفة نسبيا، هي متعددة، ولكن يقدم تحسين القرار مقارنة استخداما أكثر التقنيات مرور الزمن. الغرض منه هو للاستخدام في المختبرات الفردية فضلا عن مرافق التصوير. يستخدم الأسلوب المجهري epifluorescence التقليدية، جنبا إلى جنب مع كاميرا رقمية حساسة ومع الأجهزة المصممة لاكتساب بسرعة مجموعات من الصور في طائرات التنسيق مختلفة قليلا (ض مداخن). وdeconvolved كل ض المكدس رقميا لزيادة القرار. ميزة واحدة من 3D مرور الزمن (4D) التصوير هو تتبع دقيق من العضيات تتحرك أو غيرها من الهياكل. عند تعيين بشكل صحيح حتى والهياكل المصورة لا يخرجون من التركيز، والحركة في كل الاتجاهات الثلاثة يمكن ملاحظتها وقياسها. وبالتالي فإنه من المستحيل لهيكل الملون لتختفي على واحد أو أكثر من لقطة مرور الزمن بمجرد الانجراف أعلاه أو أدناه البؤري الضيقة. يخدم الأسلوب أيضا كأداة حساسة لتقييم التفاعلات وممكن فوسيون هياكل صغيرة. epifluorescence التقليدية أو الصور متحد البؤر هياكل بالقرب من الحد حيود (بضع مئات نانومتر) لا تؤكد الانصهار حتى لو تظهر الصور اندمجت التداخل من التسميات كل منهما 3. ويقترح الانصهار، ولكنه لا يزال من الممكن أن يتم فصل الكائنات أفقيا أو رأسيا لمسافة التي هي أقل من الحد الحيود. ثلاثة أو التصوير رباعي الأبعاد، في المقابل، يسمح بمشاهدة الكائنات في كل من ثلاثة اتجاهات متعامدة. مظهر الانصهار في جميع وجهات النظر الثلاثة يزيد من مستوى اليقين. وفي بعض الاستعدادات المعيشة، وجهت الحركة البراونية أو الأجسام تنصهر مزعومة يوفر دليلا آخر عند نقل كل التسميات معا في الوقت المناسب. بطبيعة الحال، عندما بالقرب من الحد حيود مستوى اليقين في الهياكل المميزين من الخلفية، أو التي تبين أنها تحتوي على اثنين من الأصباغ (الانصهار)، ليست مطلقة. إذا، تقنيات متخصصة للتطبيق، مثل مضان بالرنين نقل الطاقة (الحنق)4، هي أكثر ملاءمة.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:720px;" width="720">
	<colgroup>
		<col span="4" />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:42px;width:180px;">Name of Material/ Equipment</td>
			<td style="width:180px;">Company</td>
			<td style="width:180px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:180px;">Comments</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;"></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:21px;">Reagents:</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">SGC5</td>
			<td>Biotium [Hayward, CA]</td>
			<td>70057</td>
			<td>Final conc:10 mM</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">FM1-43FX</td>
			<td>Invitrogen [Carlsbad, CA]</td>
			<td>F35335</td>
			<td>Final conc:7 mM</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">LysoTracker Red</td>
			<td>Invitrogen [Carlsbad, CA]</td>
			<td>L7528</td>
			<td>Final conc:0.2 mM</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;"></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:21px;">Solutions:</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Reptilian Ringers pH 7.2</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">NaCl</td>
			<td>145 mM</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">KCl</td>
			<td>2.5&#160; mM</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:25px;">CaCl2</td>
			<td>3.6&#160; mM</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:25px;">MgSO4</td>
			<td>1.8&#160; mM</td>
			<td style="width:180px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:25px;">KH2PO4 (Dibasic)</td>
			<td>1.0&#160; mM</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">HEPES</td>
			<td>5.0&#160; mM</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;"></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td colspan="2" height="20" style="height:21px;">High KCL Reptilian Ringers pH 7.2</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">NaCl</td>
			<td>&#160;86&#160; mM</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">KCl</td>
			<td>&#160;60&#160; mM</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:25px;">CaCl2</td>
			<td>3.6&#160; mM</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:25px;">MgSO4</td>
			<td>1.8&#160; mM</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:25px;">KH2PO4 (Dibasic)</td>
			<td>1.0&#160; mM</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">HEPES</td>
			<td>5.0&#160; mM</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;"></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td colspan="2" height="20" style="height:21px;">High Sucrose Ringers pH 7.2</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">NaCl</td>
			<td>145 mM</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">KCl</td>
			<td>2. 5 mM</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:25px;">CaCl2</td>
			<td>3.6&#160; mM</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:25px;">MgSO4</td>
			<td>1.8&#160; mM</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:25px;">KH2PO4 (Dibasic)</td>
			<td>1.0&#160; mM</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">HEPES</td>
			<td>5.0&#160; mM</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Sucrose</td>
			<td>0.5 M (17.1 gm/50 mL)</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;"></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;"></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:21px;">Equipment:</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:21px;">Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Comments</td>
			<td>Comments(website)</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:21px;">Axioplan 200 inverted microscope</td>
			<td colspan="2">Carl Zeiss [Thornwood, NY]</td>
			<td><a href="http://www.zeiss.com/">www.zeiss.com</a></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:21px;">N-Achroplan 63X water objective; n.a.=0.9; Working distance=2.4mm&#160;</td>
			<td colspan="2">Carl Zeiss [Thornwood, NY]</td>
			<td><a href="http://www.zeiss.com/">www.zeiss.com</a></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:21px;">DG4 combination light source/excitation filterwheel switcher</td>
			<td>Sutter instruments [Novato, CA]</td>
			<td>175W Xenon arc lamp</td>
			<td><a href="http://www.sutter.com/">www.sutter.com</a></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:21px;">Lambda 10-2&#160; emission filterwheel switcher</td>
			<td colspan="2">Sutter instruments [Novato, CA]</td>
			<td><a href="http://www.sutter.com/">www.sutter.com</a></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Sensicam CCD camera</td>
			<td colspan="2">Cooke Instruments [Tonawanda, NY]</td>
			<td><a href="http://www.cookecorp.com/">www.cookecorp.com</a></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Cascade 512 CCD camera</td>
			<td colspan="2">Photometrics [Tucson, AZ]</td>
			<td><a href="http://www.photometrics.com/">www.photometrics.com</a></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td colspan="4" height="20" style="height:20px;">Imaging dishes- made in-house-11cm dia.; 25 mm dia. #1 coverslip embedded; magnetic pins</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;"></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Software:</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Comments</td>
			<td>Comments(website)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Slidebook 5.0</td>
			<td>Intelligent Imaging Innovations [Denver, CO]</td>
			<td>Deconvolution; Drift correction;3D and 4D data presentation</td>
			<td><a href="http://www.intelligent-imaging.com/">www.intelligent-imaging.com</a></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">IMARIS 7.5.2</td>
			<td>Bitplane [South Windsor, CT]</td>
			<td>Drift correction; 3D and 4D data presentation</td>
			<td><a href="http://www.bitplane.com/">www.bitplane.com</a></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">AfterEffects CS6</td>
			<td>Adobe [San Jose, CA]</td>
			<td>Drift correction</td>
			<td><a href="http://www.adobe.com/">www.adobe.com</a></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">ImageJ 1.46</td>
			<td>National Institutes of Health [Bethesda, MD]</td>
			<td>Multiple plugins available;Stereo pair construction</td>
			<td><a href="http://rsbweb.nih.gov/ij">http://rsbweb.nih.gov/ij</a></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Zeiss LSM</td>
			<td>Carl Zeiss [Thornwood, NY]</td>
			<td>Stereo pair construction</td>
			<td><a href="http://www.zeiss.com/">www.zeiss.com</a></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

visualization of endosome dynamics in living nerve terminals with four-dimensional fluorescence imaging

وقد استخدمت رباعي الأبعاد (4D) التصوير ضوء لدراسة سلوك هياكل صغيرة داخل المحطات العصب المحرك للالمستعرضة البطنية العضلات رقيقة من ثعبان سام. تضم البيانات الخام تسلسل الوقت الفاصل بين ل3D ض المداخن. كل كومة يحتوي على 4-20 الصور المكتسبة مع عدسات epifluorescence في طائرات التنسيق مفصولة 400-1،500 نانومتر. الخطوات في اكتساب مداخن صورة، مثل تعديل التركيز، والتحول من موجات الإثارة، وتشغيل الكاميرا الرقمية، ومؤتمتة قدر الإمكان لزيادة معدل الصورة وتقليل تلف الأنسجة من التعرض للضوء. بعد الاستحواذ، وdeconvolved مجموعة من مداخن صورة لتحسين القرار المكانية، وتحويلها إلى شكل 3D المطلوب، واستخدامها لإنشاء &quot;فيلم&quot; 4D التي هي مناسبة لمجموعة متنوعة من التحليلات التي تعتمد على الكمبيوتر، اعتمادا على البيانات التجريبية المطلوبة. طلب واحد هو دراسة السلوك الديناميكي للفئتين من الإندوسومات جدت في الأعصاب الطرفية-macroendosomes (MES)والإندوسومات الحمضية (AES) الذي أحجام (200-800 نانومتر لكلا النوعين) هي في أو بالقرب من الحد الحيود. الوصول إلى المعلومات 3D في كل نقطة زمنية يوفر العديد من المزايا التقليدية الوقت الفاصل بين التصوير. على وجه الخصوص، وحجم وسرعة حركة الهياكل يمكن قياسها كميا مع مرور الوقت من دون فقدان التركيز الشديد. أمثلة من البيانات من 4D التصوير تكشف عن أن محلات الصرافة الاقتراب من غشاء البلازما وتختفي، مما يشير إلى أنهم exocytosed بدلا من مجرد التحرك عموديا بعيدا عن طائرة واحدة من التركيز. وكشف أيضا هو الانصهار المفترضة من محلات الصرافة وكيانات، من خلال التصور من التداخل بين الهياكل التي تحتوي على صبغة اثنين كما شوهدت في كل ثلاثة إسقاطات المتعامدة.

البيانات المعروضة هي من المحطات ثعبان العصبي العضلي (انظر الآراء المنخفضة والعالية التكبير في الشكل 3، وصبغ التقامي (FM1-43) امتصاص يخلق الضباب الذي يملأ كل حبة)، وعلى وجه الخصوص، macroendosomes (MES) والإندوسومات الحمضية (AES) داخل هذه المحطات 5. يتم إنشاء محلات الص?...

Watch this Scientific Journal Video about Visualization of Endosome Dynamics in Living Nerve Terminals with Four-dimensional Fluorescence Imaging at JoVE.com

Visualization of Endosome Dynamics in Living Nerve Terminals with Four-dimensional Fluorescence Imaging

ويستخدم رباعي الأبعاد (4D) التصوير لدراسة السلوك والتفاعلات بين نوعين من الإندوسومات في العيش المحطات العصبية الفقاريات. وتتميز حركة هذه الهياكل الصغيرة في ثلاثة أبعاد، والسماح تأكيد الأحداث مثل الانصهار جسيم داخلي وإيماس.

تصور جسيم داخلي حيوية في محطات عصب المعيشة مع رباعية الابعاد التصوير الإسفار

Four-dimensional (4D) light imaging has been used to study behavior of small structures within motor nerve terminals of the thin transversus abdominis ...

visualization-endosome-dynamics-living-nerve-terminals-with-four

Research

JoVE Journal

Neuroscience

8.9K Views.  Washington University School of Medicine.  ويستخدم رباعي الأبعاد (4D) التصوير لدراسة السلوك والتفاعلات بين نوعين من الإندوسومات في العيش المحطات العصبية الفقاريات. وتتميز حركة هذه الهياكل الصغيرة في ثلاثة أبعاد، والسماح تأكيد الأحداث مثل الانصهار جسيم داخلي وإيماس. 

Video: Visualization of Endosome Dynamics in Living Nerve Terminals with Four-dimensional Fluorescence Imaging

Preparation of Living Isolated Vertebrate Photoreceptor Cells for Fluorescence Imaging

In the vertebrate retina, phototransduction, the conversion of light to an electrical signal, is carried out by the rod and cone photoreceptor cells1-4. Rod photoreceptors are responsible for vision in dim light, cones in bright light. Phototransduction takes place in the outer segment of the photoreceptor cell, a specialized compartment that contains a high concentration of visual pigment, the primary light detector. The visual pigment is composed of a chromophore, 11-cis retinal, attached to a protein, opsin. A photon absorbed by the visual pigment isomerizes the chromophore from 11-cis to all-trans. This photoisomerization brings about a conformational change in the visual pigment that 
initiates a cascade of reactions culminating in a change in membrane potential, and bringing about the transduction of the light stimulus to an electrical signal. The 
recovery of the cell from light stimulation involves the deactivation of the intermediates activated by light, and the reestablishment of the membrane potential. Ca2+ modulates the activity of several of the enzymes involved in phototransduction, and its concentration is reduced upon light stimulation. In this way, Ca2+ plays an important role in the recovery of the cell from light stimulation and its adaptation to background light.
Another essential part of the recovery process is the regeneration of the visual pigment that has been destroyed during light-detection by the 
photoisomerization of its 11-cis chromophore to all-trans5-7. This regeneration begins with the release of all-trans retinal by 
the photoactivated pigment, leaving behind the apo-protein opsin. The released all-trans retinal is rapidly reduced in a reaction utilizing NADPH to all-
trans retinol, and opsin combines with fresh 11-cis retinal brought into the outer segment to reform the visual pigment. All-trans retinol is 
then transferred out of the outer segment and into neighboring cells by the specialized carrier Interphotoreceptor Retinoid Binding Protein (IRBP).
Fluorescence imaging of single photoreceptor cells can be used to study their physiology and cell biology. Ca2+-sensitive fluorescent dyes can be used to examine in detail the interplay between outer 
segment Ca2+ changes and response to light8-12 as well as the role of inner segment Ca2+ stores in Ca2+ homeostasis13,14. 
Fluorescent dyes can also be used for measuring Mg2+ concentration15, pH, and as tracers of aqueous and membrane compartments16. 
Finally, the intrinsic fluorescence of all-trans retinol (vitamin A) can be used to monitor the kinetics of its formation and removal in single 
photoreceptor cells17-19.

A method is described for the preparation of single living photoreceptor cells from different vertebrate species for fluorescence imaging. The method can be used to image the fluorescence of endogenous fluorophores, such as NADH or vitamin A, or that of exogenously added fluorescent dyes sensitive to Ca2+ or other factors.

إعداد يعيشون معزولين خلايا مستقبلة للضوء الفقارية للتصوير الإسفار

In the vertebrate retina, phototransduction, the conversion of light to an electrical signal, is carried out by the rod and cone photoreceptor cells1-4.  ...

Patch-clamp Capacitance Measurements and Ca2+ Imaging at Single Nerve Terminals in Retinal Slices

Visual stimuli are detected and conveyed over a wide dynamic range of light intensities and frequency changes by specialized neurons in the vertebrate retina. Two classes of retinal neurons, photoreceptors and bipolar cells, accomplish this by using ribbon-type active zones, which enable sustained and high-throughput neurotransmitter release over long time periods. ON-type mixed bipolar cell (Mb) terminals in the goldfish retina, which depolarize to light stimuli and receive mixed rod and cone photoreceptor input, are suitable for the study of ribbon-type synapses both due to their large size (~10-12 &mu;m diameter) and to their numerous lateral and reciprocal synaptic connections with amacrine cell dendrites. Direct access to Mb bipolar cell terminals in goldfish retinal slices with the patch-clamp technique allows the measurement of presynaptic Ca2+ currents, membrane capacitance changes, and reciprocal synaptic feedback inhibition mediated by GABAA and GABAC receptors expressed on the terminals. Presynaptic membrane capacitance measurements of exocytosis allow one to study the short-term plasticity of excitatory neurotransmitter release 14,15. In addition, short-term and long-term plasticity of inhibitory neurotransmitter release from amacrine cells can also be investigated by recordings of reciprocal feedback inhibition arriving at the Mb terminal 21. Over short periods of time (e.g. ~10 s), GABAergic reciprocal feedback inhibition from amacrine cells undergoes paired-pulse depression via GABA vesicle pool depletion 11. The synaptic dynamics of retinal microcircuits in the inner plexiform layer of the retina can thus be directly studied.
The brain-slice technique was introduced more than 40 years ago but is still very useful for the investigation of the electrical properties of neurons, both at the single cell soma, single dendrite or axon, and microcircuit synaptic level 19. Tissues that are too small to be glued directly onto the slicing chamber are often first embedded in agar (or placed onto a filter paper) and then sliced 20, 23, 18, 9. In this video, we employ the pre-embedding agar technique using goldfish retina. Some of the giant bipolar cell terminals in our slices of goldfish retina are axotomized (axon-cut) during the slicing procedure. This allows us to isolate single presynaptic nerve terminal inputs, because recording from axotomized terminals excludes the signals from the soma-dendritic compartment. Alternatively, one can also record from intact Mb bipolar cells, by recording from terminals attached to axons that have not been cut during the slicing procedure. Overall, use of this experimental protocol will aid in studies of retinal synaptic physiology, microcircuit functional analysis, and synaptic transmission at ribbon synapses.

Patch-clamp Capacitance Measurements and Ca2+ Imaging at Single Nerve Terminals in Retinal Slices

Here we describe a protocol for the preparation of agar-embedded retinal slices that are suitable for electrophysiology and Ca2+ imaging. This method allows one to study ribbon-type synapses in retinal microcircuits using direct patch-clamp recordings of single presynaptic nerve terminals.

التصحيح ، المشبك قياسات السعة والكالسيوم 2 + التصوير في محطات عصب واحد في شرائح الشبكية

Visual stimuli are detected and conveyed over a wide dynamic range of light intensities and frequency changes by specialized neurons in the vertebrate ...

Visualization of Proprioceptors in Drosophila Larvae and Pupae

Proprioception is the ability to sense the motion, or position, of body parts by responding to stimuli arising within the body. In fruitflies and other insects proprioception is provided by specialized sensory organs termed chordotonal organs (ChOs) 2. Like many other organs in Drosophila, ChOs develop twice during the life cycle of the fly. First, the larval ChOs develop during embryogenesis. Then, the adult ChOs start to develop in the larval imaginal discs and continue to differentiate during metamorphosis.
The development of larval ChOs during embryogenesis has been studied extensively 10,11,13,15,16. The centerpiece of each ChO is a sensory unit composed of a neuron and a scolopale cell. The sensory unit is stretched between two types of accessory cells that attach to the cuticle via specialized epidermal attachment cells 1,9,14. When a fly larva moves, the relative displacement of the epidermal attachment cells leads to stretching of the sensory unit and consequent opening of specific transient receptor potential vanilloid (TRPV) channels at the outer segment of the dendrite 8,12. The elicited signal is then transferred to the locomotor central pattern generator circuit in the central nervous system.
Multiple ChOs have been described in the adult fly 7. These are located near the joints of the adult fly appendages (legs, wings and halters) and in the thorax and abdomen. In addition, several hundreds of ChOs collectively form the Johnston's organ in the adult antenna that transduce acoustic to mechanical energy 3,5,17,4.
In contrast to the extensive knowledge about the development of ChOs in embryonic stages, very little is known about the morphology of these organs during larval stages. Moreover, with the exception of femoral ChOs 18 and Johnston's organ, our knowledge about the development and structure of ChOs in the adult fly is very fragmentary.
Here we describe a method for staining and visualizing ChOs in third instar larvae and pupae. This method can be applied together with genetic tools to better characterize the morphology and understand the development of the various ChOs in the fly.

Visualization of Proprioceptors in Drosophila Larvae and Pupae

A method to immunostain and visualize chordotonal organs in larvae and pupae of Drosophila melanogaster is described.

تصور في Proprioceptors<em&gt; ذبابة الفاكهة</em&gt; يرقات وشرانق

Proprioception is the ability to sense the motion, or position, of body parts by responding to stimuli arising within the body. In fruitflies and other ...

Deep Brain Stimulation with Simultaneous fMRI in Rodents

In order to visualize the global and downstream neuronal responses to deep brain stimulation (DBS) at various targets, we have developed a protocol for using blood oxygen level dependent (BOLD) functional magnetic resonance imaging (fMRI) to image rodents with simultaneous DBS. DBS fMRI presents a number of technical challenges, including accuracy of electrode implantation, MR artifacts created by the electrode, choice of anesthesia and paralytic to minimize any neuronal effects while simultaneously eliminating animal motion, and maintenance of physiological parameters, deviation from which can confound the BOLD signal.&#160;Our laboratory has developed a set of procedures that are capable of overcoming most of these possible issues. For electrical stimulation, a homemade tungsten bipolar microelectrode is used, inserted stereotactically at the stimulation site in the anesthetized subject. In preparation for imaging, rodents are fixed on a plastic headpiece and transferred to the magnet bore. For sedation and paralysis during scanning, a cocktail of dexmedetomidine and pancuronium is continuously infused, along with a minimal dose of isoflurane; this preparation minimizes the BOLD ceiling effect of volatile anesthetics. In this example experiment, stimulation of the subthalamic nucleus (STN) produces BOLD responses which are observed primarily in ipsilateral cortical regions, centered in motor cortex. Simultaneous DBS and fMRI allows the unambiguous modulation of neural circuits dependent on stimulation location and stimulation parameters, and permits observation of neuronal modulations free of regional bias. This technique may be used to explore the downstream effects of modulating neural circuitry at nearly any brain region, with implications for both experimental and clinical DBS.

This protocol describes a standard method for simultaneous functional magnetic resonance imaging and deep brain stimulation in the rodent. The combined use of these experimental tools allows for the exploration of global downstream activity in response to electrical stimulation at virtually any brain target.

تحفيز الدماغ العميق مع الرنين المغناطيسي الوظيفي في وقت واحد في القوارض

In order to visualize the global and downstream neuronal responses to deep brain stimulation (DBS) at various targets, we have developed a protocol for ...

In vivo Imaging of Optic Nerve Fiber Integrity by Contrast-Enhanced MRI in Mice

The rodent visual system encompasses retinal ganglion cells and their axons that form the optic nerve to enter thalamic and midbrain centers, and postsynaptic projections to the visual cortex. Based on its distinct anatomical structure and convenient accessibility, it has become the favored structure for studies on neuronal survival, axonal regeneration, and synaptic plasticity. Recent advancements in MR imaging have enabled the in vivo visualization of the retino-tectal part of this projection using manganese mediated contrast enhancement (MEMRI). Here, we present a MEMRI protocol for illustration of the visual projection in mice, by which resolutions of (200 &#181;m)3 can be achieved using common 3 Tesla scanners. We demonstrate how intravitreal injection of a single dosage of 15 nmol MnCl2 leads to a saturated enhancement of the intact projection within 24 hr. With exception of the retina, changes in signal intensity are independent of coincided visual stimulation or physiological aging. We further apply this technique to longitudinally monitor axonal degeneration in response to acute optic nerve injury, a paradigm by which Mn2+ transport completely arrests at the lesion site. Conversely, active Mn2+ transport is quantitatively proportionate to the viability, number, and electrical activity of axon fibers. For such an analysis, we exemplify Mn2+ transport kinetics along the visual path in a transgenic mouse model (NF-&#954;B p50KO) displaying spontaneous atrophy of sensory, including visual, projections. In these mice, MEMRI indicates reduced but not delayed Mn2+ transport as compared to wild type mice, thus revealing signs of structural and/or functional impairments by NF-&#954;B mutations.
In summary, MEMRI conveniently bridges in vivo assays and post mortem histology for the characterization of nerve fiber integrity and activity. It is highly useful for longitudinal studies on axonal degeneration and regeneration, and investigations of mutant mice for genuine or inducible phenotypes.

In vivo Imaging of Optic Nerve Fiber Integrity by Contrast-Enhanced MRI in Mice

This video illustrates a method, using a clinical 3 T scanner, for contrast-enhanced MR imaging of the na&#239;ve mouse visual projection and for repetitive and longitudinal in vivo studies of optic nerve degeneration associated with acute optic nerve crush injury and chronic optic nerve degeneration in knock-out mice (p50KO).

في الجسم الحي التصوير من الألياف البصرية النزاهة العصب عن طريق التصوير بالرنين المغناطيسي تعزيز التباين في الفئران

The rodent visual system encompasses retinal ganglion cells and their axons that form the optic nerve to enter thalamic and midbrain centers, and ...

Imaging Ca2+ Dynamics in Cone Photoreceptor Axon Terminals of the Mouse Retina

Retinal cone photoreceptors (cones) serve daylight vision and are the basis of color discrimination. They are subject to degeneration, often leading to blindness in many retinal diseases. Calcium (Ca2+), a key second messenger in photoreceptor signaling and metabolism, has been proposed to be indirectly linked with photoreceptor degeneration in various animal models. Systematically studying these aspects of cone physiology and pathophysiology has been hampered by the difficulties of electrically recording from these small cells, in particular in the mouse where the retina is dominated by rod photoreceptors. To circumvent this issue, we established a two-photon Ca2+ imaging protocol using a transgenic mouse line that expresses the genetically encoded Ca2+ biosensor TN-XL exclusively in cones and can be crossbred with mouse models for photoreceptor degeneration. The protocol described here involves preparing vertical sections (&#8220;slices&#8221;) of retinas from mice and optical imaging of light stimulus-evoked changes in cone Ca2+ level. The protocol also allows &#8220;in-slice measurement&#8221; of absolute Ca2+ concentrations; as the recordings can be followed by calibration. This protocol enables studies into functional cone properties and is expected to contribute to the understanding of cone Ca2+ signaling as well as the potential involvement of Ca2+ in photoreceptor death and retinal degeneration.

Imaging Ca2+ Dynamics in Cone Photoreceptor Axon Terminals of the Mouse Retina

We describe a protocol to monitor Ca2+ dynamics in the axon terminals of cone photoreceptors using an ex-vivo&#160;slice preparation of the mouse retina. This protocol allows comprehensive studies of cone Ca2+ signaling in an important mammalian model system, the mouse.

التصوير كاليفورنيا<sup&gt; 2+</sup&gt; حيوية في محطات المخروط مبصرة أكسون من شبكية العين الفأر

Retinal cone photoreceptors (cones) serve daylight vision and are the basis of color discrimination. They are subject to degeneration, often leading to ...

Optical Monitoring of Living Nerve Terminal Labeling in Hair Follicle Lanceolate Endings of the Ex Vivo Mouse Ear Skin

A novel dissection and recording technique is described for optical monitoring staining and de-staining of lanceolate terminals surrounding hair follicles in the skin of the mouse pinna. The preparation is simple and relatively fast, reliably yielding extensive regions of multiple labeled units of living nerve terminals to study uptake and release of styryl pyridinium dyes extensively used in studies of vesicle recycling. Subdividing the preparations before labeling allows test vs. control comparisons in the same ear from a single individual. Helpful tips are given for improving the quality of the preparation, the labeling and the imaging parameters. This new system is suitable for assaying pharmacologically and mechanically-induced uptake and release of these vital dyes in lanceolate terminals in both wild-type and genetically modified animals. Examples of modulatory influences on labeling intensity are given.

Optical Monitoring of Living Nerve Terminal Labeling in Hair Follicle Lanceolate Endings of the Ex Vivo Mouse Ear Skin

Here we describe a novel preparation for imaging live lanceolate sensory terminals of palisade endings that innervate mouse ear skin hair follicles during staining and destaining with styryl pyridinium dyes.

رصد بصري الأعصاب الطرفية المعيشة وصفها في الشعر المسام سناني الشكل النهايات لل<em&gt; فيفو السابقين</em&gt; ماوس الأذن الجلد

A novel dissection and recording technique is described for optical monitoring staining and de-staining of lanceolate terminals surrounding hair follicles ...

Quantification of Endosome and Lysosome Motilities in Cultured Neurons Using Fluorescent Probes

In the brain, membrane trafficking systems play important roles in regulating neuronal functions, such as neuronal morphology, synaptic plasticity, survival, and glial communications. To date, numerous studies have reported that defects in these systems cause various neuronal diseases. Thus, understanding the mechanisms underlying vesicle dynamics may provide influential clues that could aid in the treatment of several neuronal disorders. Here, we describe a method for quantifying vesicle motilities, such as motility distance and rate of movement, using a software plug-in for the ImageJ platform. To obtain images for quantification, we labeled neuronal endosome-lysosome structures with EGFP-tagged vesicle marker proteins and observed the movement of vesicles using a time-lapse microscopy. This method is highly useful and simplify measuring vesicle motility in neurites, such as axons and dendrites, as well as in the soma of both neurons and glial cells. Furthermore, this method can be applied to other cell lines, such as fibroblasts and endothelial cells. This approach could provide a valuable advancement of our understanding of membrane trafficking.

The investigation of membrane trafficking is crucial for understanding neuronal functions. Here, we introduce a method for quantifying vesicle motility in neurons. This is a convenient method that can be adapted to the quantification of membrane trafficking in the nervous system.

كمي من إندوسوم و ليسوسوم التحركات في الخلايا العصبية المستزرعة باستخدام تحقيقات الفلورسنت

In the brain, membrane trafficking systems play important roles in regulating neuronal functions, such as neuronal morphology, synaptic plasticity, ...

Visualization of Amyloid &#946; Deposits in the Human Brain with Matrix-assisted Laser Desorption/Ionization Imaging Mass Spectrometry

The neuropathology of Alzheimer&#39;s disease (AD) is characterized by the accumulation and aggregation of amyloid &#946; (A&#946;) peptides into extracellular plaques of the brain. The A&#946; peptides, composed of 40 amino acids, are generated from amyloid precursor proteins (APP) by &#946;- and &#947;-secretases. A&#946; is deposited not only in cerebral parenchyma but also in leptomeningeal and cerebral vessel walls, known as cerebral amyloid angiopathy (CAA). While a variety of A&#946; peptides were identified, the detailed production and distribution of individual A&#946; peptides in pathological tissues of AD and CAA have not been fully addressed. Here, we develop a protocol of matrix-assisted laser desorption/ionization-based imaging mass spectrometry (MALDI-IMS) on human autopsy brain tissues to obtain comprehensive protein mapping. For this purpose, human cortical specimens were obtained from the Brain Bank at the Tokyo Metropolitan Institute of Gerontology. Frozen cryosections are cut and transferred to indium-tin-oxide (ITO)-coated glass slides. Spectra are acquired using the MALDI system with a spatial resolution up to 20 &#181;m. Sinapinic acid (SA) is uniformly deposited on the slide using either an automatic or a manual sprayer. With the current technical advantages of MALDI-IMS, a typical data set of various A&#946; species within the same sections of human autopsied brains can be obtained without specific probes. Furthermore, high-resolution (20 &#181;m) imaging of an AD brain and severe CAA sample clearly shows that A&#946;1-36 to A&#946;1-41 were deposited into leptomeningeal vessels, while A&#946;1-42 and A&#946;1-43 were deposited in cerebral parenchyma as senile plaque (SP). It is feasible to adopt MALDI-IMS as a standard approach in combination with clinical, genetic, and pathological observations in understanding the pathology of AD, CAA, and other neurological diseases based on the current strategy.

Visualization of Amyloid &amp;#946; Deposits in the Human Brain with Matrix-assisted Laser Desorption/Ionization Imaging Mass Spectrometry

Molecular imaging with matrix-assisted laser desorption/ionization-based imaging mass spectrometry (MALDI-IMS) allows the simultaneous mapping of multiple analytes in biological samples. Here, we present a protocol for the detection and visualization of amyloid &#946; protein on brain tissues of Alzheimer&#39;s disease and cerebral amyloid angiopathy samples using MALDI-IMS.

التصور لرواسب بيتا اميلويد في الدماغ البشري مع الليزر ساعد مصفوفة الامتزاز/التأين التصوير الكتلي

The neuropathology of Alzheimer&#39;s disease (AD) is characterized by the accumulation and aggregation of amyloid &#946; (A&#946;) peptides into ...

Preparation of Newborn Rat Brain Tissue for Ultrastructural Morphometric Analysis of Synaptic Vesicle Distribution at Nerve Terminals

Our laboratory and many others have exploited the high resolving power of transmission electron microscopy to study the morphology and spatial organization of synaptic vesicles. In order to obtain high-quality electron micrographs that can yield the degree of morphological detail necessary for quantitative analysis of pre-synaptic vesicle distribution, optimal specimen preparation is critical. Chemical fixation is the first step in the process of specimen preparation, and of utmost importance to preserve fine ultrastructure. Vascular fixation with a glutaraldehyde-formaldehyde solution, followed by treatment of vibratome-sectioned specimens with osmium tetroxide, stabilizes the maximum number of molecules, especially proteins and lipids, and results in superior conservation of ultrastructure. Tissue is then processed with counterstaining, sequential dehydration and resin-embedding. En bloc staining with uranyl acetate (i.e., staining of vibratome-sectioned tissue before resin embedding) enhances endogenous contrast and stabilizes cell components against extraction during specimen processing. Contrast can be further increased by applying uranyl acetate as a post-stain on ultrathin sections. Double-staining of ultrathin sections with lead citrate after uranyl acetate treatment also improves image resolution, by intensifying electron-opacity of nucleic acid-containing structures through selective binding of lead to uranyl acetate. Transmission electron microscopy is a powerful tool for characterization of the morphological details of synaptic vesicles and quantification of their size and spatial organization in the terminal bouton. However, because it uses fixed tissue, transmission electron microscopy can only provide indirect information regarding living or evolving processes. Therefore, other techniques should be considered when the main objective is to study dynamic or functional aspects of synaptic vesicle trafficking and exocytosis.

We describe procedures for processing newborn rat brain tissue to obtain high-resolution electron micrographs for morphometric analysis of synaptic vesicle distribution at nerve terminals. The micrographs obtained with these methods can also be used to study the morphology of a number of other cellular components and their dimensional structural relationships.